一种高产鞘脂类微生物菌株、它的筛选方法和它的用途与流程

1.本技术涉及微生物工程技术领域，具体涉及一种威克汉姆西弗酵母菌(wickerhamomyces ciferrii)，其保藏号为cgmcc no:19562，此外还涉及它的筛选方法，以及它的用于生产四乙酰基植物鞘氨醇(taps)的用途。


背景技术：

2.鞘脂类(sphingolipids)是指以长链碱基(long-chainbase)为主干的脂类(lipids)，包括游离神经醇类、神经酰胺类、鞘磷脂类、鞘糖脂类四种类型。鞘脂类主要存在于动物、植物和微生物细胞的膜中，其不仅是生物膜的重要组成部分，而且在活细胞中还发挥着许多重要的作用。此外，鞘脂类是人体皮肤上角质层的主要成分，与胆固醇、硫酸胆固醇和游离脂肪酸组成特定的层状准晶结构，是皮肤的渗透屏障(menon et al.(2012))。因此，它们在抗菌、抗真菌药物、治疗学活性药物成分以及药妆或营养制剂活性成分等诸多应用领域具有很高的应用潜力。
3.目前，用于化妆品中的鞘脂类制品主要从动物、植物中提取。显然，在工业水平上这是一种成本很高的方法。化学合成法由于步骤繁琐，副产物较多，合成效率较低等缺点，难以实现工业化生产。
4.菌株h.ciferri nrrl y-1031是由ciferri分离，lodder(1932年)描述的，并由bedford(1942)和wickerham(1951)观察到了这种菌株的丝状形态。根据wickerham(1958)和burton(1954)的方法，可以从该菌株的子囊酵母中获得子囊孢子分离株，并确定子囊孢子分离物的性别。1956年，培养h.ciferri nrrl y-1031交配型11号菌株，首次发现大量的晶体——四乙酰基植物鞘氨醇，这是一种以前从未从自然来源报道过的化合物(wickerham和stodola，1960)。
5.此外，在酵母产朊假丝酵母(candida utills)和酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)(wangner and zofcsik,1966；oda and kamiya,1958)、hansenlaspora valbyensis(braun and snell，1967)、真菌萨氏曲霉(aspergillus sydowi)和点青霉(penicillium notatum)(stodola and wickerham，1960)中也显示出植物鞘氨醇和/或其乙酰化衍生物的产生。
6.不同于所有已知的生物，wickerhamomyces ciferrii(即h.ciferri nrrl y-1031，又称pichhia ciferrii)具有产生完全乙酰化鞘氨醇类碱(特别是植物鞘氨醇类)并大量分泌它们的能力(wickerham and stodola 1960)。使得这种非传统酵母成为了生物技术生产鞘脂类的适宜宿主。早在1962年就开始使用w.ciferrii交配型菌株f-60-10发酵，产量可多达233mg(taps)/l，每克葡萄糖可产生5毫克taps(maister等，1962年)。
7.近年来，利用发酵工艺优化及诱变技术优化taps产量的尝试取得的较大的进展，获得了可进行工业水平发酵生产的菌株及工艺。专利wo94/10131a1(pct/gb93/02230，1994年)公开了以pichia ciferri nrrl y-1031交配型菌株f-60-10为优选菌株，在30℃下，添加乙醇和甲醇作为诱导剂，以丝氨酸和棕榈酰为前体，以甘油为碳源，以吐温和曲通为表面
活性剂进行的分批补料发酵，最高产量可达2083mg taps/l发酵液。专利ep0688871a2公开了一种利用wickerhamomyces ciferrii交配型菌株f-60-10制备四乙酰植物鞘氨醇的方法，对该菌株进行诱变，并通过特定的筛选程序获得高产菌株，优化培养基配方及发酵工艺，taps产量在1.0g/l以上。专利w09512683a1(pct/ep94/03652)提供了一种通过诱变和选择技术(以wickerhamomyces ciferrii nrrl y-1031f-60-10为出发菌株)生产能够产生更高水平的鞘氨醇、二氢鞘氨醇、植物鞘氨醇或其衍生物的微生物菌株。与在相同条件下培养的亲本菌株相比，筛选获得的突变株的产量水平比亲本菌株高40％-60％。
8.2001年，专利us6194196b1通过分析wickerham及其同事的早期研究(wickerham和stodola，1960)推断二倍体毕赤酵母减数分裂过程中的遗传重组形成交配型孢子的过程中，可以产生一种全新的交配型毕赤酵母菌株，其taps产量高于交配型f-60-10菌株。基于此，该专利开发出一种高产菌株的筛选方法，最终筛选出了一株产量较高的菌株(kccm-10131)，通过发酵优化，其最高taps产量可达14g/l。然而，无论是该专利报道的交配型筛选方法还是wickerham及其同事等所采用的交配型菌株筛选方法，都存在帽形孢子获得效率较低的问题(该专利帽形孢子形成效率6％～8％)、导致交配型菌株筛选难度过大，实际操作过程中，难以获得可培养的交配型菌株，或者所获菌株数量较少，难以从中筛选出高产菌株。
