一种具有抑制肿瘤细胞增殖功能的多肽及应用的制作方法

本发明涉及生物医药
技术领域：
，特别是涉及一种具有抑制肿瘤细胞增殖功能的多肽及应用。
背景技术：
：传统的肿瘤治疗方法，多采用手术、射线或化学药物治疗手段，副作用大且容易复发，即使是新兴的肿瘤免疫疗法，仍然无法克服肿瘤治疗药物副作用大、易复发等缺点。寻找安全、有效的肿瘤靶向治疗药物是目前肿瘤治疗领域亟待解决的问题。多肽药物免疫原性低，易于合成改造，组织渗透性好，已经表现出在肿瘤、心血管、免疫疾病等疾病治疗方面有很好的应用前景。目前全球有80余种多肽药物上市，近200种正在开展临床前试验。多肽药物一般由几个到几十个天然或非天然氨基酸组成，能够通过天然产物提取、基因重组和化学合成等方式获得。除了直接用于治疗疾病，多肽药物还具有其他广泛的应用领域，比如作为药物载体输送药物，分子探针检测疾病，或作为小分子药物的模型，为开发靶向小分子药物提供结构基础。ku70蛋白由xrcc6(x-rayrepaircomplementingdefectiverepairinchinesehamstercells6)基因转录翻译而成，其与肿瘤的发生发展、浸润、转移关系密切。研究显示，ku70在交界性和恶性卵巢浆液性组织中的表达明显高于正常卵巢组织和卵巢囊腺瘤，在直肠癌组织中的表达明显高于直肠粘膜，在宫颈癌、胰腺癌等组织中ku70的表达明显高于正常组织，且其表达情况还与肺癌、前列腺癌等肿瘤预后相关。肿瘤分子遗传学的研究，更是提供大量ku70与胃癌、肝癌、儿童白血病等肿瘤易感性相关的证据，表明ku70可能参与肿瘤发生过程。ku70蛋白被研究得最为广泛的生物学功能，是其与ku80蛋白构成异构二聚体，参与dna双链断裂的修复。除了nhej依赖型生物学功能外，ku70还被发现有nhej非依赖型生物学功能：ku70可诱导肿瘤发生上皮细胞-间充质转化(emt)或促肿瘤细胞增殖，参与肿瘤的发生发展；ku70还可与bax蛋白结合，阻止bax诱导细胞凋亡。公开号为cn111333712a的发明公开了一种具有抑制肿瘤细胞增殖功能的ku70蛋白突变体、基因及应用。所述ku70蛋白突变体的氨基酸序列如seqidno.1所示。本发明利用ku70蛋白对肿瘤细胞增殖的影响，通过人工改造，构造了可以有效抑制肿瘤增殖的变异型ku70蛋白mu4。体外抗肿瘤活性检测和动物实验都表明，改造后的蛋白表现出良好的抗肿瘤增殖特性，可用于研究ku70参与肿瘤细胞增殖的作用机理，为开发抗肿瘤药物提供理论基础和模型。变异型ku70蛋白mu4对肺癌或宫颈癌细胞系的增殖抑制效果明显，而对肝癌、结肠癌细胞系及非癌细胞系没有明显的抑制效果。然而，该申请中mu4共572个氨基酸，整体分子量较大，有待进一步改进。技术实现要素：本发明针对现有技术中存在的技术问题，从ku70蛋白内分离出一段多肽，构建表达该多肽的表达质粒，可通过脂质体转染细胞的方式，在肿瘤细胞内过表达多肽，并抑制肿瘤细胞增殖，表明此多肽具有潜在的开发药物价值。一种具有抑制肿瘤细胞增殖功能的多肽，为ku70蛋白截短体，氨基酸序列如seqidno.1所示。该多肽为ku70蛋白的c端截短体，共包括c端的74个氨基酸。本发明又提供了所述多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。优选的，其中肿瘤为肺癌或宫颈癌。本发明又提供了编码所述多肽的基因。优选的，所述的基因，核苷酸序列如seqidno.2所示。本发明还提供了所述基因在制备抗肿瘤药物中的应用。优选的，其中肿瘤为肺癌或宫颈癌。优选的，该应用在实施时，将所述基因导入癌细胞内表达出所述多肽。本发明利用突变pcr的方法，从ku70蛋白内分离出可以有效抑制肿瘤增殖的多肽ku70-c。体外抗肿瘤活性检测表明，改造后的蛋白表现出良好的抗肿瘤增殖特性，可用于优化抗肿瘤多肽，为开发抗肿瘤药物提供模型。本发明多肽ku70-c只有74个氨基酸残基，分子量较小，免疫原性低、组织渗透性好。在医药领域具有一定的应用前景。附图说明图1为pbicep-cmv-3的质粒图谱。图2为在nci-h1975、a549、hela、hct-116细胞内，通过脂质体转染的方式，分别过表达野生型的ku70蛋白(pcmv-n-flag-ku70)、ku70c末端多肽(pcmv-n-flag-ku70-c)以及缺失c末端的变异型ku70蛋白(pcmv-n-flag-ku70-mu-c)，转染48h后，mtt方法检测各组细胞的增殖率。在nci-h1975、a549、hela内，过表达ku70-c多肽的细胞其增殖率明显低于转染其他两种质粒的细胞(图2.a-c)，在hct-116细胞内，转染三种不同质粒的细胞未发现其增殖率有明显差异(图2.d)。