血型抗原的修饰的制作方法

背景技术：

1、根据人体内每个红细胞表面是否存在抗原(abo血型)，血液制品可分成不同的组。a、b、ab和a1抗原是通过红细胞糖蛋白上的寡糖序列来决定。血型抗原组中的基因提供了制造抗原蛋白的指令。血型抗原蛋白在红细胞的细胞膜内发挥多种功能。这些蛋白质功能包括将其他蛋白质和分子转运进出细胞、维持细胞结构、附着到其他细胞和分子以及参与化学反应。

2、恒河猴(rhesus)因子(rh)血型是仅次于abo血型系统的第二重要血型系统。rh血型系统由49种确定的血型抗原组成，其中五种抗原d、c、c、e和e是最重要的。个体的rh(d)状态通常在abo型后用阳性或阴性后缀描述。术语“rh因子”、“rh阳性”和“rh阴性”仅指rh(d)抗原。rh抗原的抗体可能参与溶血性输血反应，抗rh(d)和rh(c)抗原的抗体会给胎儿和新生儿带来重大的溶血病风险。abo抗体在每个人的生命早期都会产生。然而，rh-人体内的恒河猴抗体通常仅在人敏感时才会产生。举例来说，通过生下rh+婴儿或通过接受rh+输血可能会发生这种情况。

3、a、b、h和rh抗原是血液、组织和细胞移植供体与受体之间组织相容性的主要决定因素。abo基因编码的糖基转移酶活性负责产生a、b、ab、o组织血型抗原，这些抗原显示在细胞表面上。a组个体编码abo基因产物，具有产生α(1，3)n-乙酰半乳糖氨基转移酶活性的特异性和b组个体具有产生α(1，3)半乳糖基转移酶活性的特异性。o型个体根本不产生功能性半乳糖基转移酶，因此不产生任何修饰。ab型个体各自拥有一个拷贝，并产生两种类型的修饰。abo基因的酶产物作为底物作用于h抗原，因此缺乏abo活性的o型个体呈现未修饰的h抗原，并因此通常称为o(h)型。

4、h抗原本身是由fut1基因编码的α(1，2)岩藻糖基转移酶的产物。在非常罕见的个体中，由于fut1基因的破坏而完全丧失了h抗原，并且不存在abo产生a或b组织血型的底物。据说这些个体属于孟买(bombay)组织血型。rh抗原是由rhd基因编码，并且rh阴性的个体携带rhd基因的缺失或破坏。

5、适用于治疗应用的细胞系的可用性受到严重限制，并且通常可用的细胞系并非普遍与所有可能的受体组织相容。

6、仍然需要用于产生适用于细胞疗法的组织血型细胞的新方式、组合物和方法。

技术实现思路

1、在一些方面，本文提供了一种分离的细胞，其中abo基因的表达因abo基因的有害变异或通过插入abo基因的外显子6 258delg变异而部分或完全失活，和/或rhd基因的表达因rhd基因的有害变异而部分或完全失活。

2、在一些实施方案中，abo基因的表达因abo基因的外显子1的acacct内；外显子2的agtgcg内；或外显子8的caagcgc、ggcgca、tgggcg、accacg、gccgca、ccacgt、tgccgt、tactcg、actcgg、gagcgc、gcctgg、gtcctt、tcacgc、tggacg、tggtcg、gctggc、cacgcg、aggtga或gcatcg内的插入或缺失而部分或完全失活。

3、在一些实施方案中，abo基因的有害变异是使用包含指导rna靶序列的crispr-cas9基因编辑产生的，所述指导rna靶序列包含选自由表a-表c中的那些序列组成的组中的一个。

4、在一些实施方案中，abo基因的有害变异包括编码外显子中的插入/缺失，并且指导rna靶序列包含seq id no：1或seq id no：2。

5、在一些实施方案中，abo基因的有害变异包括移码插入/缺失并且指导rna靶序列包含seq id no：3。

6、在一些实施方案中，abo基因的有害变异是纯合变异，使得细胞是组织血型o细胞。

7、在一些实施方案中，abo基因的外显子6 258delg变异(例如，g的外显子6在核苷酸位置258处的缺失)是使用crispr-cas9基因编辑产生的，所述crispr-cas9基因编辑包含指导rna靶序列和同源定向修复(homology directed repair，hdr)模板，所述指导rna靶序列包含选自由seq id no：3-5组成的组中的一个，所述同源定向修复模板包含编码258delg变异的序列、pam序列、间隔子区和两个同源臂，每个同源臂包含约10个核苷酸到约1kb的与abo基因的同源序列。

8、在一些实施方案中，hdr模板还包含在pam序列和/或间隔子区中的一个或多个沉默突变，以确保hdr模板不被cas9切割。

9、在一些实施方案中，abo基因的外显子6 258delg变异是使用crispr-cas9基因编辑产生的，所述crispr-cas9基因编辑包含有包含选自由seq id no：3-5组成的组中的一个的指导rna靶序列，并且hdr模板包含选自由seq id no：6-8组成的组中的一个。