9.基于以上的研究成果，我们猜测，在二倍体wickerhamomyces ciferrii减数分裂形成子囊孢子的过程中，遗传物质的重组及错配会导致出现成千上万种不同的孢子(理论上会出现无数种孢子)，其中，可能会有taps产量远高于交配型f-60-10以及kccm-10131的菌株。因此，我们采用一种全新的产孢子培养基(wccb培养基)，将二倍体菌株wickerhamomyces ciferrii的孢子产率提高到50.0％～75.0％，同时优化了孢子的富集及交配型菌株的验证方法。


技术实现要素：

10.1.一种威克汉姆西弗酵母菌(wickerhamomyces ciferrii)，其保藏号为cgmcc no:19562。
11.2.如项1所述的酵母菌，其中，该酵母菌在批式摇瓶培养条件下可产生至少700mg四乙酰基植物鞘氨醇(taps)/l发酵液。
12.3.如项2所述的酵母菌，其中，所述批式摇瓶培养条件为在装有ym培养基的三角瓶中、适当的转速和温度下培养至少72h；其中所述ym培养基包括葡萄糖8.0～16.0g/l，蛋白胨3.0～7.0g/l，酵母提取物2.0～4.0g/l，麦芽提取物1.5～4.5g/l。
13.4.如项1所述的酵母菌，其中，该酵母菌在分批补料培养的条件下可产生至少21.0g taps/l发酵液。
14.5.如项4所述的酵母菌，其中，所述分批补料培养的条件为：培养基包括酵母浸粉3.5～8.5g/l，l-丝氨酸3.5～8.5g/l，甘油15.0～70.0g/l，蛋白胨1.5～5.5g/l，kh2po
4 2.0～7.5g/l，麦芽提取物1.5～5.5g/l，mgso4·
7h2o 1.2～5.4g/l，(nh4)2po
4 1.5～8.5g/l，kcl 0.2～2.4g/l，cacl
2 0.3～2.6g/l；在适当的发酵温度和搅拌转速下将溶氧控制在20％以上；分批补料方式：在碳源耗尽时进行补料操作，以6～30ml/l发酵液/h的补料速度补入30％～70％(w/w)的碳源，直至5天后发酵结束。
15.6.一种组合物，其包括威克汉姆西弗酵母菌(wickerhamomyces ciferrii)和发酵液，所述发酵液包含四乙酰基植物鞘氨醇(taps)。
16.7.如项6所述的组合物，其中taps在所述发酵液中的浓度为700mg/l以上，所述发酵液由批式摇瓶培养获得。
17.8.如项7所述的组合物，所述批式摇瓶培养的培养条件为在装有ym培养基的三角瓶中、在适当的转速和温度下培养至少72h；其中所述ym培养基包括葡萄糖8.0～16.0g/l，蛋白胨3.0～7.0g/l，酵母提取物2.0～4.0g/l，麦芽提取物1.5～4.5g/l。
18.9.如项6所述的组合物，其中taps在所述发酵液中的浓度为21.0g/l以上，所述发酵液由分批补料培养获得。
19.10.如项9所述的组合物，所述分批补料培养的培养条件为：培养基包括酵母浸粉3.5～8.5g/l，l-丝氨酸3.5～8.5g/l，甘油15.0～70.0g/l，蛋白胨1.5～5.5g/l，kh2po
4 2.0～7.5g/l，麦芽提取物1.5～5.5g/l，mgso4·
7h2o 1.2～5.4g/l，(nh4)2po
4 1.5～8.5g/l，kcl 0.2～2.4g/l，cacl
2 0.3～2.6g/l；在适当发酵温度和搅拌转速下把溶氧控制在20％以上；分批补料方式：在碳源耗尽时进行补料操作，以6～30ml/l发酵液/h的补料速度补入30％～70％(w/w)的碳源，直至5天后发酵结束。
20.11.一种培养基，其包括：酵母浸粉3.5～8.5g/l，l-丝氨酸3.5～8.5g/l，甘油15.0～70.0g/l，蛋白胨1.5～5.5g/l，kh2po
4 2.0～7.5g/l，麦芽提取物1.5～5.5g/l，mgso4·
7h2o 1.2～5.4g/l，(nh4)2po
4 1.5～8.5g/l，kcl 0.2～2.4g/l，cacl
2 0.3～2.6g/l。
21.12.一种威克汉姆西弗酵母菌(wickerhamomyces ciferrii)的筛选方法，其包含以下步骤：
[0022]-对能产生四乙酰基植物鞘氨醇的亲代威克汉姆西弗酵母菌使用诱导培养基诱导出子囊孢子，孢子产率为50.0％～75.0％；
[0023]-分离出交配型菌株；
[0024]-通过批式摇瓶培养实验从所述交配型菌株筛选出高产四乙酰基植物鞘氨醇的菌株。
[0025]
13.如项12所述的筛选方法，其中，所述诱导培养基是wccb培养基，其包括：醋酸钠6.3～10.5g/l，氯化钾11.7～23.6g/l，硫酸镁0.09～0.34g/l，葡萄糖0.43～1.76g/l，琼脂粉12.0～20.0g/l。
[0026]
14.如项13所述的筛选方法，其中，所述wccb培养基包括：醋酸钠7.3～9.5g/l，氯化钾13.7～21.6g/l，硫酸镁0.14～0.30g/l，葡萄糖0.63～1.46g/l，琼脂粉14.0～18.0g/l。
[0027]
15.如项13或14所述的筛选方法，其中，在诱导出子囊孢子的步骤中，使用下述诱导培养条件：23～29℃条件下有氧培养3～7天。
[0028]