具体实施方式实施例1：靶向skp2的ku70-c多肽表达载体pbicep-n-flag-ku70-c克隆构建(1)pbicep-n-flag-ku70-c、pbicep-n-flag-ku70-mu-c表达载体的制备通过突变pcr方法，从野生型全长ku70表达载体pbicep-n-flag-ku70(详见公开号为cn111333712a的发明申请ku70蛋白的基因全序列genbank号为nm_001288977)扩增获得表达ku70-c多肽(氨基酸序列如seqidno.1所示，编码基因序列如seqidno.2所示)的pbicep-n-flag-ku70-c表达载体，以及对照载体pbicep-n-flag-ku70-mu-c，对照载体pbicep-n-flag-ku70-mu-c即表达缺失c末端的变异型ku70蛋白(缺失c末端的变异型ku70蛋白用ku70-mu-c表示，氨基酸序列如seqidno.3所示，编码基因序列如seqidno.4所示)。pbicep-n-flag-ku70-c、pbicep-n-flag-ku70-mu-c表达载体的制备的具体方法为：合成突变pcr引物，通过突变pcr方法，以pbicep-n-flag-ku70质粒为模板，扩增获得pbicep-n-flag-ku70-c、pbicep-n-flag-ku70-mu-c表达载体的dna，再通过转化大肠杆菌、挑选阳性克隆并测序验证的方法，获得pbicep-n-flag-ku70-c、pbicep-n-flag-ku70-mu-c表达载体的完整质粒，备用。突变pcr引物：ku70-c：上游引物：5'-aatcgatatctgcagaattcacgcgtcatgcctgaagggaaagttaccaagagaaaacac-3'；下游引物：5'-gtgttttctcttggtaactttcccttcaggcatgacgcgtgaattctgcagatatcgatt-3'。ku70-mu-c：上游引物：5'-aaggagcttgtttacccaccagattacaattgaggatcctctagatctgttaactccggg-3'；下游引物：5'-cccggagttaacagatctagaggatcctcaattgtaatctggtgggtaaacaagctcctt-3'。表1.突变pcr反应体系pbicep-n-flag-ku70载体500ng上游引物(10mm)1μl下游引物(10mm)1μlpfudnapolymerase1μlpfudnapolymerasereactionbuffer(10×)5μldntpmix(每种均为10mm)1μlsterilemilli-qwater加水至50μl。突变pcr反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸7min，共20个循环；72℃延伸10min；4℃保存。pcr产物纯化(采用biomega公司pcr产物纯化试剂盒，按照试剂盒说明书操作)：1.在pcr反应液中加入2倍体积的buffergc，混合均匀，瞬时离心，将溶液收集到底部。纯化小于200bp的片段，加入5倍体积的buffergc到1倍体积的pcr反应液。2.转移以上混合液至一个带有收集管的吸附柱中，室温下，13000g离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回到收集管中。重复步骤“2”，直至剩余的混合液全部通过吸附柱。3.加入650μldnawashbuffer至吸附柱中，室温下，13000g离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回到收集管中，重复步骤“3”。4.室温下，13000g，将吸附柱开盖离心2分钟，去除残留的乙醇。5.转移吸附柱至1.5ml收集管中，加入30μl60℃预热的ddh2o到吸附柱膜中央，室温放置1分钟，13000g离心1分钟。表2.dpnⅰ酶切体系pbicep-n-flag-ku70-c(或pbicep-n-flag-ku70-mu-c)载体1μgdpnⅰ酶1μlcutsmartbuffer(10×)5μlsterilemilli-qwater加水至50μl。酶切体系在37℃水浴锅内过夜酶切后，65℃灭活10min。转化大肠杆菌：将ku70-c多肽表达载体pbicep-n-flag-ku70-c以及对照载体pbicep-n-flag-ku70-mu-c转入感受态细胞dh5α并使其在大肠杆菌dh5α中得以保存和繁殖。方法：1.从-70℃冰箱中取2只感受态细胞悬液，置冰上解冻2.分别加入表达载体pbicep-n-flag-ku70-c以及对照载体pbicep-n-flag-ku70-mu-c各1ul，轻轻摇匀，冰上放置30分钟。3.42℃水浴中热击90秒，然后迅速置冰上2min。4.向管中加入800ullb液体培养基，混匀后37℃振荡培养(225rpm)1小时。5.