10、在一些实施方案中，abo基因的外显子6 258delg变异是纯合变异，使得细胞是组织血型o细胞。

11、在一些实施方案中，rhd基因的有害变异是通过使用包含一个或多个指导rna靶序列的crispr-cas9基因编辑产生的，所述指导rna靶序列包含选自由表d-表f中的那些序列组成的组中的一个。

12、在一些实施方案中，有害变异包括缺失包含rhd基因的外显子1-8的基因组区，并且通过使用crispr-cas9基因编辑产生，所述crispr-cas9基因编辑包含有包含seq id no：11的指导rna靶序列和包含seq id no：12的另一个指导rna。

13、在一些实施方案中，rhd基因的有害变异包括移码插入/缺失并且指导rna靶序列包含seq id no：9或seq id no：10。

14、在一些实施方案中，rhd基因的表达因rhd基因的外显子2的tcatgg、gaggtg、aactcg、agtttc、ttggct或cacagc内；外显子3的ccgtga内；外显子4的gggtag或agggaa内；外显子5的ttcgat、tcagcg、catagt或atcgaa内；外显子6的cgtcgg或tccgtc内；外显子7的cggcaa、cggagc、taccgt、gcttgc或cttgct内；.或外显子8的ggttct或tcctac内的插入或缺失而部分或完全失活。

15、在一些实施方案中，rhd基因的有害变异是纯合变异，使得细胞是恒河猴因子(rh)阴性细胞。在一些实施方案中，rhd基因的有害变异是纯合变异，使得细胞是o型阴性细胞。

16、在一些方面，本文提供了一种细胞，其中abo基因的表达因abo基因的有害变异或通过插入abo基因的外显子6 258delg变异而部分或完全失活。

17、在一些实施方案中，细胞是rh阴性细胞。在一些实施方案中，abo基因的有害变异是使用包含指导rna靶序列的crispr-cas9基因编辑产生的，所述指导rna靶序列包含选自由表a-表c中的那些序列组成的组中的一个。

18、在一些实施方案中，abo基因的有害变异包括编码外显子中的插入/缺失，并且指导rna靶序列包括seq id no：1或seq id no：2。

19、在一些实施方案中，abo基因的有害变异包括移码插入/缺失并且指导rna靶序列包含seq id no：3。

20、在一些实施方案中，abo基因的表达因abo基因的外显子1的acacct内；外显子2的agtgcg内；或外显子8的caagcgc、ggcgca、tgggcg、accacg、gccgca、ccacgt、tgccgt、tactcg、actcgg、gagcgc、gcctgg、gtcctt、tcacgc、tggacg、tggtcg、gctggc、cacgcg、aggtga或gcatcg内的插入或缺失而部分或完全失活。

21、在一些实施方案中，abo基因的有害变异是纯合变异，使得细胞是o型阴性细胞。

22、在一些实施方案中，abo基因的外显子6 258delg变异是使用crispr-cas9基因编辑产生的，所述crispr-cas9基因编辑包含指导rna靶序列和hdr模板，所述指导rna靶序列包含选自由seq id no：3-5中的那些序列组成的组中的一个，所述hdr模板包含编码258delg变异的序列、pam序列、间隔子区和两个同源臂，每个同源臂包含约10个核苷酸到约1kb的所述abo基因的同源序列。

23、在一些实施方案中，hdr模板还包含在pam序列和/或间隔子区中的一个或多个沉默突变，以确保hdr模板不被cas9切割。

24、在一些实施方案中，abo基因的外显子6 258delg变异是使用crispr-cas9基因编辑产生的，所述crispr-cas9基因编辑包含有包含选自由seq id no：3-5组成的组中的一个的指导rna靶序列，并且hdr模板包含选自由seq id no：6-8组成的组中的一个。

25、在一些实施方案中，abo基因的外显子6 258delg变异是纯合变异，使得细胞是o型阴性细胞。

26、在一些方面，本文提供了一种分离的细胞，其中fut1基因的表达因fut1基因的有害变异而部分或完全失活和/或rhd基因的表达因rhd基因的有害变异而部分或完全失活。

27、在一些实施方案中，fut1基因的表达因fut1基因的外显子4的atcgac、agtacg、cgccct、gtttgc、cgacaa、ggtgcg、cgccgt、acgccg、ccggtt、cgcggg、ttttcg、ataccg、gtgcgc、ccattg、tgtcgg、atctgc、ctttgt、ggggcc、ggccat、tgcgat、cgtgca或atggac内的插入缺失而部分或完全单独的活化。