16.如项12所述的筛选方法，其中在分离出交配型菌株步骤进行下述：
[0029]-将子囊孢子制成菌悬液；
[0030]-加入终浓度为0.5％～5.0％的蜗牛酶/zymolyase/细胞裂解液及一定量的直径为0.1～0.8mm的石英砂/玻璃珠，在25℃～35℃下100～320rpm摇床震荡0.5～6.0小时，破开子囊孢子壁，释放出其中的孢子；
[0031]-将破壁处理后的孢子液加入到无菌离心管中，于48℃～60℃水浴10～50min，灭
活其中的二倍营养体，富集孢子。
[0032]
17.如项16所述的筛选方法，其中在分离出交配型菌株步骤中进行下述：
[0033]-将子囊孢子制成菌悬液；
[0034]-加入终浓度为1.0％～4.0％蜗牛酶/zymolyase/细胞裂解液及一定量的径为0.2～0.6mm的石英砂/玻璃珠，在28℃～33℃下150～260rpm摇床震荡1.0～4.0小时，破开子囊孢子壁，释放出其中的孢子；
[0035]-将破壁处理后的孢子液加入到无菌离心管中，于50℃～58℃水浴15～40min，灭活其中的二倍营养体，富集孢子。
[0036]
18.一种培养基，其包括：醋酸钠6.3～10.5g/l，氯化钾11.7～23.6g/l，硫酸镁0.09～0.34g/l，葡萄糖0.43～1.76g/l，琼脂粉12.0～20.0g/l。
[0037]
19.使用如项1所述威克汉姆西弗酵母菌(wickerhamomyces ciferrii)通过发酵培养生产四乙酰基植物鞘氨醇(taps)的方法。
[0038]
20.如项19所述的使用威克汉姆西弗酵母菌(wickerhamomyces ciferrii)通过发酵培养生产四乙酰基植物鞘氨醇(taps)的方法，其中，所述发酵培养是批式摇瓶培养；可以产生至少700mg/l的taps发酵液。
[0039]
21.如项20所述的使用威克汉姆西弗酵母菌(wickerhamomyces ciferrii)通过发酵培养生产四乙酰基植物鞘氨醇(taps)的方法，其中，所述批式摇瓶培养的生产条件是：在装有ym培养基的三角瓶中、适当的转速和温度下培养至少72h；其中所述ym培养基包括葡萄糖8.0～16.0g/l，蛋白胨3.0～7.0g/l，酵母提取物2.0～4.0g/l，麦芽提取物1.5～4.5g/l。
[0040]
22.如项19所述的使用威克汉姆西弗酵母菌(wickerhamomyces ciferrii)通过发酵培养生产四乙酰基植物鞘氨醇(taps)的方法，其中，所述发酵培养是分批补料培养；可以产生至少21.0g/l的taps发酵液。
[0041]
23.如项22所述的使用威克汉姆西弗酵母菌(wickerhamomyces ciferrii)通过发酵培养生产四乙酰基植物鞘氨醇(taps)的方法，其中，所述分批补料培养的生产条件为：培养基包括酵母浸粉3.5～8.5g/l，l-丝氨酸3.5～8.5g/l，甘油15.0～70.0g/l，蛋白胨1.5～5.5g/l，kh2po
4 2.0～7.5g/l，麦芽提取物1.5～5.5g/l，mgso4·
7h2o 1.2～5.4g/l，(nh4)2po
4 1.5～8.5g/l，kcl 0.2～2.4g/l，cacl
2 0.3～2.6g/l；在适当的发酵温度和搅拌转速下将溶氧控制在20％以上；分批补料方式：在碳源耗尽时进行补料操作，以6～30ml/l发酵液/h的补料速度补入30％～70％(w/w)的碳源，直至5天后发酵结束。
[0042]
本技术的技术方案取得的有益效果：
[0043]
申请人通过采用一种全新的产孢子培养基(wccb培养基)将二倍体菌株wickerhamomyces ciferrii的孢子产率提高到50.0％～75.0％，同时优化了孢子的富集及交配型菌株的验证方法。还对获得的交配型菌株进行了不同层次的筛选(获得的交配型菌株首先在平皿上初步筛选，其中的产结晶菌株进行初步的摇瓶培养筛选，产量较高的菌株最终进行发酵验证)获得了高产株。
附图说明
[0044]
图1为诱导出能产生taps的亲代威克汉姆西弗酵母菌的子囊孢子的显微照片；
[0045]
图2为威克汉姆西弗酵母菌(wickerhamomyces ciferrii)在不同孢子培养基上的
孢子产率；其中，mcclary培养基配方为：葡萄糖1.00g/l，氯化钾1.80g/l，醋酸钠8.20g/l，酵母膏2.50g/l，琼脂粉1.50g/l；ma5培养基配方为：麦芽提取物：50.00g/l，琼脂粉1.50g/l；kleyn培养基配方为：蛋白胨2.50g/l，葡萄糖0.62g/l，氯化钠0.62g/l，醋酸钠5.00g/l，琼脂粉1.50g/l；fowell培养基配方为：醋酸钠8.20g/l，棉子糖0.40g/l，琼脂粉1.50g/l；
[0046]
图3为高产菌株cgmcc no:19562发酵液老化后镜检照片；
[0047]
图4为发酵产物的hplc检测结果，其中a为发酵提取产物，b为taps标准品(sigma)；
[0048]
图5为高产菌株cgmcc no:19562的发酵过程生长曲线。
具体实施方式
[0049]
需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
