一种与柑橘属植物抗病相关的FcRGA1基因、引物对、沉默载体和应用

一种与柑橘属植物抗病相关的fcrga1基因、引物对、沉默载体和应用
技术领域
1.本发明涉及基因编辑领域，特别是涉及一种与柑橘属植物抗病相关的fcrga1基因、引物对、沉默载体和应用。


背景技术：

2.柑橘是我国南方地区最重要的果树，新中国成立以后，柑橘产业发展迅猛，成为了中国柑橘主产区农业经济产业的重要支柱，在扩大城乡居民就业、促进农业经济增收等不同方面都做出了巨大贡献。但溃疡病(citrus bacterial canker disease，cbcd)对我国柑橘产业的发展造成了极为严重的威胁。因此，溃疡病研究是柑橘科技工作的重中之重。
3.基于此，培育具有溃疡病抗性的柑橘品种将有利于柑橘业的持续、稳定发展。由于大多数柑橘品种为多胚类型，其无性胚发育优于有性胚，造成后者发育不良，加之部分品种雌和/或雄性败育，难以通过有性杂交进行抗性育种。可见寻找一种快速、有效获得抗病品种的方法是十分重要的。


技术实现要素：

4.为了解决上述问题，本发明提供了一种与柑橘属植物抗病相关的fcrga1基因、引物对、沉默载体和应用。本发明利用fcrga1基因，能够获得一种快速、有效获得抗病品种的方法。
5.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.本发明提供了一种与柑橘属植物抗病相关的fcrga1基因，所述fcrga1基因包括如seq id no:1所示的核苷酸序列。
7.优选的，所述fcrga1基因编码的蛋白质包括seq id no:2所示的氨基酸序列。
8.本发明提供了用于扩增上述基因的引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如seq id no:3所示；所述反向引物的核苷酸序列如seq id no:4所示。
9.本发明提供了一种包括上述基因的沉默载体。
10.本发明提供了上述沉默载体的制备方法，包括以下步骤：
11.将fcrga1基因的特异性片段连接ptrv2的bamhi和sma i两个酶切位点之间，得沉默载体；
12.所述fcrga1基因的特异性片段的核苷酸序列seq id no:5所示。
13.本发明提供了上述基因或者上述引物对或上述沉默载体或利用上述制备方法制备得到的沉默载体在培育柑橘属植物新品种中的应用。
14.本发明提供了上述基因或者上述引物对在提高柑橘属植物抗病性中的应用。
15.优选的，所述抗病性包括抗细菌性病害。
16.优选的，所述细菌性病害包括溃疡病。
17.有益效果：本发明提供了一种与柑橘属植物抗病相关的fcrga1基因，所述fcrga1基因包括如seq id no:1所示的核苷酸序列。本发明沉默所述fcrga1基因后，显著降低了柑橘属植物对溃疡病的抗性，表明该基因可用于柑橘抗溃疡病育种中，通过创制fcrga1基因的超表达材料，以期大大增强柑橘属植物对溃疡病的抗性，从而减少每年因溃疡病害对柑橘产业所造成的直接经济损失。
18.而且，本发明通过构建含有柑橘属植物fcrga1基因特异性片段的ptrv2病毒沉默表达载体质粒，协同ptrv1质粒，通过农杆菌介导法注射柑橘属植物实生苗叶片，使柑橘属植物fcrga1基因发生沉默，有效降低了fcrga1基因表达水平，获得柑橘属植物fcrga1基因沉默植株。随后进行柑橘溃疡病菌接种，观察发现沉默植株的发病表型更明显、受伤害程度更严重，表明柑橘属植物fcrga1基因在柑橘溃疡病抗性中具有正向调节作用。本发明具体实施例在金柑中建立了快速、有效的vigs病毒沉默体系，操作简单，实验周期短，可用于研究基因功能，能够有效解决验证金柑基因功能的问题，为挖掘重要柑橘抗逆基因，培育优良、抗病、特色品种奠定基础。
附图说明
19.图1为金柑fcrga1基因的结构，该基因orf区长度为3954bp，编码1318个氨基酸；其中(a)为fcrga1基因的扩增图，marker为dl 2000dnamarker(takara)(b)为fcrga1基因结构图，exon为外显子，upstream/downstream为上游/下游，n
‑
terminal为n段，coiled coil为coiled coil保守结构域，nb
‑
arc为nucleotide
‑
binding adaptor shared by apaf
‑
1r proteins and ced
‑