28、在一些实施方案中，rhd基因的表达因rhd基因的外显子2的tcatgg、gaggtg、aactcg、agtttc、ttggct或cacagc内；外显子3的ccgtga内；外显子4的gggtag或agggaa内；外显子5的ttcgat、tcagcg、catagt或atcgaa内；外显子6的cgtcgg或tccgtc内；外显子7的cggcaa、cggagc、taccgt、gcttgc或cttgct内；或外显子8的ggttct或tcctac内的插入或缺失而部分或完全失活。

29、在一些实施方案中，fut1基因的有害变异是使用包含指导rna靶序列的crispr-cas9基因编辑产生的，所述指导rna靶序列包含选自由表g-表i中的那些序列组成的组中的一个。

30、在一些实施方案中，有害变异包括fut1基因的外显子4中的缺失和包含seq idno：13或seq id no：14的指导rna靶序列。

31、在一些实施方案中，fut1基因的有害变异是纯合变异，使得细胞具有孟买表型。

32、在一些实施方案中，rhd基因的有害变异是通过使用包含一个或多个指导rna靶序列的crispr-cas9基因编辑产生的，所述指导rna靶序列包含选自由表d-表f中的那些序列组成的组中的一个或多个。

33、在一些实施方案中，有害变异包括缺失包含rhd基因的外显子1-8的基因组区以及包含seq id no：11的指导rna靶序列和包含seq id no：12的另一个指导rna。

34、在一些实施方案中，rhd基因的有害变异包括移码插入/缺失并且指导rna靶序列包含seq id no：9或seq id no：10。

35、在一些实施方案中，rhd基因的有害变异是纯合变异，使得细胞是恒河猴因子(rh)阴性的。

36、在一些实施方案中，rhd基因的有害变异是纯合变异，使得细胞具有孟买表型并且是rh阴性的。

37、在一些方面，本文提供了一种分离的细胞，其中fut1基因的表达因fut1基因的有害变异而部分或完全失活。在一些实施方案中，细胞还是rh阴性细胞。

38、在一些实施方案中，fut1基因的表达因fut1基因的外显子4的atcgac、agtacg、cgccct、gtttgc、cgacaa、ggtgcg、cgccgt、acgccg、ccggtt、cgcggg、ttttcg、ataccg、gtgcgc、ccattg、tgtcgg、atctgc、ctttgt、ggggcc、ggccat、tgcgat、cgtgca或atggac内的插入或缺失而部分或完全失活。

39、在一些实施方案中，fut1基因的有害变异是使用包含指导rna靶序列的crispr-cas9基因编辑产生的，所述指导rna靶序列包含选自由表g-表i中的那些序列组成的组中的一个。

40、在一些实施方案中，有害变异包括fut1基因的外显子4中的缺失并且是使用包含有包含seq id no：13或seq id no：14的指导rna靶序列的crispr-cas9基因编辑产生。

41、在一些实施方案中，fut1基因的有害变异是纯合变异，使得细胞是通用孟买阴性细胞。

42、在一些方面，本文提供了一种分离的细胞，其中rhd基因的表达因rhd基因的有害变异而部分或完全失活。

43、在一些实施方案中，细胞具有o型或孟买表型。

44、在一些实施方案中，rhd基因的表达因rhd基因的外显子2的tcatgg、gaggtg、aactcg、agtttc、ttggct或cacagc内；外显子3的ccgtga内；外显子4的gggtag或agggaa内；外显子5的ttcgat、tcagcg、catagt或atcgaa内；外显子6的cgtcgg或tccgtc内；外显子7的cggcaa、cggagc、taccgt、gcttgc或cttgct内；或外显子8的ggttct或tcctac内的插入或缺失而部分或完全失活。

45、在一些实施方案中，rhd基因的有害变异是通过使用包含一个或多个指导rna靶序列的crispr-cas9基因编辑产生的，所述指导rna靶序列包含选自由表d-表f中的那些序列组成的组中的一个。

46、在一些实施方案中，有害变异包括缺失包含rhd基因的外显子1-8的基因组区以及包含seq id no：11的指导rna靶序列和包含seq id no：12的另一个指导rna。

47、在一些实施方案中，rhd基因的有害变异包括移码插入/缺失并且指导rna靶序列包含seq id no：9或seq id no：10。

48、在一些实施方案中，rhd基因的有害变异是纯合变异，使得细胞是o型阴性细胞或孟买阴性细胞。

49、在一些方面，本文提供了一种分离的细胞，其中abo基因的表达因abo基因的有害变异或通过插入abo基因的外显子6 258delg变异而部分或完全失活。

50、在一些实施方案中，abo基因的表达因abo基因的外显子1的acacct内；外显子2的agtgcg内；或外显子8的caagcgc、ggcgca、tgggcg、accacg、gccgca、ccacgt、tgccgt、tactcg、actcgg、gagcgc、gcctgg、gtcctt、tcacgc、tggacg、tggtcg、gctggc、cacgcg、aggtga或gcatcg内的插入或缺失而部分或完全失活。