将上述菌液摇匀后涂布于含amp的lb琼脂平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后，37℃倒置培养12-16小时。6.挑取平板上长出来的阳性菌落，在lb液体培养基中过夜培养(37℃振荡培养)，收集菌体，送至擎科测序公司进行测序验证。挑取测序结果正确的菌落，保存并提取质粒备用。实施例2：ku70-c多肽对肺癌细胞系a549、nci-h1975和宫颈癌细胞hela增殖抑制活性检测(1)培养肺癌细胞系a549、nci-h1975、宫颈癌细胞hela和结直肠癌细胞hct-116；细胞培养基为完全培养基为rpmi-1640培养基(a549、nci-h1975、hct-116)与完全mdem培养基(hela)。所述培养条件为：每种细胞以接种密度为每孔1×105个细胞，接种于96孔板中，培养温度37℃，培养至50％-60％汇合。(2)脂质体转染法向肺癌细胞系a549、nci-h1975、宫颈癌细胞hela和结直肠癌细胞hct-116分别转入pbicep-n-flag-ku70-c、pbicep-n-flag-ku70-mu-c及pbicep-n-flag-ku70质粒；a549、nci-h1975、hela和hct-116细胞在96孔板中培养至50％-60％汇合时进行脂质体转染。于转染48小时后采用mtt方法检测细胞增殖活率。脂质体转染采用的脂质体为invitrogen公司的lipofectamin3000。转染方法如下：1、稀释3000试剂：选取无菌1.5mlep管1支，使用5μlopti-mem培养基稀释0.2μl3000试剂，充分混匀，2、稀释待转染质粒：选取无菌1.5mlep管，分别使用5μlopti-mem培养基稀释0.1μgpbicep-n-flag-ku70-c、pbicep-n-flag-ku70-mu-c及pbicep-n-flag-ku70质粒，制备为dna预混液，然后各添加0.2μlp3000tm试剂，充分混匀。3、制备dna-脂质体复合物：在每管已稀释的3000试剂中按照1∶1比例加入稀释的dna。4、转染细胞：dna-脂质体复合物在室温孵育10-15分钟。每孔细胞内加入10μldna-脂质体复合物，在37℃二氧化碳培养箱培养细胞。(3)转染48小时后，mtt方法检测各细胞系的增殖抑制情况。转染后48小时进行mtt实验：每孔加mtt(5mg/ml)20μl，继续孵育4小时；吸弃上清，加二甲亚砜150μl，振荡5min，用酶标仪在490nm波长处测其吸光度值(od值)。通过mtt实验对细胞增殖情况检测，mtt底物可被活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶还原成蓝紫色产物，死细胞无此功能；活细胞越多，增殖活率越强，溶液颜色越深；据此推断细胞的增殖活率。结果如表3所示，转染表达ku70-c多肽的pbicep-n-flag-ku70-c的a549、nci-h1975、hela细胞增殖活力明显小于转染pbicep-n-flag-ku70-mu-c及pbicep-n-flag-ku70质粒的细胞，细胞增殖抑制率的计算公式如下：抑制率1＝((od490(ku70)-od490(ku70-c))/od490(ku70)×100％)，抑制率2＝((od490(ku70-mu-c)-od490(ku70-c))/od490(ku70-mu-c)×100％我们在肺癌细胞系a549、nci-h1975，宫颈癌细胞hela，结肠癌细胞系hct-116重复了实施例2的实验操作，以验证ku70-c多肽对其他肿瘤细胞增殖的抑制作用。结果如表3。表3.ku70-c多肽对a549、nci-h1975、hela、hct-116细胞的增殖抑制作用如表3所示，a549、nci-h1975、hela、hct-116细胞，分别转染入pbicep-n-flag-ku70-c、pbicep-n-flag-ku70-mu-c及pbicep-n-flag-ku70质粒，48h后mtt检测结果显示，转染不同质粒的细胞，其细胞活力有明显差异。过表达ku70-c多肽的a549细胞，od490平均值为1.18，小于过表达ku70蛋白的a549细胞(od490平均值为1.51)，差异有显著性(p<0.01)，而与过表达ku70-mu-c多肽的a549细胞(od490平均值为1.34)无显著性差异；转染48小时后，相对于过表达ku70的a549细胞，ku70-c多肽对a549细胞的增殖抑制率为22％。过表达ku70-c多肽的nci-h1975细胞，od490平均值为0.67，小于过表达ku70蛋白的nci-h1975细胞(od490平均值为0.85)，差异有显著性(p<0.01)，而与过表达ku70-mu-c多肽的nci-h1975细胞(od490平均值为0.86)无显著性差异；转染48小时后，相对于过表达ku70的nci-h1975细胞，ku70-c多肽对细胞增殖抑制率为21％。