一种纯化西曲瑞克的方法与流程

1.本发明涉及多肽纯化的领域，特别是一种纯化西曲瑞克的方法。


背景技术：

2.中文名：西曲瑞克；英文名：cetrorelix acetate；西曲瑞克是德国asta medica公司研制的一种lhrh拮抗剂，能控制卵巢的刺激作用，预防不成熟卵泡过早排出，帮助受孕。大量研究表明，西曲瑞克对卵巢癌、前列腺癌、子宫纤维癌、子宫内膜异位等疾病有较好的疗效，而且对良性前列腺肥大和卵巢过度刺激综合征有预防和改善作用。
3.固相合成西曲瑞克，合成物中会产生多种影响样品的纯度和收率的杂质，通过现有纯化技术分离得到西曲瑞克样品纯度低，收率低，与此同时，西曲瑞克本身含多个疏水性较强的氨基酸，所以其溶解性较差，在生产过程中极易析出，从而影响收率与质量。


技术实现要素：

4.为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种纯化西曲瑞克的方法，该方法经过两次hplc纯化，提高了西曲瑞克的纯度和收率。
5.为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
6.本发明是一种纯化西曲瑞克的方法，包括如下步骤：
7.步骤一，西曲瑞克粗品预处理得到西曲瑞克粗肽溶液；
8.步骤二，以十八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相，以三氟乙酸为流动相a，以乙腈为流动相b，进行第一次hplc纯化，去除西曲瑞克峰前杂质；
9.步骤三，添加等体积醋酸水溶液，防止样品析出，得到西曲瑞克第一步样品溶液；
10.步骤四，以十八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相，以醋酸为流动相a；以乙腈为流动相b，进行第二次hplc纯化，去除西曲瑞克峰后的杂质，得到西曲瑞克第二步样品溶液；
11.步骤五，以十八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相，以乙酸铵为流动相a1、醋酸水溶液为流动相a2；以乙腈为流动相b，进行转盐，将西曲瑞克转盐为醋酸盐，得到西曲瑞克转盐样品溶液；
12.步骤六，向转盐样品溶液加入等体积醋酸水溶液进行浓缩，得到转盐浓缩液。
13.步骤七，将转盐浓缩液倒入冻干盘，放入冻干机中冻干。
14.前述的一种纯化西曲瑞克的方法，优选的技术方案是：
15.步骤一中，西曲瑞克粗品预处理得到西曲瑞克粗肽水溶液；预处理步骤包括：
16.1)将西曲瑞克粗品溶于30％醋酸水溶液中得到西曲瑞克粗肽溶液；
17.2)取西曲瑞克粗肽溶液用滤膜过滤除去不溶性颗粒，收集滤液备用。
18.步骤二中，以十八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相，以0.1％三氟乙酸为流动相a，以乙腈为流动相b，检测波长为260nm，进行第一次hplc线性梯度洗脱，收取含有西曲瑞克样品的馏分；所述固定相的粒度为8μm，所述0.1％三氟乙酸的制备方法为：取1000ml水，加1ml三氟乙酸。
19.步骤三中，向第一步纯化所得样品中加入等体积10％醋酸水溶液，以防止样品的析出。
20.步骤四中，以十八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相，以10％醋酸水溶液为流动相a，以乙腈为流动相b，检测波长为260nm，进行第二次hplc梯度洗脱，收取含有西曲瑞克样品的馏分；所述10％醋酸水溶液的制备方法为：取900ml水加醋酸100ml。
21.步骤五中，以十八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相，以50mmol/l乙酸铵为流动相a1、10％醋酸水溶液为流动相a2；以乙腈为流动相b，进行转盐，将西曲瑞克转盐为醋酸盐，得到西曲瑞克转盐样品溶液。
22.步骤六中，向转盐样品溶液加入等体积20％醋酸水溶液进行浓缩，此操作可保证样品在浓缩过程中不会析出,从而得到澄清的转盐浓缩液。
23.步骤七中，将转盐浓缩液倒入冻干盘，放入冻干机中冻干。设定冻干曲线升华干燥阶段温度要小于转盐浓缩液共熔点。
24.与现有技术相比，本发明的有益之处在于：
25.1、本发明在生产各步均加入醋酸水溶液(可控制较高浓度)，可有效防止生产过程中样品的析出；
26.2、用十八烷基硅烷键合硅胶填料与流动相0.1％三氟乙酸结合，可以去除西曲瑞克大部份的峰前杂质；收集的样品纯度达99.0％。
27.3、用十八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相与10％醋酸水溶液相结合的色谱条件梯度洗脱，可以除去西曲瑞克峰后的杂质，收到纯度为99.8％以上的样品收率在70％以上；提高了西曲瑞克成品纯度和收率。
附图说明
28.图1是实施例1中西曲瑞克粗品的hplc图；
29.图2是实施例1第一次hplc纯化后西曲瑞克的hplc图；
30.图3是实施例1第二次hplc纯化后西曲瑞克的hplc图；
31.图4是实施例1转盐后西曲瑞克的hplc图。
具体实施方式
32.以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
33.实施例1：
34.取西曲瑞克粗品，其hplc图参照图1。
35.样品处理：将含20g西曲瑞克粗肽(粗肽：30克)样品溶于30％醋酸水溶液，完全溶解后用0.22μm滤膜过滤。收集过滤后的西曲瑞克粗肽溶液备用。
36.第一步hplc纯化，其hplc图参照图2。
37.色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相(50mm
×
250mm)的色谱柱；以0.1％三氟乙酸(取1000ml水，加1ml三氟乙酸，混合均匀)为流动相a；以乙腈为流动相b；流速为50ml每分钟；检测波长为260nm；单针上样量为3g。以下表洗脱梯度进行洗脱。
[0038][0039]
收取纯度大于99.0％、前杂小于0.1％的西曲瑞克样品的馏分，加入等体积10％醋酸水溶液，得到西曲瑞克第一步样品溶液。
[0040]
第二步hplc纯化，其hplc图参照图3。
[0041]