51、在一些实施方案中，abo基因的有害变异是使用包含指导rna靶序列的crispr-cas9基因编辑产生的，所述指导rna靶序列包含选自由表a-表c中的那些序列组成的组中的一个。

52、在一些实施方案中，abo基因的有害变异包括编码外显子中的插入或缺失，并且指导rna靶序列包含seq id no：1或seq id no：2。

53、在一些实施方案中，abo基因的有害变异包括移码插入/缺失并且指导rna靶序列包含seq id no：3。

54、在一些实施方案中，abo基因的有害变异是纯合变异。

55、在一些实施方案中，abo基因的外显子6 258delg变异是使用crispr-cas9基因编辑产生的，所述crispr-cas9基因编辑包含指导rna靶序列和hdr模板，所述指导rna靶序列包含选自由seq id no：3-5中的那些序列组成的组中的一个，所述hdr模板包含编码258delg变异的序列、pam序列、间隔子区和两个同源臂，每个同源臂包含约10个核苷酸到约1kb的所述abo基因的同源序列。

56、在一些实施方案中，hdr模板还包含在pam序列和/或间隔子区中的一个或多个沉默突变，以确保hdr模板不被cas9切割。

57、在一些实施方案中，abo基因的外显子6 258delg变异是使用crispr-cas9基因编辑产生的，所述crispr-cas9基因编辑包含有包含选自由seq id no：3-5组成的组中的一个的指导rna靶序列，并且hdr模板包含选自由seq id no：6-8组成的组中的一个。

58、在一些实施方案中，abo基因的外显子6 258delg变异是纯合变异。

59、在一些方面，本文提供了一种分离的细胞，其中rhd基因的表达因rhd基因的有害变异而部分或完全失活。

60、在一些实施方案中，rhd基因的表达因rhd基因的外显子2的tcatgg、gaggtg、aactcg、agtttc、ttggct或cacagc内；外显子3的ccgtga内；外显子4的gggtag或agggaa内；外显子5的ttcgat、tcagcg、catagt或atcgaa内；外显子6的cgtcgg或tccgtc内；外显子7的cggcaa、cggagc、taccgt、gcttgc或cttgct内；或外显子8的ggttct或tcctac内的插入或缺失而部分或完全失活。

61、在一些实施方案中，rhd基因的有害变异是通过使用包含一个或多个指导rna靶序列的crispr-cas9基因编辑产生的，所述指导rna靶序列包含选自由表d-表f中的那些序列组成的组中的一个或多个。

62、在一些实施方案中，有害变异包括缺失包含rhd基因的外显子1-8的基因组区以及包含seq id no：11的指导rna靶序列和包含seq id no：12的另一个指导rna。

63、在一些实施方案中，rhd基因的有害变异包括移码插入/缺失并且指导rna靶序列包含seq id no：9或seq id no：10。

64、在一些实施方案中，rhd基因的有害变异是纯合变异。

65、在一些方面，本文提供了一种分离的细胞，其中fut1基因的表达因fut1基因的有害变异而部分或完全失活。

66、在一些实施方案中，fut1基因的表达因fut1基因的外显子4的atcgac、agtacg、cgccct、gtttgc、cgacaa、ggtgcg、cgccgt、acgccg、ccggtt、cgcggg、ttttcg、ataccg、gtgcgc、ccattg、tgtcgg、atctgc、ctttgt、ggggcc、ggccat、tgcgat、cgtgca或atggac内的插入或缺失而部分或完全失活。

67、在一些实施方案中，fut1基因的有害变异是使用包含指导rna靶序列的crispr-cas9基因编辑产生的，所述指导rna靶序列包含选自由表g-表i中的那些序列组成的组中的一个。

68、在一些实施方案中，有害变异包括fut1基因的外显子4中的缺失和包含seq idno：13或seq id no：14的指导rna靶序列。

69、在一些实施方案中，rhd基因的有害变异是纯合变异。

70、在一些实施方案中，细胞是人类细胞。在其他实施方案中，细胞选自由以下组成的组：诱导多能干细胞、胚胎干细胞(诸如rues2或h9细胞)、成体干细胞和分化细胞。

71、在一些实施方案中，细胞包含编码一种或多种mhc-i的转录调节因子的一种或多种部分或完全失活的基因和/或编码一种或多种mhc-ii的转录调节因子的一种或多种部分或完全失活的基因。

72、在一些实施方案中，b2m基因的表达是部分或完全失活的。

73、在一些实施方案中，ciita基因的表达是部分或完全失活的。

74、在一些实施方案中，所述细胞还包含cd47转基因。

75、在一些实施方案中，b2m和ciita基因的表达是部分或完全失活的并且细胞还包含cd47转基因。

76、在一些实施方案中，本文提供了一种包含根据上述任一项的细胞的药物组合物。

77、在一些实施方案中，本文提供了一种用于治疗需要细胞替代疗法的患者的方法，所述方法包括施用根据上述任一项的细胞。

78、在一些方面，本文提供了一种生成工程化的组织相容性细胞的方法，所述方法包括：(a)获得分离的细胞；(b)将cas9核酸酶和abo基因的指导rna靶序列引入细胞中，所述指导rna靶序列包含选自由表a-表c中的那些序列组成的组中的一个；(c)选择工程化细胞，其中abo基因是部分或完全失活的。

