一种真核细胞培养的激光共聚焦显微镜载液器件的制作方法

本发明涉及实验器件技术领域，具体为一种真核细胞培养的激光共聚焦显微镜载液器件。

背景技术：

激光共聚焦显微镜是由m.minsky于1955年在哈佛大学率先发明使用。经过几十年的改进后，激光共聚焦显微镜已成为科学研究的重要工具。与普通显微镜相比，激光共聚焦显微镜能够抑制模糊的图像，在不改变物镜的情况下得到最佳分辨率，进而实现光学切片的三维重建。可以进行局部的光操作，对多种被荧光染料标记的样本进行信息获取和构建。与普通显微镜相比具有定位准确、扫描速度快的优势。激光共聚焦显微镜在生物学、环境学、测量学、医学、材料学研究中具有重要地位。激光共聚焦显微镜在生物学研究领域中广泛运用于组织和细胞中的分子和结构的检测、测量细胞内离子浓度的变化、实现荧光相关数据的测量、长时间观察细胞迁移和生长、进行三维表面的测量及光谱的成像的研究。然而，激光共聚焦显微镜采用针孔成像及倒置式的观察方式，要求使用厚度极薄的玻璃片(通常盖玻片的厚度为0.13-0.17mm)作为样品载物装置。直接使用载玻片和盖玻片组合操作困难，且不可以直接培养真核细胞。而目前市场上激光共聚焦显微镜使用的细胞培养皿价格昂贵，无法高温灭菌只能一次性使用，且需要配置特殊的支架才能固定在物镜上方。鉴于目前并未有成熟的面向真核细胞培养的激光共聚焦显微镜载液器件，我们提出发明一种价格便宜，能够反复灭菌，适用于普通显微镜支架(如载玻片支架)的激光共聚焦显微镜细胞培养载液器件，这一发明具有很高的迫切性和市场价值。

激光共聚焦显微镜是基于传统光学显微镜的原理，再加装激光扫描装置，利用针孔阻断焦距外的光线以排除探测器聚焦外的光线，再利用光栅式扫描进行成像。在实际使用过程中，样品中的染料被激光激发，通过二色反射镜它聚焦在针孔(pinhole)上，通过针孔的光由光电倍增管来测量的。激光共聚焦显微镜结构包括用于光源、聚光器、检测器、光传输装置等。激光共聚焦显微镜需要将研究对象进行荧光标记，采用共轭聚焦的方式，逐点扫描观察样品，获得高分辨的共聚焦图像，通过控制z轴焦平面实现三维成像。

由于激光共聚焦显微镜采用针孔成像和倒置式观察的方式，要求观测物和镜头之间的距离非常短，因此对载物的玻片具有很高的厚度要求(可容忍的最大厚度约为0.17mm)。针对这种苛刻的观测要求，目前普遍有几种解决方案，能够在一定程度上实现观察的目的，但都具有一定的局限性。第一种方案是通过使用常规显微镜的盖玻片与载玻片组合来实现样品观测。具体方法是首先取待测样品加到载玻片上，然后在样品上方盖上盖玻片，进而将整个载玻片与盖玻片的组合翻转，最后将翻转得到的器件放在物镜上方进行观测。在这个过程中，翻转过快将导致待测样品搅动，翻转过慢则会导致待测样品溢出，影响了观测。同时由于盖玻片与载玻片之间的空间很小，不能放置较大样品，也不能进行细胞培养。另外溢出的待测样品若具有毒性，会对实验人员有潜在的健康风险。市面上通用的激光共聚焦显微镜细胞培养皿虽然可以实现细胞培养的目的且观测时不用翻转，但是仍具有一定的局限性。该培养皿由培养皿盖、带孔的培养皿体及盖玻片组成。培养皿底部使用特殊生物胶将厚度约为0.17mm的盖玻片与之粘合。这种培养皿的形状需要特殊的物镜载物台装置，与常用的载玻片载物台装置不匹配。并且此培养皿只能一次性使用，导致其使用价格昂贵(约10rmb一孔)。若能制备一种能反复灭菌且价格低廉的面向真核细胞培养的激光共聚焦显微镜载液器件，将会对激光共聚焦显微镜及其相关仪器(如在此基础上发明的激光共聚焦荧光相关谱仪)的推广，产生极大的推动作用。

