靶向RNA结合蛋白位点的寡核苷酸的制作方法

背景技术：

1、tar dna结合蛋白43(tdp-43)是一种多功能的rna/dna结合蛋白，参与rna相关代谢。tdp-43沉积物的失调作为运动神经元疾病：肌萎缩侧索硬化(als)和额颞叶变性(ftld)患者大脑和脊髓中的包涵体(prasad等人，front.mol.neurosci.,2019)。

2、tdp-43主要位于细胞核中，但也因其某些功能穿梭于细胞质中(ayala等人，2008)。在疾病中，诸如在als和ftld中，细胞质tdp-43浓度的增加导致细胞质包涵体形成(neumann等人，2006；winton等人，2008a)。细胞质错误定位可能与核耗竭有关，导致tdp-43功能减少或丢失。存在导致tdp-43靶rna异常剪接的tdp-43突变，导致广泛的剪接畸变(参见例如arnold等人，pnas 2013 110e736–745和yang等人，pnas.u.s.a.111,e1121–e1129)。

3、klim等人报告说，stmn2在tdp-43功能降低时的丢失是由于stmn2剪接改变所致，并建议将恢复stmn2作为als的治疗策略。

4、tdp-43耗竭在一系列疾病中表现出来，称为tdp-43病理，并包括诸如以下的疾病：肌萎缩侧索硬化(als)、额颞叶变性(ftld)、进行性核上麻痹(psp)、原发性侧索硬化症、进行性肌萎缩、阿尔茨海默病、帕金森病、孤独症、海马硬化性痴呆、唐氏综合征、亨廷顿病、多聚谷氨酰胺疾病，诸如脊髓小脑性共济失调3、肌病和慢性创伤性脑病。

5、tollervey等人，nature neuroscience 2010,452-458报告了健康脑组织和ftld患者脑组织中tdp-43的rna靶标和位置依赖性剪接调节的特征。大多数tdp-43结合位点映射到内含子、长链非编码rna(lncrna)和基因间转录本，这些位点富含ug丰富的基序。tdp-43中的保守rnp片段参与结合具有ug重复的tar dna序列和rna序列(ayala等人，j.mol.biol.2005；348:575–588)。细胞中的tdp-43耗竭，诸如tdp病理学中的tdp-43耗竭与tdp-43与tdp-43rna靶标的rna结合丢失相关。

6、人rna中的tdp-43结合位点可从rna结合蛋白和相关基序的数据库在线获得——参见https://attract.cnic.es/results/e9f29380-8921-406e-84a8-27ce9b9398b4#。公开的某些表征的人rna tdp-43结合位点包括以下rna序列：gugaauga、guugugc、ugugugugugug(seq id no 20)、gaaugg、ugugugug、gaauga、ugugug、guuguuc和guuuugc。

7、melamed等人报告了过早多腺苷酸化介导的stmn2丢失作为tdp-43神经变性的标志。wo2019/241648公开了用于增加stmn2表达的2'o-甲氧基乙基aso。

8、本发明人已经鉴定出以下的反义寡核苷酸：其与tdp-43核酸结合位点互补，诸如完全互补，并且能够恢复在显示tdp-43功能丢失的细胞中失调的tdp-43rna转录本靶标的加工和调节，例如rna转录本的表达和剪接，从而提供了一种在tdp-43耗竭的细胞(即tdp-43功能丢失的细胞)中恢复tdp-43功能的新方法，以及一种用于治疗tdp-43病理的新的治疗方法。

9、发明目的

10、本发明涉及与前体mrna转录本上的保守tdp-43结合位点互补的反义寡核苷酸，其能够在tdp-43耗竭的细胞中的多个独立mrna的加工中恢复rna结合蛋白功能。

11、本发明提供了用于在功能性tdp-43水平降低的细胞中恢复rna结合蛋白功能，诸如tdp-43功能或tdp-43样功能的寡核苷酸。

12、本发明提供了能够在一种或多种tdp-43靶rna的rna加工或表达中恢复tdp-43的核功能的寡核苷酸，从而至少部分恢复或增强一种或多种tdp-43靶rna的功能表型。此类寡核苷酸化合物在本文中称为rna结合蛋白模拟物，诸如tdp-43模拟物。

13、本发明提供了与tdp-43结合位点互补的反义寡核苷酸，以及它们在治疗(诸如用于治疗tdp-43病理)中的用途。

14、本发明进一步提供了与多个rna转录本(即从不同基因座转录的rna转录本)上的tdp-43结合位点互补的寡核苷酸。多个rna转录本可以例如独立地选自由前体mrna、mrna和lncrna组成的组。

技术实现思路

1、本发明提供了一种长度为8个至40个核苷酸的反义寡核苷酸，其包含长度为至少8个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与选自由以下项组成的组的序列互补，诸如完全互补：(5’–3’)(ug)n、(gu)n，其中n为4–20、ugugugug、ugugugugu、ugugugugug(seqid no 37)、ugugugugugu(seq id no 38)、ugugugugugug(seq id no 35)、ugugugugugugu(seq id no 39)、gugugugu、gugugugug、gugugugugu(seq id no 40)、gugugugugug(seq idno 41)、gugugugugugu(seq id no 42)、gugugugugugug(seq id no 43)和gugaauga，其中反义寡核苷酸能够在tdp-43耗竭的细胞，诸如表达异常tdp-43蛋白的细胞中恢复一种或多种tdp-43靶rna的功能表型；或其药用盐。