79、在一些实施方案中，指导rna靶序列包含选自由seq id no：1-3组成的组中的一个。

80、在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：(i)将rhd基因的指导rna靶序列引入所述细胞中，所述指导rna靶序列包含选自由表d-表f中的那些序列组成的组中的一个；以及(ii)选择工程化细胞，其中rhd基因是部分或完全失活的。

81、在一些实施方案中，指导rna靶序列包含seq id no：11并且另一个指导rna包含seq id no：12。在一些实施方案中，指导rna靶序列包含seq id no：9或seq id no：10。

82、在一些其他方面，本文提供了一种生成工程化的组织相容性细胞的方法，所述方法包括：(a)获得分离的细胞；(b)将cas9核酸酶和用于产生abo基因的外显子6 258delg变异的指导rna靶序列和hdr模板引入所述细胞中，所述指导rna靶序列包含选自由seq idno：3-5中的那些序列组成的组中的一个，所述hdr模板包含编码258delg变异的序列、pam序列、间隔子区和两个同源臂，每个同源臂包含约10个核苷酸到约1kb的所述abo基因的同源序列；以及(c)选择工程化细胞，其中abo基因是部分或完全失活的。

83、在一些实施方案中，hdr模板还包含在pam序列和/或间隔子区中的一个或多个沉默突变，以确保hdr模板不被cas9切割。

84、在一些实施方案中，指导rna靶序列包含选自由seq id no：3-5组成的组中的一个，并且hdr模板包含选自由seq id no：6-8组成的组中的一个。

85、在一些实施方案中，生成工程化的组织相容性细胞的方法还包括以下步骤：(i)将rhd基因的指导rna靶序列引入所述细胞中，所述指导rna靶序列包含选自由表d-表f中的那些序列组成的组中的一个；以及(ii)选择工程化细胞，其中rhd基因是部分或完全失活的。

86、在一些实施方案中，指导rna靶序列包含seq id no：11并且另一个指导rna包含seq id no：12。

87、在一些实施方案中，指导rna靶序列包含seq id no：9或seq id no：10。

88、在一些方面，本文提供了一种用于生成工程化的组织相容性细胞的方法，所述方法包括：(a)获得分离的细胞；(b)将cas9核酸酶和rhd基因的指导rna靶序列引入细胞中，所述指导rna靶序列包含选自由表d-表f中的那些序列组成的组中的一个；以及(c)选择工程化细胞，其中rhd基因是部分或完全失活的。

89、在一些实施方案中，指导rna靶序列包含seq id no：11并且另一个指导rna包含seq id no：12。

90、在一些实施方案中，指导rna靶序列包含seq id no：9或seq id no：10。

91、在一些实施方案中，用于生成工程化的组织相容性细胞的方法还包括以下步骤：(i)将abo基因的指导rna靶序列引入所述细胞中，所述指导rna靶序列包含选自由表a-表c中的那些序列组成的组中的一个；以及(ii)选择工程化细胞，其中abo基因是部分或完全失活的。在一些实施方案中，指导rna靶序列包含seq id no：1-3。

92、在一些实施方案中，用于生成工程化的组织相容性细胞的方法还包括以下步骤；(i)将用于产生abo基因的外显子6 258delg变异的指导rna靶序列和hdr模板引入所述细胞中，所述指导rna靶序列包含选自由seq id no：3-5中的那些序列组成的组中的一个，所述hdr模板包含编码258delg变异的序列、pam序列、间隔子区和两个同源臂，每个同源臂包含约10个核苷酸到约1kb的所述abo基因的同源序列；以及(ii)选择工程化细胞，其中abo基因是部分或完全失活的。

93、在一些实施方案中，hdr模板还包含在pam序列和/或间隔子区中的一个或多个沉默突变，以确保hdr模板不被cas9切割。

94、在一些实施方案中，指导rna靶序列包含选自由seq id no：3-5组成的组中的一个，并且hdr模板包含选自由seq id no：6-8组成的组中的一个。在一些方面，本文提供了一种生成工程化的组织相容性细胞的方法，所述方法包括：(a)获得分离的细胞；(b)将cas9核酸酶和fut1基因的指导rna靶序列引入细胞中，所述指导rna靶序列包含选自由表g-表i中的那些序列组成的组中的一个；以及(c)选择工程化细胞，其中fut1基因是部分或完全失活的。