[0050]
本技术在第一方面涉及一种酵母菌。
[0051]
在一个实施方式中，提供了一种威克汉姆西弗酵母菌(wickerhamomyces ciferrii)；该菌株于2020年4月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)；保藏号为cgmcc no:19562。
[0052]
在本说明书的上下文中，酵母符合生物学领域的一般定义，它是一种单细胞真菌，一种肉眼看不见的微小单细胞微生物，能将糖发酵成酒精和二氧化碳，分布于整个自然界，是一种典型的异养兼性厌氧微生物，在有氧和无氧条件下都能够存活，是一种天然发酵剂。
[0053]
在一个具体实施方式中，提供了一种酵母菌，其中，该酵母菌在ym培养基10％装液量的三角瓶中、220rpm、30℃下培养72h可产生至少700mg四乙酰基植物鞘氨醇(taps)/l发酵液；而在分批补料发酵培养5天后能够产生至少21.0gtaps/l发酵液。
[0054]
在本说明书的上下文中，“鞘脂类”符合生物化学领域的一般定义，鞘脂类(sphingolipids)是指以长链碱基(long-chainbase)为主干的脂类(lipids)，包括游离神经醇类、神经酰胺类、鞘磷脂类、鞘糖脂类四种类型。鞘脂主要存在于动物、植物和微生物细胞的膜中，其不仅是生物膜的重要组成部分，而且在活细胞中还发挥着许多重要的作用。此外，鞘脂类是人体皮肤上角质层的主要成分，与胆固醇、硫酸胆固醇和游离脂肪酸组成特定的层状准晶结构，是皮肤的渗透屏障(menon et al.(2012))。
[0055]
在本说明书的上下文中，“四乙酰基植物鞘氨醇(taps)”是“鞘脂类”的下位概念，其英文名称为tetraacetylphytosphingosine，是一种非离子型表面活性剂(属于酯类)，其可用作调理剂等，应用于个人护理用品领域。具有良好的防老、抗皱、美白、保湿、消除黑眼圈效果。与皮肤的相容性佳。
[0056]
在本说明书的上下文中，“分批补料发酵”是指补料分批发酵(又称“半连续发酵”或者“流加发酵”)，是指在微生物分批发酵过程中，以某种方式向发酵系统中补加一定物
料，但并不连续地向外放出发酵液的发酵技术，是介于分批发酵和连续发酵之间的一种发酵技术。
[0057]
本技术在第二方面涉及一种组合物。
[0058]
在一个具体实施方式中，提供了一种组合物，其包括威克汉姆西弗酵母菌(wickerhamomyces ciferrii)和发酵液，所述发酵液包含四乙酰基植物鞘氨醇(taps)，其中在批式摇瓶培养条件下taps在所述发酵液中的浓度为至少700mg/l，在分批补料培养的条件下该浓度在至少21.0g/l。
[0059]
在此，在分批补料培养时所使用的培养基包括：酵母浸粉3.5～8.5g/l，l-丝氨酸3.5～8.5g/l，甘油15.0～70.0g/l，蛋白胨1.5～5.5g/l，kh2po
4 2.0～7.5g/l，麦芽提取物1.5～5.5g/l，mgso4·
7h2o 1.2～5.4g/l，(nh4)2po
4 1.5～8.5g/l，kcl 0.2～2.4g/l，cacl
2 0.3～2.6g/l。
[0060]
本技术在第三方面涉及一种酵母菌筛选方法。
[0061]
在一个具体实施方式中，提供了一种威克汉姆西弗酵母菌(wickerhamomyces ciferrii)的筛选方法，其包含以下步骤：
[0062]-诱导出能产生taps的亲代威克汉姆西弗酵母菌的子囊孢子，诱导出的孢子产率为50.0％～75.0％；
[0063]-分离出交配型菌株。
[0064]
在本说明书的上下文中，“子囊孢子(ascospore)”指产生在子囊菌子囊内的孢子。在即将形成孢子之前，子囊内进行核融合和减数分裂，子囊中产生1-8个孢子，或为2的n次方，典型的子囊中有8个孢子。此8个孢子是在减数分裂后再通过一次有丝分裂产生，减数分裂使双倍体的细胞核分裂为四个单倍体的细胞核，这四个细胞核再各自有丝分裂形成八核，并为子囊中的分泌物所包覆，因此一个子囊通常有八个子囊孢子，但数目仍有例外，如冬虫夏草的子囊可有多达20-60枚子囊孢子，酵母菌的子囊通常只有1-4枚子囊孢子，块菌的子囊也通常只有四枚子囊孢子。形态一般为椭圆形，有的是针状态体或带有隔壁。在表面上可以看到纹、刺、网眼等。不同的特征，其颜色也各种各样：有的无色，有的淡黄色、淡红色、橙色、褐色及黑色等。孢子一般在子囊内排成一列，其中半数与其他半数各为不同的性属。
[0065]
在本说明书的上下文中，“诱导”特别指“真菌诱导产孢”。
[0066]
在一个具体实施方式中，在诱导步骤中，使用wccb培养基作为诱导培养基，其包括：醋酸钠6.3～10.5g/l，具体地可以为6.3g/l、6.5g/l、6.7g/l、6.9g/l、7.1g/l、7.3g/l、7.5g/l、7.6g/l、7.7g/l、7.9g/l、8.1g/l、8.3g/l、8.5g/l、8.7g/l、8.9g/l、9.1g/l、9.3g/l、9.5g/l、9.7g/l、9.9g/l、10.1g/l、10.3g/l、10.5g/l；氯化钾11.7～23.6g/l，具体地可以为11.7g/l、12.7g/l、13.7g/l、14.7g/l、15.7g/l、16.7g/l、17.4g/l、17.7g/l、18.7g/l、19.7g/l、20.7g/l、21.7g/l、22.7g/l、23.6g/l；硫酸镁0.09～0.34g/l，具体地可以为0.09g/l、0.14g/l、0.18g/l、0.24g/l、0.29g/l、0.34g/l；葡萄糖0.43～1.76g/l，具体地可以为0.43g/l、0.76g/l、0.9g/l、1.1g/l、1.43g/l、1.76g/l；琼脂粉12.0～20.0g/l，具体地可以为12g/l、13g/l、14g/l、15g/l、16g/l、17g/l、18g/l、19g/l、20g/l。进而，该培养基由下述组成：醋酸钠6.3～10.5g/l，氯化钾11.7～23.6g/l，硫酸镁0.09～0.34g/l，葡萄糖0.43～1.76g/l，琼脂粉12.0～20.0g/l。
[0067]
在一个具体实施方式中，在诱导步骤中，使用wccb培养基作为诱导培养基，其包括：醋酸钠7.3～9.5g/l，具体地可以为7.3g/l、7.5g/l、7.7g/l、7.9g/l、8.1g/l、8.3g/l、8.5g/l、8.7g/l、8.9g/l、9.1g/l、9.3g/l、9.5g/l；氯化钾13.7～21.6g/l，具体地可以为13.7g、14.7g、15.7g、16.7g、17.7g、18.7g、19.7g、20.7g、21.6g；硫酸镁0.14～0.30g/l，具体地可以为0.14g、0.19g、0.24g、0.30g；葡萄糖0.63～1.46g/l，具体地可以为0.63g/l、0.76g/l、1.1g/l、1.46g/l；琼脂粉14.0～18.0g/l，具体地可以为14g/l、15g/l、16g/l、17g/l、18g/l。
[0068]
在一个具体实施方式中，在诱导步骤中，使用下述诱导培养条件：23～29℃条件下有氧培养3～7天。具体地，可以在23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃或29℃下培养3天、4天、5天、6天或7天。
[0069]
在又一具体实施方式中，在分离步骤中进行下述：
[0070]-将子囊孢子制成菌悬液；
[0071]-加入终浓度为0.5％～5.0％的蜗牛酶/zymolyase/细胞裂解液及一定量的直径为0.1～0.8mm的石英砂/玻璃珠，具体地，直径可以为0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm；在25℃～35℃下100～320rpm摇床震荡0.5～6.0小时，具体地，温度可以为25℃、27℃、29℃、31℃、33℃、35℃；具体地，转速可以为100rpm、120rpm、140rpm、160rpm、180rpm、200rpm、220rpm、240rpm、260rpm、280rpm、300rpm、320rpm；具体地，时间可以为0.5小时、1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时、4.5小时、5小时、5.5小时、6小时；破开子囊孢子壁，释放出其中的孢子；
[0072]-将破壁处理后的孢子液加入到无菌离心管中，于48℃～60℃水浴10～50min，灭活其中的二倍营养体，富集孢子。
[0073]
在本说明书的上下文中，“二倍营养体”和“二倍体”可以互换使用，它们是指，由受精卵发育而来，且体细胞中含有两个染色体组的生物个体。
[0074]
本技术在第四方面涉及一种诱导产生子囊孢子的培养基。
[0075]
在一个具体实施方式中，提供了一种诱导产生子囊孢子的培养基，其为wccb培养基，具体包括：醋酸钠6.3～10.5g/l，氯化钾11.7～23.6g/l，硫酸镁0.09～0.34g/l，葡萄糖0.43～1.76g/l，琼脂粉12.0～20.0g/l。
[0076]
通过采用一种全新的产孢子培养基(wccb培养基)，本技术的技术方案将二倍体菌株wickerhamomyces ciferrii的孢子产率提高至高达62.74％的水平。一般地，使用此产孢子培养基，随着培养条件的适度调整，孢子产率可以达到50.0％～75.0％水平。
[0077]
本技术在第五方面涉及使用酵母菌发酵生产taps的方法。
[0078]
在一个具体实施方式中，提供了威克汉姆西弗酵母菌(wickerhamomyces ciferrii)摇瓶发酵生产四乙酰基植物鞘氨醇(taps)的方法，其中，在ym培养基10％装液量的三角瓶中、220rpm、30℃下培养72h，以产生至少700mg taps/l发酵液。
[0079]
在又一具体实施方式中，提供了威克汉姆西弗酵母菌(wickerhamomyces ciferrii)分批补料发酵方法，培养基包括：酵母浸粉3.5～8.5g/l，l-丝氨酸3.5～8.5g/l，甘油15.0～70.0g/l，蛋白胨1.5～5.5g/l，kh2po
4 2.0～7.5g/l，麦芽提取物1.5～5.5g/l，mgso4·
7h2o 1.2～5.4g/l，(nh4)2po
4 1.5～8.5g/l，kcl 0.2～2.4g/l，cacl