针对目前激光共聚焦显微镜常用观测方案的短板，我们研发了一种能反复灭菌使用的激光共聚焦显微镜载液器件，并对其进行了制片、消毒、细胞培养、成像等实验。

技术实现要素：

本发明公开的目的在于提供一种可进行真核细胞培养的、能够用于常用的载玻片载物台的、成本低廉的、可重复使用的激光共聚焦显微镜载液器件，用以解决上述背景技术中提出的问题。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种真核细胞培养的激光共聚焦显微镜载液器件，其特征在于：包括下载体、上载体、密封垫、螺栓、载物玻片和分离式上盖；所述下载体的表面中央处开设有贯穿的大圆孔，所述下载体的表面左右两侧对称开设有贯穿的小圆孔，所述下载体顶部设有载物玻片，所述载物玻片盖合在所述下载体中间的大圆孔顶部，所述载物玻片顶部设有密封垫，所述密封垫的表面中央处开设有贯穿的大圆孔，与所述下载体两侧的小圆孔同一位置处的所述密封垫的表面左右两侧对称开设有贯穿的小圆孔，所述密封垫顶部设有上载体，所述上载体的表面中央处开设有贯穿的大圆孔，与所述密封垫两侧的小圆孔同一位置处的所述上载体左右两侧对称开设有贯穿的小圆孔，所述小圆孔内设有与螺栓相匹配的螺纹，所述上载体的大圆孔顶部盖设有分离式上盖，两根螺栓依次穿过所述下载体和所述密封垫，并固定在所述上载体的小圆孔内，所述载物玻片被固定夹在所述下载体和所述密封垫之间。