95、在一些实施方案中，指导rna靶序列包含seq id no：13或seq id no：14。

96、在一些实施方案中，生成工程化的组织相容性细胞的方法还包括以下步骤：(i)将rhd基因的指导rna靶序列引入所述细胞中，所述指导rna靶序列包含选自由表d-表f中的那些序列组成的组中的一个；以及(ii)选择工程化细胞，其中rhd基因是部分或完全失活的。

97、在一些实施方案中，指导rna靶序列包含seq id no：9或seq id no：10。

98、在一些实施方案中，指导rna靶序列包含seq id no：11并且另一个指导rna靶序列包含seq id no：12。

99、在一些实施方案中，分离的细胞是分离的人类细胞。

100、在一些实施方案中，分离的细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、诱导多能干细胞、胚胎干细胞(例如rues2或h9细胞)、多能干细胞(multipotent stem cell)、成体干细胞和分化细胞。

101、在一些实施方案中，分离的细胞包含编码一种或多种mhc-i的转录调节因子的一种或多种部分或完全失活的基因和/或编码一种或多种mhc-ii的转录调节因子的一种或多种部分或完全失活的基因。

102、在一些实施方案中，分离的细胞包含部分或完全失活的b2m基因。

103、在一些其他实施方案中，根据上述方法使用的分离的细胞还包含部分或完全失活的ciita基因。在一些其他实施方案中，分离的细胞包含cd47转基因。在一些其他实施方案中，分离的细胞包含部分或完全失活的b2m和ciita基因以及cd47转基因。

104、在一些其他方面，本文提供了一种制备分化细胞的方法，所述方法包括在分化条件下培养根据上述方法制备的干细胞，从而制备分化细胞。在一些实施方案中，分化条件适合于将干细胞分化成选自由以下组成的组的细胞类型：心肌细胞、肝细胞、肾细胞、胰腺细胞、神经细胞、免疫细胞、间充质细胞和内皮细胞。

105、在一些其他方面，本文提供了一种治疗需要细胞替代疗法的患者的方法，所述方法包括施用根据上述方法制备的分化细胞群。

106、在一些方面，本文提供了一种源自rues2细胞系的分离的细胞，其中所述分离的细胞包含以下中之一种或两种：(a)使分离的细胞组织血型为o的修饰；和(b)使分离的细胞为rh阴性的修饰。

107、在一些其他实施方案中，使分离的细胞组织血型为o的修饰降低或消除了abo组织血型b抗原的抗原性。

108、在一些其他实施方案中，其中修饰包括通过abo基因的有害变异或通过插入abo基因的外显子6 258delg变异而部分或完全失活的abo基因的表达。

109、在一些其他实施方案中，abo基因的表达因abo基因的外显子1的acacct内；外显子2的agtgcg内；或外显子8的caagcgc、ggcgca、tgggcg、accacg、gccgca、ccacgt、tgccgt、tactcg、actcgg、gagcgc、gcctgg、gtcctt、tcacgc、tggacg、tggtcg、gctggc、cacgcg、aggtga或gcatcg内的插入或缺失而部分或完全失活。

110、在一些其他实施方案中，abo基因的有害变异是使用包含指导rna靶序列的crispr-cas9基因编辑产生的，所述指导rna靶序列包含选自由表a-表c中的那些序列组成的组中的一个。

111、在一些其他实施方案中，abo基因的有害变异包括编码外显子中的插入或缺失，并且指导rna靶序列包含seq id no：1或seq id no：2。

112、在一些其他实施方案中，abo基因的有害变异包括移码插入/缺失并且指导rna靶序列包含seq id no：3。

113、在一些其他实施方案中，abo基因的有害变异是纯合变异。

114、在一些其他实施方案中，abo基因的外显子6 258delg变异是使用crispr-cas9基因编辑产生的，所述crispr-cas9基因编辑包含指导rna靶序列和hdr模板，所述指导rna靶序列包含选自由seq id no：3-5中的那些序列组成的组中的一个，所述hdr模板包含编码258delg变异的序列、pam序列、间隔子区和两个同源臂，每个同源臂包含约10个核苷酸到约1kb的所述abo基因的同源序列。

115、在一些其他实施方案中，hdr模板还包含在pam序列和/或间隔子区中的一个或多个沉默突变，以确保hdr模板不被cas9切割。

116、在一些其他实施方案中，其中abo基因的外显子6 258delg变异是使用crispr-cas9基因编辑产生的，所述crispr-cas9基因编辑包含有包含选自由seq id no：3-5组成的组中的一个的指导rna靶序列，并且hdr模板包含选自由seq id no：6-8组成的组中的一个。

117、在一些其他实施方案中，abo基因的外显子6 258delg变异是纯合变异。

118、在一些其他实施方案中，使分离的细胞为rh阴性的修饰包括通过fut1基因的有害变异而使fut1基因的表达部分或完全失活。

119、在一些其他实施方案中，fut1基因的表达因fut1基因的外显子4的atcgac、agtacg、cgccct、gtttgc、cgacaa、ggtgcg、cgccgt、acgccg、ccggtt、cgcggg、ttttcg、ataccg、gtgcgc、ccattg、tgtcgg、atctgc、ctttgt、ggggcc、ggccat、tgcgat、cgtgca或atggac内的插入或缺失而部分或完全失活。