2 0.3～2.6g/l；发酵温度为25～33℃；搅拌转速为300～900rpm，溶氧控制在20％以上；分批补料方式：在
碳源(甘油)耗尽时(溶氧回升)进行补料操作，以6～30ml/l(发酵液)/h的补料速度补入30％～70％(w/w)的甘油，直至发酵结束)生产四乙酰基植物鞘氨醇(taps)的方法，其中，培养5天时能产生至少21.0g taps/l发酵液。进而，分批补料培养基由下述组成：酵母浸粉3.5～8.5g/l，l-丝氨酸3.5～8.5g/l，甘油15.0～70.0g/l，蛋白胨1.5～5.5g/l，kh2po
4 2.0～7.5g/l，麦芽提取物1.5～5.5g/l，mgso4·
7h2o 1.2～5.4g/l，(nh4)2po
4 1.5～8.5g/l，kcl 0.2～2.4g/l，cacl
2 0.3～2.6g/l。
[0080]
《实施例部分》
[0081]
下面将参照附图更详细地描述本发明的具体实施例。虽然附图中显示了本发明的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
[0082]
实施例1.交配型菌株的获取
[0083]
1.产孢子培养基的筛选：
[0084]
将初始菌株wickerhamomyces ciferrii接种到ym[葡萄糖10.0g/l，蛋白胨5.0g/l，酵母提取物3.0g/l，麦芽提取物3.0g/l]液体培养基(固体培养基添加琼脂粉15.0g/l，下同)摇瓶中，培养24h左右达到对数期，将培养液离心，收集菌泥，用无菌生理盐水清洗3遍；将清洗干净的菌泥分别涂布到mcclary、wccb[醋酸钠7.60g/l，氯化钾17.40g/l，硫酸镁0.18g/l，葡萄糖0.90g/l，琼脂粉15.0g/l]、ma5、kleyn及fowell培养基平皿上，25℃下培养7天，获得子囊孢子(如图1所示)。刮取各个产孢子平皿上的菌泥，稀释到一定的梯度在血球计数板上计数，统计出wickerhamomyces ciferrii在各培养基上的产孢率，具体结果如图2所示，其中，wccb培养基的产孢率为62.74％，远高于其它培养基，因此，后续筛选实验中所需的子囊孢子皆通过该培养基诱导；图1的内容为wickerhamomyces ciferrii在wccb培养基上产生的子囊孢子镜检照片；图2的内容为wickerhamomyces ciferrii菌株在不同产孢子培养基上的孢子产率。由图2的实验对比可以看出，使用本技术的wccb获得了最高的孢子产率。其中，mcclary、ma5、kleyn及fowell培养基的成分分别为：mcclary培养基成分：葡萄糖1.00g/l，氯化钾1.80g/l，醋酸钠8.20g/l，酵母膏2.50g/l，琼脂粉1.50g/l；ma5培养基成分：麦芽提取物：50.00g/l，琼脂粉1.50g/l；kleyn培养基成分：蛋白胨2.50g/l，葡萄糖0.62g/l，氯化钠0.62g/l，醋酸钠5.00g/l，琼脂粉1.50g/l；fowell培养基成分：醋酸钠8.20g/l，棉子糖0.40g/l，琼脂粉1.50g/l。
[0085]
2.子囊孢子的破壁：将子囊孢子制成菌悬液，加入终浓度为3.0％的蜗牛酶及20％石英砂(直径0.20mm)，30℃下220rpm摇床震荡4.0小时，释放出其中的孢子；
[0086]
3.孢子的富集：由于酵母孢子与二倍营养体相比，抗逆性较强，故将破壁处理后的孢子液(混有子囊孢子，二倍营养体)加入到无菌离心管中，于60℃水浴10分钟，灭活其中的二倍营养体，富集孢子。
[0087]
4.交配型菌株的挑选及验证：将水浴处理后的孢子液稀释到一定的浓度(涂布平皿后每个平皿长出10～200个单菌落为宜)，吸取少量体积稀释液，涂布到ym固体平皿上，25～33℃下培养3～7天左右，挑取菌落形态不同于wickerhamomyces ciferrii二倍体菌株的单菌落，转接到新的ym平皿上，30℃下静置培养；同时挑取少量菌泥转接到wccb培养基平皿上，22～27℃下静置培养，进行产孢子验证；产孢子验证步骤是为了筛选所挑取的单菌落是
否为交配型菌株，若是交配型菌株，则在wccb培养基平皿上无法产生子囊孢子，可用于进一步的产结晶筛选；若不是交配型菌株，在wccb培养基平皿上会产生大量子囊孢子，可基本确定为二倍体菌株，没必要再进行后续的产结晶筛选。
[0088]
实施例2.高产taps菌株cgmcc19562的筛选
[0089]
将前期筛选获得的交配型菌株通过划线等方式分离纯化出单菌落，然后将分离纯化后的交配型菌株分别接种到ym液体培养基摇瓶中，30℃、220rpm条件下，摇床培养3天，收集培养液，放入4℃冰箱中老化3天，400倍镜下镜检观察产结晶情况(所产结晶如图3所示)，结果如表1所示。图3为高产菌株发酵液老化后镜检照片。该高产菌株随后于2020年4月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏号为cgmcc no.19562。
[0090]
表1部分交配型产结晶情况统计
[0091][0092][0093]
注：
╳