通过螺栓可将上载器、密封垫、载物玻片、下载器限位固定，不易出现载物玻片碎裂的情况，螺栓又可以将器件快速拆卸。

进一步地，所述密封垫材质为硅胶。

载物玻片上覆盖的密封垫对载物玻片和上载器进行贴合密封，避免液体外漏。

进一步地，所述上载体和所述下载体材质均为透明玻璃，所述透明玻璃为高强度的耐高温和耐高压的玻璃。

上载器、下载器均使用高强度的玻璃材质，在使用过程中不易出现弯曲、变形的情况。

高强度的玻璃材质能够承受高温高压，可进入灭菌锅中进行灭菌操作，反复使用，不但降低环境处理压力，而且减少使用成本。

进一步地，所述大圆孔过其圆心将所述下载体断成两截。

进一步地，所述密封垫的长度为76mm，宽度为26mm，厚度为0.1mm。

进一步地，载物玻片的长度为22mm，宽度为22mm，厚度为0.17mm。

进一步地，所述下载体的长度为76mm，宽度为26mm，厚度为2mm。

进一步地，所述上载体的长度为76mm，宽度为26mm，厚度为10mm。

进一步地，所述大圆孔的直径为20mm，所述小圆孔的直径为10mm。

进一步地，所述分离式上盖的长度为50mm，宽度为24mm，厚度为0.17mm。

与现有技术相比，本发明具备以下有益效果：

1、可进行真核细胞培养，能够用于常用显微镜载物台。

2、上载器、下载器均使用强度较高的玻璃材质，在使用过程中不易出现弯曲、变形。

3、通过螺栓螺将上载器、密封垫、载物玻片、下载器限位固定，不易出现载物玻片碎裂。

4、载物玻片上覆盖的密封垫对载物玻片和上载器进行贴合密封，避免液体外漏。

5、上载器、下载器所使用的玻璃材质能够承受高温高压，且装置拆卸方便，拆卸后可进入灭菌锅中进行灭菌操作，反复使用，不但降低环境处理压力，而且减少使用成本。

附图说明

图1为本发明的整体主视图；

图2为本发明的整体俯视图；

图3为本发明的整体侧视图；

图4为本发明的3d拆解图；

图5(a)为本发明进入灭菌锅进行高温高压灭菌前的图像；

图5(b)为本发明经灭菌锅高温高压灭菌后的图像；

图5(c)为本发明经灭菌锅高温高压灭菌后加载细胞悬液后的图像；

图6(a)为本发明经过0h培养的细胞的显微镜图像；

图6(b)为本发明经过12h培养的细胞的显微镜图像；

图6(c)为本发明经过24h培养的细胞的显微镜图像；

图6(d)为本发明经过36h培养的细胞的显微镜图像；

图7为使用hoechst染色剂对细胞染色后荧光显微镜下的图像；

图8为使用pi染色剂对细胞染色后荧光显微镜下的图像；

图9(a)为使用激光共聚焦显微镜20倍物镜对染色后的hela细胞进行观察得出的蓝色荧光细胞图像；

图9(b)为使用激光共聚焦显微镜20倍物镜对染色后的hela细胞进行观察得出的为红色荧光细胞图像；

图9(c)为使用激光共聚焦显微镜20倍物镜对染色后的hela细胞进行观察得出的红蓝色荧光合成细胞图像；

图10(a)为使用激光共聚焦显微镜40倍物镜对染色后的hela细胞进行观察得出的蓝色荧光细胞图像；

图10(b)为使用激光共聚焦显微镜40倍物镜对染色后的hela细胞进行观察得出的红色荧光细胞图像；

图10(c)为使用激光共聚焦显微镜40倍物镜对染色后的hela细胞进行观察得出的红蓝色荧光合成细胞图像；

其中，1-下载器、2-上载器、3-密封垫、4-螺栓、5-载物玻片、

6-分离式上盖、7-大圆孔，8-小圆孔。

具体实施方式

下面结合附图及实施例描述本发明具体实施方式：

需要说明的是，本说明书所附图中示意的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。

同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。

参见图1-图4，图1-图4介绍了本发明的整个结构，包括下载体1、上载体2、密封垫3、螺栓4、载物玻片5和分离式上盖6；所述下载体1的表面中央处开设有贯穿的大圆孔7，所述下载体1的表面左右两侧对称开设有贯穿的小圆孔8，所述下载体1顶部设有载物玻片5，所述载物玻片5盖合在所述下载体1中间的大圆孔7顶部，所述载物玻片5顶部设有密封垫3，所述密封垫3的表面中央处开设有贯穿的大圆孔7，与所述下载体1两侧的小圆孔8同一位置处的所述密封垫3的表面左右两侧对称开设有贯穿的小圆孔8，所述密封垫3顶部设有上载体2，所述上载体2的表面中央处开设有贯穿的大圆孔7，与所述密封垫3两侧的小圆孔8同一位置处的所述上载体2左右两侧对称开设有贯穿的小圆孔8，所述小圆孔8内设有与螺栓4相匹配的螺纹，所述上载体2的大圆孔7顶部盖设有分离式上盖6，两根螺栓4依次穿过所述下载体1和所述密封垫3，并固定在所述上载体2的小圆孔8内，所述载物玻片5被固定夹在所述下载体1和所述密封垫3之间。

具体而言，所述密封垫3材质为硅胶。

具体而言，所述上载体2和所述下载体1材质均为透明玻璃。

具体而言，所述大圆孔7过其圆心将所述下载体1断成两截。

具体而言，所述密封垫3的长度为76mm，宽度为26mm，厚度为0.1mm。

具体而言，载物玻片5的长度为22mm，宽度为22mm，厚度为0.17mm。

具体而言，所述下载体1的长度为76mm，宽度为26mm，厚度为2mm。

具体而言，所述上载体2的长度为76mm，宽度为26mm，厚度为10mm。

具体而言，所述大圆孔7的直径为20mm，所述小圆孔8的直径为10mm。

具体而言，所述分离式上盖6的长度为50mm，宽度为24mm，厚度为0.17mm。

实验1：验证发明可承受高温高压灭菌的可行性

为了验证本发明可承受高温高压灭菌的可行性，本实验使用灭菌锅对本发明进行高温高压(121℃，0.1mpa，30分钟)灭菌，并观察灭菌前后发明的变化。图5(a)为发明进入灭菌锅进行高温高压灭菌前的图像，灭菌前下载体1、上载器2、载物玻片5、螺丝4、螺纹6均无变形、碎裂。图5(b)为发明经灭菌锅高温高压灭菌后的图像，灭菌后下载器1、上载器2、载物玻片5、螺丝4、螺纹6均无变形、碎裂，发明整体无明显变化。由此可见，本发明可承受灭菌锅高温高压灭菌。图5(c)为发明经灭菌锅高温高压灭菌后加载细胞悬液后的照片，发明可以完美承载细胞悬液不漏液，并且分离式上盖可以进一步防止落尘和细胞培养期间过量液体蒸发。

实验2：验证使用显微镜观察培养于本发明中的细胞的可行性

为了验证本发明培养并使用显微镜观察细胞的可行性，本实验将hela细胞培养于添加了10％的胎牛血清(fbs)、1％双抗(100u/ml青霉素、100ug/ml链霉素)的90％dmem高糖培养基内，并将细胞悬液放置在高温灭菌后本发明载液装置的上载器和载物玻片围成的空腔内，盖上分离式上盖防止水分蒸发，放置在37℃，5％co2，加湿的培养箱中，分别培养0h、12h、24h和36h之后使用显微镜观察细胞，参见图6(a)、图6(b)、图6(c)和图6(d)。图6(a)为本发明中经过0h培养的细胞未完全沉降至载物玻片上，仍有部分细胞悬浮在液体培养基中，使用显微镜可以清晰地看到已沉降至载物玻片上的细胞呈圆形，密度较低；图6(b)为本发明中经过12h培养的细胞已沉降至载物玻片上贴壁生长，正常贴壁发育的hela细胞呈梭形；图6(c)为本发明中经过24h培养的细胞逐渐增殖，可以观察到细胞密度有明显增大；图6(d)为本发明中经过36h培养的细胞进一步增殖，可以观察到细胞密度进一步增大，逐渐贴满载物玻片，发育增殖状况良好。