4保守结构域，lrr*n为leucine rich repeat*n保守结构域，c
‑
terminal为c端，domain location(aa)为域位置(aa)；
20.图2为fcrga1基因在溃疡病下的诱导表达分析，其中relative expression level为相对表达水平；
21.图3为fcrga1基因的沉默效率分析，其中relative expression level为相对表达水平；
22.图4为对照组与沉默组金柑叶片注射溃疡病菌后的表型观察，其中叶片上的control为对照组，fcrga1
‑
vigs为沉默组，c为对照组，r为沉默组，front为正面，back为背面，0dpi为0days post inoculation，即接种前，14dpi为14days poat inoculation，即接种后14天；
23.图5为溃疡病菌感染后对照组与沉默组金柑叶片中溃疡病菌菌落计数，bacterial growth为细菌增殖量；
24.图6为溃疡病菌感染后对照组与沉默组金柑叶片中相对电导率和叶绿素含量分析，其中(a)为溃疡病菌感染后的相对电导率，electrolyte leakage为相对电导率，(b)为溃疡病菌感染后的叶绿素含量，chlorophyll content为叶绿素含量。
具体实施方式
25.如无特殊要求，本发明所用试剂均为本领域技术人员常规购买所得即可。
26.本发明提供了一种与柑橘属植物抗病相关的fcrga1基因，所述fcrga1基因(注释号：ciclev10004102m，https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#)的核苷酸序列
包括seq id no:1所示的序列，具体为：atggctgaaatcattcttactattgttgtagaagttgtaaagtgcttggctcctcccgcatatcgccaaattagctatttgcgtgagagcaagtacatgagcaacttacagaatctcaagattgaagttgacgatctgaagtctgagagggtgcgtacagagcaccaggttgatgaggctaaaagaaaaggagaagagattgaagagaacgttgagaattggcttgcaacggcaaataatgtcattgttgaggcagttaagtttacagacgatgaagccattgcaaataagcgttgtttcaaggggttatgtcctaatttgaagacccgccgtcgacttagcaaggaagcagagaggcagaaggaggctgttgtcaaagtccgagaagctcgaagatttgatagaatttcctactgtactgctccagaggatatacggcttatctctaacaaagactacgagcccttcgaatcaagaatgttcactttgaggaatatactcagtgcactagaagatcccgatgtcaatatacttgggatttatggtatgggcggcatcggaaagacgatgctggcggaagaaattgctaggaaagtcaagagcgacaaactctttgatcaggtggtttttgttgaggtgtcccagaatcaagacatacgaaagattcaaggagaaatcggagataaactaggcctgaagtttcatgaggagagtgaatcaggaagggcgaacagcttatttacacgtataaaagcagagaagaagatcttgataattctagacaacatttgggaaaatcttgatttgcgggttgtcggaattccacatggagatggtcataaaggttgtaaagtactgttgacggccagaagtcaagatgtattgtctgggaagatggattctcgaccaaatttctcaattggtgttctaaacggagaagaagcttggagtctattcaagaagatggcaggtgattatattgaagatagtgaattccaatcgatagcaagggatgtggcaaaggaatgtgcaggtttgcctatttccattgtgacgatagcgagggcattaaggaacaagagattatttgaatggaaggatgcgttggaacaactaagaaggccatcctcaacgaatttcaaagacatacagccaactgcatataaagcaatagagttgagttacaacaaattagaaggggaggagctcaagaacatccttttgctaataggatatacagccatatcatccattgatgccttgttaatgtgtggtatgggattgggtttatttcaaggtgtcaataagatggaagtagcacgagctcgagtactgaccttggtgcacaaactcaaagcttcttgcatgttgctagaccatataagcaagaaggaagagttcttttccatgcatgatgtcgttcgcgatgttgccatatcaattgcatctagagagcaaaatgcattgacagcgacaaatgagcaggttgatggtttcagggaatggtcagacgaaagtgcagtaaagcgttacacttcgatcgtcttacatgatgtcaggactaatgtgcttcctgaagtagtggaatgtcctcaactcaaacttctttttataagtgcggataaggaatcttcatcattaaccattccaaacaattttttcaagaggatgatacaggtcagagttataaacttgacttacatgaatctactgtcactgccttcaacacttggttttctgttaaaccttcgagcactgagtttgtgttattgcaaattgctagatataagtgttataggaggcttgaataaactagaaatcctttgtttaagaggctctgacattaagcagctgccaacagaagtaggtcaattgacttggctaaccttgcttgatttgagagaatgtaggaaactagaagttatcccaccaaatgttttatcaaatttatcccatttagaagaactatacataagttgtagaagctttcaaaaatgggaggtggaggtggaaggggttaagaatgctagcgttgaggagttgaagcatttgcctaacttgacctctttagaattagacatccatgatgtcaacactctgcccagaggcttgttcttggagaagctggaaaagtacagaatacgtattggagattggtattgggagagcaccaacatttggcgtagagaattcagactcaggctgaacaacaagatttgcttgaaggattggctgatcgtgcaactgcagggaattgaagaccttgaattacgtgaattgcaagagcaagatgtcaattattttgctaatgaattaggcaaagtgggttcttcagaactcaagtttctcaggatccatggttgcagcgacgccctcaatccgccggcagagtcaaagagacaggaggaatcagcaaatgatatgcagtcgaatgaaatcattttggaggacaatgttaatatttctaatacacttttcattgagaaggttgcgttaccaaagttggagaagttggcggtgcgttcaataaatattgagagaatttggcaaaaccaagttgcagccatgacttgcggtattgagaatttaacgcacttgacgctgtacaactgtatgaatttaagatgtctattttcatcttctacggttagcgataacatctttgttcgactccaatacattgagatagaaaaatgtcatgtcttggaagagttaatagtcatggacaaccaagaagaagaaaggaagaataatattgtaatgtttcctcagttacaatatctgaagatgtatgatcttgaaaaactcacaagcttcagcacaggagatgtacatatgtttgaatttccatccttgaaagaattatggatatctcggtgtcctgagttcatggtgagatttaaaagaactactaatgacttgacaaaaaag