表示无结晶；+表示少量结晶；++表示结晶量一般；+++表示结晶量较大；++++表示大量结晶，菌体表面有少量絮状沉淀；+++++表示大量结晶，菌体表面有大量絮状沉淀；评价方法：取样镜检、肉眼观察；
[0094]
对其中的部分结晶产量较高的菌株进行摇瓶发酵小试，将各菌株接入灭菌的ym液体培养基(葡萄糖12g/l、蛋白胨5g/l、酵母提取物3g/l、麦芽提取物3g/l)摇瓶中，30℃、220rpm条件下摇床培养3天，发酵液放入4℃冰箱中老化3天，然后提取、高效液相法(hplc)检测发酵产物中taps的含量(如图4所示)并计算发酵产率，具体结果如表2所示。其中，cgmcc19562的产量最高，可达713mg/l。图4为发酵产物的hplc检测结果，其中a为发酵提取
产物，b为taps标准品(sigma)。
[0095]
表2部分高产菌株摇瓶发酵taps产量
[0096]
菌株编号发酵产率mg/l20190925-2311cgmcc1956271320190925-2634320190925-3140120190925-42637
[0097]
实施例3摇瓶培养cgmcc19562生产taps的培养基优化(条件二)
[0098]
将cgmcc19562菌株接入灭菌的ym液体培养基(葡萄糖8g/l、蛋白胨3g/l、酵母提取物2g/l、麦芽提取物1.5g/l)摇瓶中，30℃、220rpm条件下摇床培养3天，发酵液放入4℃冰箱中老化3天，然后提取、高效液相法(hplc)检测发酵产物中taps的含量并计算发酵产率。最终所得的产率是702mg/l。
[0099]
实施例4摇瓶培养cgmcc19562生产taps的培养基优化(条件三)
[0100]
将cgmcc19562菌株接入灭菌的ym液体培养基(葡萄糖16g/l、蛋白胨7g/l、酵母提取物4g/l、麦芽提取物4.5g/l)摇瓶中，30℃、220rpm条件下摇床培养3天，发酵液放入4℃冰箱中老化3天，然后提取、高效液相法(hplc)检测发酵产物中taps的含量并计算发酵产率。最终所得的产率是705mg/l。
[0101]
对比例1摇瓶培养cgmcc19562生产taps的培养基优化(条件四)
[0102]
将cgmcc19562菌株接入灭菌的ym液体培养基(葡萄糖17g/l、蛋白胨8g/l、酵母提取物5g/l、麦芽提取物5.5g/l)摇瓶中，30℃、220rpm条件下摇床培养3天，发酵液放入4℃冰箱中老化3天，然后提取、高效液相法(hplc)检测发酵产物中taps的含量并计算发酵产率。最终所得的产率是692mg/l。
[0103]
对比例2摇瓶培养cgmcc19562生产taps的培养基优化(条件五)
[0104]
将cgmcc19562菌株接入灭菌的ym液体培养基(葡萄糖7g/l、蛋白胨2g/l、酵母提取物1.5g/l、麦芽提取物1g/l)摇瓶中，30℃、220rpm条件下摇床培养3天，发酵液放入4℃冰箱中老化3天，然后提取、高效液相法(hplc)检测发酵产物中taps的含量并计算发酵产率。最终所得的产率是687mg/l。
[0105]
表3摇瓶培养cgmcc19562生产taps的培养基优化
[0106][0107][0108]
结论：为达到设定技术目标(产生至少700mg四乙酰基植物鞘氨醇(taps)/l发酵液)，使用最优菌种cgmcc19562进行了摇瓶培养的培养基优化试验，得出的结论为：ym培养基的优选构成为：葡萄糖8.0～16.0g/l，蛋白胨3.0～7.0g/l，酵母提取物2.0～4.0g/l，麦
芽提取物1.5～4.5g/l。
[0109]
实施例5.高产菌株cgmcc19562的分批补料发酵培养
[0110]
1.菌种活化：取出一支高产菌株cgmcc19562，通过涂布或划线的方式转接到ym固体平皿上，30℃下静置培养5天，至平皿上长出大量菌苔。
[0111]
2.摇瓶种子制备：用接种针挑取少量菌泥接种到摇瓶种子培养基中，30℃、220rpm条件下培养，取样测种子液od
600
，当摇瓶种子od
600
达到10左右时，结束种子液培养，接种至发酵罐中培养。
[0112]
3.发酵培养：将种子液接种至发酵罐中进行发酵培养，发酵培养过程包括以下步骤：(1)发酵培养基的组成包括酵母浸粉5.5g/l，l-丝氨酸6.0g/l，甘油42.0g/l，蛋白胨3.5g/l，kh2po
4 5.5g/l，麦芽提取物4.0g/l，mgso4·
7h2o 2.4g/l，(nh4)2po
4 3.8g/l，kcl 1.7g/l，cacl
2 1.9g/l；(2)发酵温度为30℃，搅拌转速为600rpm，溶氧控制在20％以上，可通过调节转速及增大通气量，增加罐压等手段实现；(3)采用分批补料的发酵方式，在碳源(甘油)耗尽时(溶氧回升)进行补料操作，以10ml/l(发酵液)/h的补料速度补入50％(w/w)的甘油，直至5天后发酵结束。(4)发酵结束后，将发酵液转移到低温罐中保藏3天，待结晶基本分泌出胞外后用有机溶剂对产物进行提取纯化以及发酵产量的检测。具体生长曲线如图5所示，该批次发酵中，最终产量为22.14g(taps)/l(发酵液)，其产量随着发酵时间的推移不断增加；但发酵到84h以后，产量的增加速度开始变缓，这与菌体的积累及发酵生物量呈线性关系。
[0113]