120、在一些其他实施方案中，fut1基因的有害变异是使用包含指导rna靶序列的crispr-cas9基因编辑产生的，所述指导rna靶序列包含选自由表g-表i中的那些序列组成的组中的一个。

121、在一些其他实施方案中，有害变异包括fut1基因的外显子4中的缺失和包含seqid no：13或seq id no：14的指导rna靶序列。

122、在一些其他实施方案中，使分离的细胞为rh阴性的修饰降低或消除了一种或多种恒河猴因子抗原的抗原性。

123、在一些其他实施方案中，修饰包括通过rhd基因的有害变异而使rhd基因的表达部分或完全失活。

124、在一些其他实施方案中，rhd基因的表达因rhd基因的外显子2的tcatgg、gaggtg、aactcg、agtttc、ttggct或cacagc内；外显子3的ccgtga内；外显子4的gggtag或agggaa内；外显子5的ttcgat、tcagcg、catagt或atcgaa内；外显子6的cgtcgg或tccgtc内；外显子7的cggcaa、cggagc、taccgt、gcttgc或cttgct内；或外显子8的ggttct或tcctac内的插入或缺失而部分或完全失活。

125、在一些其他实施方案中，rhd基因的有害变异是通过使用包含一个或多个指导rna靶序列的crispr-cas9基因编辑产生的，所述指导rna靶序列包含选自由表d-表f中的那些序列组成的组中的一个。

126、在一些其他实施方案中，有害变异包括缺失包含rhd基因的外显子1-8的基因组区以及包含seq id no：11的指导rna靶序列和包含seq id no：12的另一个指导rna。

127、在一些其他实施方案中，rhd基因的有害变异包括移码插入/缺失并且指导rna靶序列包含seq id no：9或seq id no：10。

128、在一些实施方案中，上文所述的分离的细胞还包含编码一种或多种mhc-i的转录调节因子的一种或多种部分或完全失活的基因和/或编码一种或多种mhc-ii的转录调节因子的一种或多种部分或完全失活的基因。

129、在一些实施方案中，分离的细胞包含部分或完全失活的b2m基因。在一些其他实施方案中，根据上述方法使用的分离的细胞还包含部分或完全失活的ciita基因。在一些其他实施方案中，分离的细胞包含cd47转基因。在一些其他实施方案中，分离的细胞包含部分或完全失活的b2m和ciita基因以及cd47转基因。

130、在一些方面，本文提供了一种生成工程化的组织相容性细胞的方法，所述方法包括：(a)获得分离的rues2细胞或其衍生物；(b)将cas9核酸酶和abo基因的指导rna靶序列引入细胞中，所述指导rna靶序列包含选自由表a-表c中的那些序列组成的组中的一个；以及(c)选择工程化细胞，其中abo基因是部分或完全失活的。

131、在一些其他实施方案中，指导rna靶序列包含选自由seq id no：1-3组成的组中的一个。

132、在一些其他实施方案中，用于生成工程化的组织相容性细胞的方法还包括以下步骤：(i)将rhd基因的指导rna靶序列引入所述细胞中，所述指导rna靶序列包含选自由表d-表f中的那些序列组成的组中的一个；以及(ii)选择工程化细胞，其中rhd基因是部分或完全失活的。

133、在一些其他实施方案中，指导rna靶序列包含seq id no：11并且另一个指导rna包含seq id no：12。

134、在一些其他实施方案中，指导rna靶序列包含seq id no：9或seq id no：10。

135、在一些方面，本文提供了一种生成工程化的组织相容性细胞的方法，所述方法包括：(a)获得分离的rues2细胞或其衍生物；(b)将cas9核酸酶和用于产生abo基因的外显子6258delg变异的指导rna靶序列和hdr模板引入所述细胞中，所述指导rna靶序列包含选自由seq id no：3-5中的那些序列组成的组中的一个，所述hdr模板包含编码258delg变异的序列、pam序列、间隔子区和两个同源臂，每个同源臂包含约10个核苷酸到约1kb的所述abo基因的同源序列；以及(c)选择工程化细胞，其中abo基因是部分或完全失活的。

136、在一些其他实施方案中，hdr模板还包含在pam序列和/或间隔子区中的一个或多个沉默突变，以确保hdr模板不被cas9切割。

137、在一些其他实施方案中，指导rna靶序列包含选自由seq id no：3-5组成的组中的一个，并且hdr模板包含选自由seq id no：6-8组成的组中的一个。