leu his lys val gln leuasnarg trp asp gluala cys trpala trp lys glu gly leuasn thr thr ile glu gln val asn leu gln lys glu gly phe leu lys lys arg arg gluala pro pro ser gln gln phe leu ser pheala pro ala pro asn leuasn leu gln thrarg leu glu ile leu pro ala met valala gly val trp serasp asp asnasn leu gln leu glu ala thrthr gln phearg lys leu leu serasn gluarg ser leu pro thr***。
28.本发明提供了用于扩增上述基因的引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如seq id no:3所示：ctgccccattttgttgcagtcac；所述反向引物的核苷酸序列如seq id no:4所示：ctaagaaatgaatctggctacggc。本发明所述引物对是跨越起始密码子和终止密码子进行设计扩增的，可以更精确的扩增出该基因的编码序列。
29.本发明提供了一种包括上述基因的沉默载体。在本发明中，所述基础载体优选包括ptrv1和ptrv2；本发明对所述ptrv1和ptrv2的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规购买所得即可，在本发明具体实施例中，所述ptrv1优选购自淼灵质粒平台，货号为p0428；所述ptrv2优选购自淼灵质粒平台，货号为p1181。
30.本发明提供了一种上述沉默载体的制备方法，包括以下步骤：
31.将fcrga1基因的特异性片段插入ptrv2的bamhi和sma i两个酶切位点之间，得沉默载体；
32.所述fcrga1基因的特异性片段的核苷酸序列seq id no:5所示。
33.本发明将fcrga1基因的特异性片段连接ptrv2的bamhi和sma i两个酶切位点之间，得沉默载体，即fcrga1
‑
ptrv2载体。在本发明中，所述fcrga1基因的特异性片段的核苷酸序列seq id no:5所示：ggtttcagggaatggtcagacgaaagtgcagtaaagcgttacacttcgatcgtcttacatgatgtcaggactaatgtgcttcctgaagtagtggaatgtcctcaactcaaacttctttttataagtgcggataaggaatcttcatcattaaccattccaaacaattttttcaagaggatgatacaggtcagagttataaacttgacttacatgaatctactgtcactgccttcaacacttggttttctgttaaaccttcgagcactgagtttgtgttattgcaaattgctagatataagtgttataggaggcttgaataaactagaaatcctttgtttaagaggctctgacattaagcagctgccaacagaagtaggt。本发明对ptrv2的来源没有特殊限定，在本发明具体实施例中所述ptrv2优选购自淼灵质粒平台，货号为p1181。
34.本发明还提供了用于扩增所述fcrga1基因的特异性片段采用的引物中的fcrga1
‑
trv2 f的核苷酸序列如seq id no:6所示：5
’‑
agaaggcctccatggggatccggtttcagggaatggtcagacg
‑3’
，其中带有下划线的部分为酶切位点bamhi，fcrga1
‑
trv2 r的核苷酸序列如seq id no:7所示：5
’‑
tgtcttcgggacatgcccgggacctacttctgttggcagctg
‑3’
，其中带有下划线的部分为酶切位点sma i；所述扩增的体系优选为表3；所述扩增的程序优选为表4。本发明对所述回收和连接的方式没有任何限定，采用本领域技术人员所熟知的方式即可。
35.本发明通过沉默fcrga1基因，显著降低了柑橘属植物对溃疡病的抗性，表明该基因可用于柑橘属植物抗溃疡病育种中，可见，本发明提供的基因、引物能够用于培养柑橘属植物新品种。
36.本发明提供了上述基因或者上述引物对或上述沉默载体或利用上述制备方法制备的得到的沉默载体在培育柑橘属植物新品种中的应用。在本发明中，所述柑橘属植物优选包括金柑。
37.沉默fcrga1基因能够降低柑橘属植物对溃疡病的抗性，通过创制fcrga1基因的超表达材料，能够增强柑橘属植物对溃疡病的抗性，减少每年因溃疡病害对柑橘产业所造成的直接经济损失，因此，本发明提供的基因、引物能够用于提高柑橘属植物抗病性。