过表达ku70-c多肽的hela细胞，od490平均值为1.08，小于过表达ku70-c多肽的hela细胞(od490平均值为1.53)，差异有显著性(p<0.01)，而与过表达ku70-mu-c多肽的hela细胞(od490平均值为1.24)无显著性差异；转染48小时后，相对于过表达ku70的hela细胞，ku70-c多肽对细胞增殖抑制率为29％。说明ku70-c多肽对肺癌和宫颈癌细胞的增殖抑制较明显。而转染入pbicep-n-flag-ku70-c、pbicep-n-flag-ku70-mu-c及pbicep-n-flag-ku70质粒的结肠癌hct-116细胞，在转染48h后mtt检测结果显示，转染不同质粒的细胞，其细胞活力没有明显差别。表明过表达ku70-c多肽对结肠癌细胞的细胞增殖水平可能没有明显的抑制效果。综上，我们构建的ku70-c多肽表达载体pbicep-n-flag-ku70-c，对宫颈癌和肺癌细胞系的增殖抑制效果明显，对结肠癌细胞系hct-116细胞没有发现明显的抑制效果，表明ku70-c多肽对于肿瘤细胞增殖的抑制作用具有肿瘤特异性，目前发现对肺癌、宫颈癌的抑制作用较明显。序列表<110>杭州医学院<120>一种具有抑制肿瘤细胞增殖功能的多肽及应用<160>8<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>74<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>1progluglylysvalthrlysarglyshisaspasngluglysergly151015serlysargprolysvalglutyrsergluglugluleulysthrhis202530ileserlysglythrleuglylysphethrvalprometleulysglu354045alacysargalatyrglyleulysserglyleulyslysglngluleu505560leuglualaleuthrlyshispheglnasp6570<210>2<211>225<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2cctgaagggaaagttaccaagagaaaacacgataatgaaggttctggaagcaaaaggccc60aaggtggagtattcagaagaggagctgaagacccacatcagcaagggtacgctgggcaag120ttcactgtgcccatgctgaaagaggcctgccgggcttacgggctgaagagtgggctgaag180aagcaggagctgctggaagccctcaccaagcacttccaggactga225<210>3<211>535<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>3metserglytrpglusertyrtyrlysthrgluglyaspglugluala151015gluglugluglnglugluasnleuglualaserglyasptyrlystyr202530serglyargaspserleuilepheleuvalaspalaserlysalamet354045phegluserglnsergluaspgluleuthrpropheaspmetserile505560glncysileglnservaltyrileserlysileileserserasparg65707580aspleuleualavalvalphetyrglythrglulysasplysasnser859095valasnphelysasniletyrvalleuglngluleuaspasnprogly100105110alalysargileleugluleuaspglnphelysglyglnglnglygln115120125lysargpheglnaspmetmetglyhisglyserasptyrserleuser130135140gluvalleutrpvalcysalaasnleupheseraspvalglnphelys145150155160metserhislysargilemetleuphethrasngluaspasnprohis165170175glyasnaspseralalysalaserargalaargthrlysalaglyasp180185190leuargaspthrglyilepheleuaspleumethisleulyslyspro195200205glyglypheaspileserleuphetyrargaspileileserileala210215220gluaspgluaspleuargvalhispheglugluserserlysleuglu225230235240aspleuleuarglysvalargalalysgluthrarglysargalaleu245250255serargleulysleulysleuasnlysaspilevalileservalgly260265270iletyrasnleuvalglnlysalaleulysproproproilelysleu275280285tyrarggluthrasngluprovallysthrlysthrargthrpheasn290295300thrserthrglyglyleuleuleuproseraspthrlysargsergln305310315320iletyrglyserargglnileileleuglulysglugluthrgluglu325330335leulysargpheaspaspproglyleumetleumetglyphelyspro340345350leuvalleuleulyslyshishistyrleuargproserleupheval355360365tyrproglugluserleuvalileglyserserthrleupheserala370375380leuleuilelyscysleuglulysgluvalalaalaleucysargtyr385390395400thrproargargasnileproprotyrphevalalaleuvalprogln405410415gluglugluleuaspaspglnlysileglnvalthrproproglyphe420425430glnleuvalpheleuprophealaaspasplysarglysmetprophe435440445thrglulysilemetalathrprogluglnvalglylysmetlysala450455460ilevalglulysleuargphethrtyrargseraspserphegluasn465470475480provalleuglnglnhispheargasnleuglualaleualaleuasp485490495leumetgluprogluglnalavalaspleuthrleuprolysvalglu500505510alametasnlysargleuglyserleuvalaspgluphelysgluleu515520525valtyrproproasptyrasn530535<210>4<211>1605<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4atgtcagggtgggagtcatattacaaaaccgagggcgatgaagaagcagaggaagaacaa60gaagagaaccttgaagcaagtggagactataaatattcaggaagagatagtttgattttt120ttggttgatgcctccaaggctatgtttgaatctcagagtgaagatgagttgacacctttt180gacatgagcatccagtgtatccaaagtgtgtacatcagtaagatcataagcagtgatcga240gatctcttggctgtggtgttctatggtaccgagaaagacaaaaattcagtgaattttaaa300aatatttacgtcttacaggagctggataatccaggtgcaaaacgaattctagagcttgac360cagtttaaggggcagcagggacaaaaacgtttccaagacatgatgggccacggatctgac420tactcactcagtgaagtgctgtgggtctgtgccaacctctttagtgatgtccaattcaag480atgagtcataagaggatcatgctgttcaccaatgaagacaacccccatggcaatgacagt540gccaaagccagccgggccaggaccaaagccggtgatctccgagatacaggcatcttcctt600gacttgatgcacctgaagaaacctgggggctttgacatatccttgttctacagagatatc660atcagcatagcagaggatgaggacctcagggttcactttgaggaatccagcaagctagaa720gacctgttgcggaaggttcgcgccaaggagaccaggaagcgagcactcagcaggttaaag780ctgaagctcaacaaagatata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