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相(50mm
×
250mm)的色谱柱；以10％的乙酸溶液(取900ml水加乙酸100ml)为流动相a；以乙腈为流动相b；流速为50ml每分钟；检测波长为260nm；上样量为2g。以下表洗脱梯度进行洗脱。
[0042][0043]
收取纯度大于99.8％、单杂小于0.1％的西曲瑞克样品的馏分。
[0044]
转盐，其hplc图参照图4。
[0045]
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相(50mm
×
250mm)的色谱柱；以50mmol/l乙酸铵为流动相a1、10％醋酸水溶液为流动相a2；以乙腈为流动相b，；流速为50ml每分钟；检测波长为260nm；上样量为5g。以下表洗脱梯度进行洗脱。
[0046][0047]
收取纯度大于99.8％、单杂小于0.1％的西曲瑞克样品的馏分。溶液经对照品定量含西曲瑞克14.0g，纯化收率达70.0％。
[0048]
浓缩冻干
[0049]
将转盐峰顶溶液加入等体积20％醋酸水溶液，用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09mpa以下浓缩浓度至25
±
5g/l，按以下冻干曲线冻干：
[0050][0051]
实施例2：
[0052]
取西曲瑞克粗品
[0053]
样品处理：将含70g西曲瑞克粗肽(粗肽：100克)样品溶于30％醋酸水溶液，完全溶解后用0.22μm滤膜过滤。收集过滤后的西曲瑞克粗肽溶液备用。
[0054]
第一步hplc纯化
[0055]
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相(100mm
×
250mm)的色谱柱；以0.1％三氟乙酸(取1000ml水，加1ml三氟乙酸，混合均匀)为流动相a；以乙腈为流动相b；流速为200ml每分钟；检测波长为260nm；单针上样量为12g。以下表洗脱梯度进行洗脱。
[0056][0057]
收取纯度大于99.0％、前杂小于0.1％的西曲瑞克样品的馏分，加入等体积10％醋酸水溶液，得到西曲瑞克第一步样品溶液。
[0058]
第二步hplc纯化
[0059]
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相(100mm
×
250mm)的色谱柱；以10％的乙酸溶液(取900ml水加乙酸100ml)为流动相a；以乙腈为流动相b；流速为200ml每分钟；检测波长为260nm；上样量为8g。以下表洗脱梯度进行洗脱。
[0060][0061]
收取纯度大于99.8％、单杂小于0.1％的西曲瑞克样品的馏分。
[0062]
转盐
[0063]
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相(100mm
×
250mm)的色谱柱；以50mmol/l乙酸铵为流动相a1、10％醋酸水溶液为流动相a2；以乙腈为流动相b，；流速为200ml每分钟；检测波长为260nm；上样量为20g。以下表洗脱梯度进行洗脱。
[0064][0065]
收取纯度大于99.8％、单杂小于0.1％的西曲瑞克样品的馏分。溶液经对照品定量含西曲瑞克50.0g，纯化收率达71.4％。
[0066]
浓缩冻干
[0067]
将转盐峰顶溶液加入等体积20％醋酸水溶液，用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09mpa以下浓缩浓度至25
±
5g/l，按以下冻干曲线冻干：
[0068][0069]
实施例3：
[0070]
取西曲瑞克粗品
[0071]
样品处理：将含180g西曲瑞克粗肽(粗肽：250克)样品溶于30％醋酸水溶液，完全溶解后用0.22μm滤膜过滤。收集过滤后的西曲瑞克粗肽水溶液备用。
[0072]
第一步hplc纯化
[0073]
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相(200mm
×
250mm)的色谱柱；以0.1％三氟乙酸(取1000ml水，加1ml三氟乙酸，混合均匀)为流动相a；以乙腈为流动相b；流速为800ml每分钟；检测波长为260nm；单针上样量为48g。以下表洗脱梯度进行洗脱。
[0074][0075]
收取纯度大于99.0％、前杂小于0.1％的西曲瑞克样品的馏分，加入等体积10％醋酸水溶液，得到西曲瑞克第一步样品溶液。
[0076]
第二步hplc纯化
[0077]
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相(200mm
×
250mm)的色谱柱；以10％的乙酸溶液(取900ml水加乙酸100ml)为流动相a；以乙腈为流动相b；流速为800ml每分钟；检测波长为260nm；上样量为32g。以下表洗脱梯度进行洗脱。
[0078][0079]
收取纯度大于99.8％、单杂小于0.1％的西曲瑞克样品的馏分。
[0080]
转盐
[0081]
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相(200mm
×
250mm)的色谱柱；以50mmol/l乙酸铵为流动相a1、10％醋酸水溶液为流动相a2；以乙腈为流动相b，；流速为800ml每分钟；检测波长为260nm；上样量为80g。以下表洗脱梯度进行洗脱。
[0082][0083]
收取纯度大于99.8％、单杂小于0.1％的西曲瑞克样品的馏分。溶液经对照品定量含西曲瑞克130.0g，纯化收率达72.2％。
[0084]
浓缩冻干
[0085]
将转盐峰顶溶液加入等体积20％醋酸水溶液，用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09mpa以下浓缩浓度至25
±
5g/l，按以下冻干曲线冻干：
[0086][0087][0088]
由3个实施例可知，通过本方法纯化西曲瑞克粗品，得到的西曲瑞克的纯度大于99.8％，收率70％以上，且三个实施例在生产的过程中均无析出现象出现。
[0089]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。