38.本发明提供了上述基因或者上述引物对在提高柑橘属植物抗病性中的应用。在本发明中，所述抗病性优选包括抗细菌性病害，更优选为溃疡病。
39.为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种与柑橘属植物抗病相关的fcrga1基因、引物对、沉默载体和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
40.实施例1
41.fcrga1基因的获得
42.1、rna提取：
43.本实验rna提取方法参照浙江易思得生物科技有限公司的easy plant rna extraction kit试剂盒，提取方法按照说明书操作，具体步骤如下：
44.(1)取100～200mg金柑叶片组织在液氮中充分研磨至粉状，放入预先液氮冷冻的2ml rnase
‑
free离心管中，加入1ml buffer pr1，充分涡旋1min，使细胞裂解。
45.(2)加入200μl核酸提取液(24:1氯仿异戊醇)，充分漩涡后，4℃条件下13000g离心5min。
46.(3)吸取上清液到一新2ml rnase free离心管中，加入等体积无水乙醇。充分颠倒混匀，将混合液转移至套放于2ml收集管中的hipure rna吸附柱中，4℃条件下13000g离心1min。
47.(4)弃废液，加入600μlbufferpr2，4℃条件下13000g离心1min，弃废液，重复洗涤1次；
48.(5)将吸附柱放回收集管中，4℃条件下13000g离心1min。
49.(6)将吸附柱放入洁净的1.5ml rnase
‑
free离心管中，吸附柱膜中央缓慢均匀加入20～30μl rna elution buffer，室温放置2～3min,，4℃条件下13000g离心1min，洗脱液即为提取的rna，需放置于
‑
80℃保存。
50.2、cdna的合成
51.本实验cdna合成使用takara反转录试剂盒primescript
tm rt reagent kit with gdna eraser完成，操作步骤如下：
52.(1)从
‑
80℃冰箱取出保存的rna，冰上溶解。按照表1所示配置反转录试剂1反应体系：
53.表1反转录试剂1配制表
54.反应试剂使用量gdnaeraser1μl5
×
gdnaeraserbuffer2μltotalrna2μlrnasefreeddh2o5μl总体积10μl
55.(2)将表1所有试剂混合后，42℃孵育2min；
56.(3)按照表2所示配置反转录试剂2反应体系：
57.表2反转录试剂2配制表
[0058][0059][0060]
(4)将42℃孵育完成的反转录试剂1和配制好的反转录试剂2混合，37℃孵育15min，再于85℃孵育15s，得到产物即为金柑cdna；
[0061]
(5)使用超微量核酸蛋白测定仪检测金柑cdna浓度，得到的cdna可以用于金柑基因的克隆和后续定量分析，将获得的cdna存储于
‑
20℃。
[0062]
3、fcrga1基因序列确定
[0063]
(1)pcr扩增
[0064]
根据植物基因组数据库phytozome 12.1(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)中获得的fcrga1基因序列信息设计扩增引物。正向引物fcrga1 f(seq id no:3)：5
’‑
ctgccccattttgttgcagtcac
‑3’
，反向引物fcrga1 r(seq id no:4)：5
’‑
ctaagaaatgaatctggctacggc
‑3’
。
[0065]
以金柑叶片cdna为模板，进行pcr扩增。pcr反应体系如表3所示。
[0066]
表3pcr反应体系
[0067]
反应试剂使用量primestarmaxpremix(2
×
)25μl正向引物2μl反向引物2μlcdna12μlddh2o19μl总体积50μl
[0068]
按照表4所列条件进行pcr扩增程序。
[0069]
表4基因扩增pcr程序
[0070][0071]
(2)连接载体
[0072]
采用axyprep
‑
96 dna凝胶回收试剂盒对扩增得到产物进行纯化回收，纯化产物与中间载体ptopo进行连接，连接体系见表5，室温孵育5min后转化大肠杆菌感受态dh5α。