138、在一些其他实施方案中，所述方法还包括以下步骤：(i)将rhd基因的指导rna靶序列引入所述细胞中，所述指导rna靶序列包含选自由表d-表f中的那些序列组成的组中的一个；以及(ii)选择工程化细胞，其中rhd基因是部分或完全失活的。

139、在一些其他实施方案中，指导rna靶序列包含seq id no：11并且另一个指导rna包含seq id no：12。

140、在一些其他实施方案中，指导rna靶序列包含seq id no：9或seq id no：10。

141、在一些方面，本文提供了一种生成工程化的组织相容性细胞的方法，所述方法包括：(a)获得分离的rues2细胞或其衍生物；(b)将cas9核酸酶和rhd基因的指导rna靶序列引入细胞中，所述指导rna靶序列包含选自由表d-表f中的那些序列组成的组中的一个；以及(c)选择工程化细胞，其中rhd基因是部分或完全失活的。

142、在一些其他实施方案中，指导rna靶序列包含seq id no：11并且另一个指导rna包含seq id no：12。

143、在一些其他实施方案中，指导rna靶序列包含seq id no：9或seq id no：10。

144、在一些其他实施方案中，所述方法还包括以下步骤：(i)将abo基因的指导rna靶序列引入所述细胞中，所述指导rna靶序列包含选自由表a-表c中的那些序列组成的组中的一个；以及(ii)选择工程化细胞，其中abo基因是部分或完全失活的。

145、在一些实施方案中，指导rna靶序列包含seq id no：1-3。

146、在一些其他实施方案中，所述方法还包括以下步骤：(i)将用于产生abo基因的外显子6 258delg变异的指导rna靶序列和hdr模板引入所述细胞中，所述指导rna靶序列包含选自由seq id no：3-5中的那些序列组成的组中的一个，所述hdr模板包含编码258delg变异的序列、pam序列、间隔子区和两个同源臂，每个同源臂包含约10个核苷酸到约1kb的所述abo基因的同源序列；以及(ii)选择工程化细胞，其中abo基因是部分或完全失活的。

147、在一些其他实施方案中，hdr模板还包含在pam序列和/或间隔子区中的一个或多个沉默突变，以确保hdr模板不被cas9切割。

148、在一些其他实施方案中，指导rna靶序列包含选自由seq id no：3-5组成的组中的一个，并且hdr模板包含选自由seq id no：6-8组成的组中的一个。

149、在一些方面，本文提供了一种生成工程化的组织相容性细胞的方法，所述方法包括：(a)获得分离的rues2细胞或其衍生物；(b)将cas9核酸酶和fut1基因的指导rna靶序列引入细胞中，所述指导rna靶序列包含选自由表g-表i中的那些序列组成的组中的一个；以及(c)选择工程化细胞，其中fut1基因是部分或完全失活的。

150、在一些其他实施方案中，指导rna靶序列包含seq id no：13或seq id no：14。

151、在一些其他实施方案中，所述方法还包括以下步骤：(i)将rhd基因的指导rna靶序列引入所述细胞中，所述指导rna靶序列包含选自由表d-表f中的那些序列组成的组中的一个；以及(ii)选择工程化细胞，其中rhd基因是部分或完全失活的。

152、在一些其他实施方案中，指导rna靶序列包含seq id no：9或seq id no：10。

153、在一些其他实施方案中，指导rna靶序列包含seq id no：11并且另一个指导rna靶序列包含seq id no：12。

154、在一些其他实施方案中，分离的细胞还包含编码一种或多种mhc-i的转录调节因子的一种或多种部分或完全失活的基因和/或编码一种或多种mhc-ii的转录调节因子的一种或多种部分或完全失活的基因。

155、在一些其他实施方案中，分离的细胞包含部分或完全失活的b2m基因。

156、在一些其他实施方案中，分离的细胞包含部分或完全失活的ciita基因。

157、在一些其他实施方案中，分离的细胞包含cd47转基因。在一些其他实施方案中，分离的细胞包含部分或完全失活的b2m和ciita基因以及cd47转基因。

158、在一些方面，本文提供了一种制备分化细胞的方法，所述方法包括在分化条件下培养根据上述方法中的任一种制备的工程化的组织相容性细胞，从而制备分化细胞。

159、在一些其他实施方案中，分化条件适合于将干细胞分化成选自由以下组成的组的细胞类型：心肌细胞、肝细胞、肾细胞、胰腺细胞、神经细胞、免疫细胞、间充质细胞和内皮细胞。

160、在一些其他方面，本文提供了一种治疗需要细胞替代疗法的患者的方法，所述方法包括施用根据上述方法中的任一种制备的分化细胞群。

161、在2015年5月9日提交的wo2016183041和2018年1月14日提交的wo2018132783中发现了低免疫原性细胞、其生产方法和其使用方法的详细描述，包括序列表和附图的公开内容以引用的方式整体并入本文。

162、本发明的其他目的、优点和实施方案将从下面的详细描述中显而易见。