实施例6分批补料培养cgmcc19562生产taps的培养基优化(条件二)
[0114]
使用高产菌株cgmcc19562通过分批补料培养方式进行taps生物合成；实施例6与实施例5的区别仅在于，所使用的培养条件是培养基使用酵母浸粉3.5g/l，l-丝氨酸3.5g/l，甘油15.0g/l，蛋白胨1.5g/l，kh2po
4 2.0g/l，麦芽提取物1.5g/l，mgso4·
7h2o 1.2g/l，(nh4)2po
4 1.5g/l，kcl 0.2g/l，cacl
2 0.3g/l；发酵温度为23℃；搅拌转速为280rpm，溶氧控制在20％以上；分批补料方式：在碳源(甘油)耗尽时(溶氧回升)进行补料操作，以6ml/l(发酵液)/h的补料速度补入30％(w/w)的甘油，直至发酵结束。在该批次发酵中，最终产量为21.11g(taps)/l(发酵液)。
[0115]
实施例7分批补料培养cgmcc19562生产taps的培养基优化(条件三)
[0116]
使用高产菌株cgmcc19562通过分批补料培养方式进行taps生物合成；实施例7与实施例5的区别仅在于，所使用的培养条件是培养基使用酵母浸粉8.5g/l，l-丝氨酸8.5g/l，甘油70.0g/l，蛋白胨5.5g/l，kh2po
4 7.5g/l，麦芽提取物5.5g/l，mgso4·
7h2o 5.4g/l，(nh4)2po48.5g/l，kcl 2.4g/l，cacl
2 2.6g/l；发酵温度为23℃；搅拌转速为280rpm，溶氧控制在20％以上；分批补料方式：在碳源(甘油)耗尽时(溶氧回升)进行补料操作，以30ml/l(发酵液)/h的补料速度补入70％(w/w)的甘油，直至发酵结束。在该批次发酵中，最终产量为21.78g(taps)/l(发酵液)。
[0117]
对比例3分批补料培养cgmcc19562生产taps的培养基优化(条件四)
[0118]
使用高产菌株cgmcc19562通过分批补料培养方式进行taps生物合成；对比例3与实施例5的区别仅在于，所使用的培养条件是培养基使用酵母浸粉3.4g/l，l-丝氨酸3.3g/l，甘油13.0g/l，蛋白胨1.3g/l，kh2po
4 1.9g/l，麦芽提取物1.3g/l，mgso4·
7h2o 1.1g/l，(nh4)2po41.3g/l，kcl 0.15g/l，cacl
2 0.25g/l；发酵温度为23℃；搅拌转速为280rpm，溶氧
控制在20％以上；分批补料方式：在碳源(甘油)耗尽时(溶氧回升)进行补料操作，以5ml/l(发酵液)/h的补料速度补入28％(w/w)的甘油，直至发酵结束。在该批次发酵中，最终产量为13.76g(taps)/l(发酵液)。
[0119]
对比例4分批补料培养cgmcc19562生产taps的培养基优化(条件五)
[0120]
使用高产菌株cgmcc19562通过分批补料培养方式进行taps生物合成；对比例4与实施例5的区别仅在于，所使用的培养条件是培养基使用酵母浸粉8.6g/l，l-丝氨酸8.6g/l，甘油71.0g/l，蛋白胨5.6g/l，kh2po
4 7.6g/l，麦芽提取物5.6g/l，mgso4·
7h2o 5.5g/l，(nh4)2po
4 8.6g/l，kcl 2.5g/l，cacl22.7g/l；发酵温度为35℃；搅拌转速为920rpm，溶氧控制在20％以上；分批补料方式：在碳源(甘油)耗尽时(溶氧回升)进行补料操作，以32ml/l(发酵液)/h的补料速度补入72％(w/w)的甘油，直至发酵结束。在该批次发酵中，最终产量为18.53g(taps)/l(发酵液)。
[0121]
表3分批补料培养cgmcc19562生产taps的培养基优化
[0122]
培养基方案发酵产率g/l实施例522.14实施例621.11实施例721.78对比例313.76对比例418.53
[0123]
结论：为达到设定技术目标(产生至少21g四乙酰基植物鞘氨醇(taps)/l发酵液)，使用最优菌种cgmcc19562进行了分批补料培养的培养基优化试验，得出的结论为：分批补料培养基的优选构成为：酵母浸粉3.5～8.5g/l，l-丝氨酸3.5～8.5g/l，甘油15.0～70.0g/l，蛋白胨1.5～5.5g/l，kh2po
4 2.0～7.5g/l，麦芽提取物1.5～5.5g/l，mgso4·
7h2o 1.2～5.4g/l，(nh4)2po
4 1.5～8.5g/l，kcl 0.2～2.4g/l，cacl
2 0.3～2.6g/l。
[0124]
对比例5使用次优选菌株、理想培养条件进行分批补料培养
[0125]
依实施例5的发酵培养条件通过分批补料培养方式进行taps生物合成；对比例5与实施例5的区别仅在于，所使用的菌株是来自于实施例2的、编号为20190925-42的次优选菌株。在该批次发酵中，最终产量为16.21g(taps)/l(发酵液)。
[0126]
尽管以上结合附图对本发明的实施方案进行了描述，但本发明并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本发明权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本发明保护之列。