[0073]
表5ptopo载体连接体系
[0074][0075][0076]
37℃过夜培养后挑取单克隆进行扩大培养，经菌液pcr鉴定为阳性条带后，送武汉擎科公司进行测序。测序结果如图1所示，经比对后得到正确的fcrga1序列。
[0077]
实施例2
[0078]
溃疡病菌对fcrga1基因的诱导表达分析
[0079]
(1)金柑材料：采用金柑种子种植实生苗，3月大左右即可进行溃疡病菌(厂家：中国微生物菌种保藏中心，货号：bio
‑
33588)接种。
[0080]
(2)溃疡病菌株活化：接种前从
‑
80℃取出保存的溃疡病菌株，na固体培养基(厂家：北京陆桥技术股份有限公司，货号：cm107
‑
01)划线活化，28℃培养箱培养2d后挑取单克隆，继续在新的na培养基划线扩大培养，2d后刮取溃疡病菌菌体(xcc菌体)，无菌水稀释调节，配制为5
×
107cfu/ml的菌悬液。
[0081]
(3)金柑叶片接种溃疡病菌：使用小号注射针筒(1ml)将配制好的菌悬液注射进金柑叶背面，每片叶片注射两个接种点。对照组接种等量的蒸馏水。采集接种0h、1h、3h、6h、12h、24h的叶片，进行qrt
‑
pcr，结果见表6和图2定量引物如下：
[0082]
fcactin f(seq id no:8)：5
’‑
ccgaccgtatgagcaaggaaa
‑3’
；
[0083]
fcactin r(seq id no:9)：5
’‑
ttcctgtggacaatggatgga
‑3’
；
[0084]
fcrga1 qrtf(seq id no:10)：5
’‑
tcgatagcaagggatgtggc
‑3’
；
[0085]
fcrga1 qrt r(seq id no:11)：5
’‑
ccaaggtcagtactcgagctc
‑3’
；
[0086]
表6fcrga1基因在溃疡病下的诱导表达分析结果
[0087]
0h1h3h6h12h24h11.78796212.3433298017.87911244612.33467776.4422311
[0088]
fcrga1基因在溃疡病下的诱导表达分析结果如表6和图2所示，fcrga1基因在接种溃疡病菌后持续受到诱导上调表达，并在12h表达量达到最大，说明fcrga1基因可能与金柑在溃疡病下的高抗能力相关。
[0089]
实施例3
[0090]
fcrga1基因沉默载体的构建
[0091]
根据fcrga1基因序列，利用primer 5.0软件设计特异性的沉默片段引物，以金柑cdna为模板，扩增沉默片段，即fcrga1基因的特异性片段(seq id no:5)，扩增体系见表3，扩增程序见表4(将72℃延伸时间调整为1min)，回收采用axyprep
‑
96 dna凝胶回收试剂盒常规方式回收。扩增产物回收后采用擎科生物sosoo连接酶(货号tsv
‑
s1)连接至载体ptrv2(购自淼灵质粒平台，货号为p1181)的bamhi和sma i两个酶切位点之间，连接体系见表7。连接完成后转化大肠杆菌感受态，挑单克隆进行菌液pcr鉴定后送公司测序，比对正确后获得fcrga1
‑
ptrv2载体。
[0092]
fcrga1
‑
trv2 f(seq id no:6)：5
’‑
agaaggcctccatggggatccggtttcagggaatggtcagacg
‑3’
[0093]
fcrga1
‑
trv2 r(seq id no:7)：5
’‑
tgtcttcgggacatgcccgggacctacttctgttggcagctg
‑3’
。
[0094]
表7sosoo连接体系
[0095][0096]
实施例4
[0097]
利用沉默载体沉默金柑中的fcrga1基因
[0098]
1、沉默材料的获取：
[0099]
采用阳性fcrga1
‑
ptrv2大肠杆菌抽提质粒后转化农杆菌感受态gv3101，同时转化ptrv1(购自淼灵质粒平台，货号为p0428)和ptrv2质粒至gv3101中，经鉴定获得阳性农杆菌株。将ptrv1，ptrv2与fcrga1
‑
ptrv2农杆菌单克隆振荡活化过夜培养，4000g离心5min收集菌体，加入侵染缓冲液(10mmol/l mes，10mmol/l mgcl2，200μmol/l as)悬浮菌体并调节od
600
值为0.8。按照1:1的比例混合ptrv1和fcrga1
‑