由此可见，细胞可在本发明中添加液体培养基进行培养，生长状态正常，并可使用显微镜对本发明器件中培养的细胞进行实时观察，边观测边培养，得到细胞图像。

实验3：验证使用荧光显微镜观察培养于本发明中经染色的细胞的可行性

本产品不但可以用于激光共聚焦显微镜观测也可用于普通显微镜(包括荧光显微镜)观测。为了验证使用荧光显微镜观察培养于本发明中经染色后的细胞的可行性，本实验使用hoechst染色剂(1mg/ml)与碘化丙啶(propidiumiodide，pi)染色剂(1mg/ml)给培养的hela细胞染色。细胞发生凋亡时，染色质会固缩。hoechst33342可以穿透细胞膜，染色后凋亡细胞荧光会比正常细胞明显增强。碘化丙啶(pi)不能穿透细胞膜，对于具有完整细胞膜的正常细胞或凋亡细胞不能染色。而对于坏死细胞，其细胞膜的完整性丧失，碘化丙啶(pi)可以染色坏死细胞。染色完成后使用荧光显微镜对细胞进行观察，使用hoechst染色剂对细胞进行染色后的全部细胞细胞核呈蓝色参见图7，图7为使用hoechst染色剂对细胞染色后荧光显微镜下的图像，其中蓝色标记所有细胞的细胞核。使用pi染色剂对细胞进行染色后的死细胞细胞核呈红色参见图8。图8为使用pi染色剂对细胞染色后荧光显微镜下的图像，其中红色标记死细胞的细胞核。

以上数据表明，可以使用染色剂对培养在本发明中的细胞进行染色，并使用荧光显微镜对细胞进行观察，得到染色后的细胞图像。

实验4：验证使用激光共聚焦显微镜对培养在本发明中的细胞进行观察的可行性

为了得到高分辨的观察图像，在使用激光共聚焦显微镜观察细胞时，一般要求载物玻片的厚度在0.13～0.17mm，本发明中使用的载物玻片厚度为0.17mm，满足使用激光共聚焦显微镜对载物玻片的厚度要求。为了验证使用激光共聚焦显微镜对培养在本发明中的细胞进行观察的可行性，本实验将hela细胞培养于添加了10％的胎牛血清(fbs)、1％双抗(100u/ml青霉素、100ug/ml链霉素)的90％dmem高糖培养基内，并培养于经高温灭菌的本发明器件中，并放置在37℃，5％co2，加湿的培养箱中培养12h，待细胞完全沉降至载物玻片上贴壁后，使用双氧水对细胞进行处理，再使用hoechst33342、pi染色剂对hela细胞进行染色。染色完成后，使用激光共聚焦显微镜20倍物镜对细胞进行观察，得到染色后的细胞图像参见图9(a)、图9(b)和图9(c)，图9(a)经hoechst染色剂染色后的所有hela细胞细胞核呈蓝色，数量较多，并均匀分布在视野内；图9(b)为经pi染色剂染色的hela死细胞细胞核呈红色，数量较少；图9(c)为将红场图像与蓝场图像进行重叠处理后得到红蓝场图像。

使用激光共聚焦显微镜40倍物镜(油镜)对同一组染色后的hela细胞进行观察，得到的细胞图像参见图10(a)、图10(b)和图10(c)，图10(a)为经hoechst染色剂染色后的所有hela细胞细胞核呈蓝色，相较于20倍物镜视野内观察到的细胞核数量，40倍物镜视野内细胞核数量更少，单个细胞更大；图10(b)为经pi染色剂染色的hela死细胞细胞核呈红色；图10(c)为将红场图像与蓝场图像进行重叠处理后得到红蓝场图像。

以上数据表明可以使用激光共聚焦显微镜不同倍率下的普通物镜、油镜对培养于本发明中原位培养并经染色后的细胞进行观察，并得到清晰的蓝色、红色荧光的细胞图像。

本发明提供了一种价格便宜，能够反复灭菌，适用于普通显微镜支架(如载玻片支架)的面向真核细胞培养的激光共聚焦显微镜载液器件。相较于传统激光共聚焦显微镜培养皿的无法重复使用、成本高、不能培养细胞等缺点，本发明的耐高温高压、材质坚固耐用、可重复使用、可培养细胞、可使用各种显微镜的不同倍率和不同种类物镜(普通物镜、油镜)进行观察等的特点很好地解决了以上问题。本发明将普通盖玻片经过器件固定形成载液细胞培养观测器件，在各个实验室可轻松获得，每次使用仅需替换盖玻片，具有很高的实用性。

上面结合附图对本发明优选实施方式作了详细说明，但是本发明不限于上述实施方式，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。

不脱离本发明的构思和范围可以做出许多其他改变和改型。应当理解，本发明不限于特定的实施方式，本发明的范围由所附权利要求限定。