一种防治太子参病害的假单胞菌以及分离筛选鉴定方法与应用

文档序号:26013671发布日期:2021-07-23 21:34阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种防治太子参病害的假单胞菌,其特征在于,所述假单胞菌为假单胞菌bbh16-1,保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc),保藏编号为cctccno:m2020971。

2.根据权利要求1所述的假单胞菌的分离筛选方法,其特征在于,所述方法具体为:

1)收集新鲜的太子参叶片和块根用水冲洗干净;

2)用灭菌的剪刀切成碎片置于研钵中;

3)按照0.5~1.5g叶片和块根组织加入10mlpbs溶液,超声15~25min后收集悬液,采用10倍体积比例依次稀释至10-2,得到含菌稀释液;

4)取10-2稀释浓度的100μl含菌稀释液涂布于pda平板上,每个处理三个重复;

5)25~30℃培养1~3d后,挑取表型差异的单菌落划线于lb培养基进行纯化培养;

6)鉴定分离的菌株假单胞菌;

7)采用平皿对峙培养法筛选假单胞菌;

镰刀菌、链格孢菌、富克葡萄孢盘菌、米根霉菌接种于pda培养基平板表面,20~30℃培养2~4d制备新鲜菌丝;

8)用1ml枪头打孔挑取新鲜镰刀菌、链格孢菌、富克葡萄孢盘菌、米根霉菌丝块,接种于pda平板中央,同时在其四周3cm处等距的四点分别接种培养20~28h的细菌菌液,以接菌大肠杆菌dh5α为阴性对照,每个处理重复三次;

9)所有处理于20~30℃下培养2~4d,即得假单胞菌:假单胞菌bbh16-1。

3.根据权利要求2所述的分离筛选方法,其特征在于,所述方法具体为:

1)收集新鲜的太子参叶片和块根用水冲洗干净;

2)用灭菌的剪刀切成碎片置于研钵中;

3)按照1g叶片和块根组织加入10mlpbs溶液,超声20min后收集悬液,采用10倍体积比例依次稀释至10-2,得到含菌稀释液;

4)取10-2稀释浓度的100μl含菌稀释液涂布于pda平板上,每个处理三个重复;

5)28℃培养2d后,挑取表型差异的单菌落划线于lb培养基进行纯化培养;

6)鉴定分离的菌株假单胞菌;

7)采用平皿对峙培养法筛选假单胞菌;

镰刀菌、链格孢菌、富克葡萄孢盘菌、米根霉菌接种于pda培养基平板表面,25℃培养3d制备新鲜菌丝;

8)用1ml枪头打孔挑取新鲜镰刀菌、链格孢菌、富克葡萄孢盘菌、米根霉菌丝块,接种于pda平板中央,同时在其四周3cm处等距的四点分别接种培养24h的细菌菌液,以接菌大肠杆菌dh5α为阴性对照,每个处理重复三次;

9)所有处理于25℃下培养3d,即得假单胞菌:假单胞菌bbh16-1。

4.根据权利要求2-3任一项所述的分离筛选方法,其特征在于,所述pda培养基的配方如下:马铃薯160~230g,葡萄糖15~25g,磷酸二氢钾0.5~2.1g,七水硫酸镁0.3~0.7g,琼脂10~20g。

5.根据权利要求4所述的分离筛选方法,其特征在于,所述pda培养基的配方如下:马铃薯200g,葡萄糖20g,磷酸二氢钾1.5g,七水硫酸镁0.5g,琼脂15g。

6.根据权利要求4或5所述的分离筛选方法,其特征在于,pda培养基如下:将马铃薯煮沸4~6min后用纱布过滤收集滤液,添加葡萄糖、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、琼脂,蒸馏水定容至0.5~1.5l。

7.根据权利要求2-3任一项所述的分离筛选方法,其特征在于,所述lb培养基的配方如下:胰蛋白胨5~15g,酵母提取物2~8g,氯化钠5~15g,琼脂10~20g,蒸馏水定容至0.5~1.5l。

8.根据权利要求1所述的假单胞菌的鉴定方法,其特征在于,所述鉴定方法包括形态学鉴定及生物学鉴定,具体如下:

1)形态学鉴定

将假单胞菌bbh16-1菌株接种到lb培养基培养48h后,可见lb培养基上菌落黄白色菌落,菌落圆形,边缘整齐透明。

2)分子生物学鉴定

将假单胞菌bbh16-1菌株于lb培养基培养48h后,采用ctab/nacl提取方法提取基因组dna,提取后先后用苯酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)和氯仿-异戊醇(24:1)抽提和无菌水溶解,利用特异性引物扩增v3v4rdna并测序,测序序列长度为408bp,序列编号为seqidno.1;

测序引物dna序列:

v3v4rdna(正向引物):ctacgggmsgcagcag;

v3v4rdna(反向引物):ggactachvgggtwtctaat;

在ncbi中genbank数据库中,将bbh16-1菌株的v3v4rdna序列采用blastn检索,鉴定。

9.一种如权利要求1所述的假单胞菌bbh16-1菌株在制备太子参病原菌拮抗剂中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于假单胞菌bbh16-1菌株在制备镰刀菌、链格孢菌、富克葡萄孢盘菌、米根霉菌、球毛壳菌、裂褶菌、鸡腿菇菌、黑外皮球菌、可可毛色二孢菌、微扁沃利雅炭皮菌拮抗剂中的应用。


技术总结
本发明涉及一种防治太子参病害的假单胞菌以及分离筛选鉴定方法与应用。本研究从太子参植株中分离得到了假单胞菌,具有较强的抗逆性,对人畜无毒无害,对环境友好。同时该菌对太子参的叶斑病、立枯病、根腐病、紫纹羽病等多种病原菌具有明显的抑制作用,可作为生防杀菌剂用于太子参多种真菌性病害的防治。

技术研发人员:袁青松;周涛;江维克;王小爱;汪露;欧小宏;肖承鸿
受保护的技术使用者:贵州中医药大学
技术研发日:2021.02.24
技术公布日:2021.07.23
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