ptrv2菌体重悬液，另取ptrv1与ptrv2菌液同比例混合作为对照组。采用小号注射器(1ml)将对照组与沉默组菌液注射进金柑叶片背面。
[0100]
2、fcrga1基因沉默效率分析：
[0101]
分别在注射后的1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d分别取样对照组与沉默组叶片材料，提取rna，进行反转录后分析fcrga1基因的表达变化。结果见表8和图3。
[0102]
表8vigs沉默效率
[0103]
0d1d2d3d4d5d6d7d1.08818720.8505649920.4074189090.116525640.0822566760.1002215920.0921592770.091152379
[0104]
结果如表8和图3所示，相比较于对照组，金柑叶片接种沉默载体后2d表达量即得到显著下降，并在接种后第4d开始稳定维持在0.1倍左右一直持续至第7d，表明目标基因fcrga1被有效沉默。
[0105]
实施例5
[0106]
溃疡病菌接种沉默金柑叶片
[0107]
根据沉默效率分析结果，选择接种沉默载体后第4d开始，分别对对照组和沉默组金柑叶片进行溃疡病菌接种(步骤见实施例2)，为提高实验的准确性，选择在同一片金柑叶片的左右半边各进行对照组与沉默组注射，4d后接种等量溃疡病菌。
[0108]
实施例6
[0109]
沉默材料溃疡病抗性鉴定
[0110]
1、沉默材料表型观察
[0111]
接种溃疡病菌后2周分别对对照组和沉默组金柑叶片进行表型观察，结果如图4所示，注射对照组的半边金柑叶片发病症状较轻，病斑范围较小；沉默了fcrga1基因的半边金
柑叶片发病症状明显，叶片失绿，病斑显著且范围大。
[0112]
2、沉默材料溃疡病菌菌落生长计数
[0113]
分别选取对照组(control)和沉默组(fcrga1
‑
vigs)的金柑叶片，使用6mm空径打孔器在叶片边缘打孔，充分研磨后加入200μl无菌水，3000g离心30s，吸取上清液于血细胞计数板上，置于显微镜下进行观察并计算菌落数，结果见表9和图5。
[0114]
表9菌落数(
×
106cfu/ml)
[0115]
controlfcrga1
‑
vigs12.6428
[0116]
结果如表9和图5所示，经计算菌落数量后可知对照组的溃疡病菌数为1.264
×
107cfu/ml，显著低于沉默组的2.8
×
107cfu/ml，说明沉默fcrga1基因促进了溃疡病菌的繁殖。
[0117]
3、相对电导率测定
[0118]
取对照组与沉默组金柑叶片洗净，擦干水分后放入50ml离心管中，加入30ml去离子水，置于旋转摇床室温缓慢摇动1h，后测量此时电导率e1。之后95℃煮样10min取出，冷却至室温后再次测量电导率，记为e2。同时测量空白去离子水电导率，分别记为e01和e02。根据公式：(e1
‑
e01)/(e2
‑
e02)*100％，式ⅰ，计算各组对应相对电导率，结果见表10和图6中a。
[0119]
表10相对电导率(％)
[0120]
controlfcrga1
‑
vigs47.2404444981.97191085
[0121]
结果如表10和图6中a所示：对照组的相对电导率为47.24％，显著低于沉默组的81.97％，说明沉默fcrga1基因后，在溃疡病菌感染下金柑叶片的细胞膜透性增加，受伤害程度更重。
[0122]
4、叶绿素含量测定
[0123]
取对照组与沉默组金柑叶片0.1g，加入1.9ml蒸馏水冰上研磨成匀浆。取200μl匀浆液加入4.8ml 80％丙酮，充分涡旋后，4000g离心5min，取上清分别检测其在645nm处吸光值(记为a645)，按照公式ct(mg/l)＝a645
×
1000
÷
34.5，式ⅱ，计算总叶绿素(ct)含量，结果见表11和图6中b。
[0124]
表11叶绿素含量(mg/g fw)
[0125] cacbctcontrol1.9194793330.4563753332.375854667fcrga1
‑
vigs0.2452310.2025336670.447764667
[0126]
结果如表11和图6中b所示：对照组的叶绿素含量为2.38mg/g，显著高于沉默组的0.45mg/g，说明沉默fcrga1基因后，在溃疡病菌感染下金柑叶片的光和效率更弱。
[0127]
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。