2、连续核苷酸序列可包含一个或多个经修饰的核苷。

3、如背景部分所述，功能性tdp-43主要是一种核定位蛋白，可能存在于细胞质中。然而，tdp-43在细胞质中的聚集，即所谓的细胞质包涵体(也称为异常tdp-43)，与无功能性的tdp-43有关，这与例如在大量前体mrna的加工中的核tdp-43功能的丢失有关。因此，在细胞质包涵体中表达tdp-43的细胞被认为是tdp-43耗竭的。

4、反义寡核苷酸可以是分离的反义寡核苷酸或纯化的寡核苷酸。本发明的反义寡核苷酸是制造的(人造的)反义寡核苷酸。

5、功能表型可以例如是由功能性tdp-43(即非异常tdp-43，通常是核tdp-43)调节或依赖于功能性tdp-43和/或其保真度取决于功能性tdp-43的rna加工事件。因此，可以通过评估由功能性tdp-43调节或依赖于功能性tdp-43的rna加工事件(如例如本文展示，参考stmn2、arhgap32、slc5a7、cert1、camk2b、kalrn和unc13a rna加工)的保真度来评估使用本发明的反义寡核苷酸增强tdp-43功能。

6、本发明提供了一种长度为8个至40个核苷酸的反义寡核苷酸，其包含长度为至少8个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与选自由以下项组成的组的序列具有至少75％的互补性，诸如至少90％的互补性或100％的互补性：(5'–3')(ug)n、(gu)n，其中n为4–20、ugugugug,ugugugugu,ugugugugug(seq id no 37),ugugugugugu(seq id no 38),ugugugugugug(seq id no 35),ugugugugugugu(seq id no 39),gugugugu,gugugugug,gugugugugu(seq id no 40),gugugugugugu(seq id no 42),gugugugugugug(seq id no43)和gugaauga，或其药用盐从，其在医药中的用途。

7、连续核苷酸序列可包含一个或多个经修饰的核苷。

8、本发明提供了一种长度为8个至40个核苷酸的反义寡核苷酸，其包含长度为至少8个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与选自由以下项组成的组的序列具有至少75％的互补性，诸如至少90％的互补性或100％的互补性：(5'–3')(ug)n、(gu)n，其中n为4–20、ugugugug,ugugugugu,ugugugugug(seq id no 37),ugugugugugu(seq id no 38),ugugugugugug(seq id no 35),ugugugugugugu(seq id no 39),gugugugu,gugugugug,gugugugugu(seq id no 40),gugugugugugu(seq id no 42),gugugugugugug(seq id no43)和gugaauga，或其药用盐，其在治疗以tdp-43病理为特征的疾病中的用途。

9、连续核苷酸序列可包含一个或多个经修饰的核苷。

10、有利地，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含至少12个或至少13个连续核苷酸，其与序列ugugugugugug(seq id no 35)、或gugugugugugu(seq id no 42)、或ugugugugugugu(seq id no 39)、或gugugugugugug(seq id no 43)互补，诸如完全互补。

11、在一些实施例中，反义寡核苷酸或连续核苷酸序列包含至少14个连续核苷酸，其与序列ugugugugugugug(seq id no 46)或gugugugugugugu(seq id no 47)互补，诸如完全互补。

12、在一些实施例中，反义寡核苷酸或连续核苷酸序列包含至少18个连续核苷酸，其与序列(ug)n或(gu)n(其中n是6-20的整数，诸如7-9)互补，诸如完全互补。

13、在一些实施例中，反义寡核苷酸或连续核苷酸序列包含至少18个连续核苷酸，其与序列ugugugugugugugugug(seq id no 48)或gugugugugugugugugu(seq id no 49)互补，诸如完全互补。

14、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列cacacaca或acacacac。

15、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列cacacacacaca(seq id no 14)或acacacacacac(seq id no 5)。

16、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列cacacacacacac(seq id no 15)或acacacacacaca(seq id no 6)。

17、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列cacacacacacacaca(seq id no 16)或acacacacacacacac(seq id no 7)。

18、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 20)。

19、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 21)。

20、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 22)。

21、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 23)。

22、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 24)。

23、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 25)。

24、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 26)。

25、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 27)。

26、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 28)。

27、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 29)。

28、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 30)。

29、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 31)。

30、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 32)。

31、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 33)。

32、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 34)。

33、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 50)。

34、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 51)。

35、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 52)。

36、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 53)。

37、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 54)。

38、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 55)。

39、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 56)。

40、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 57)。

41、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 58)。

42、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 59)。

43、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 60)。

44、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 61)。

45、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 62)。

46、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 63)。

47、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 64)。

48、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 65)。

49、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 66)。

50、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 67)。

51、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 68)。

52、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 69)。

53、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 70)。

54、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 71)。

55、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 72)。

56、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 73)。

57、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 74)。

58、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 75)。

59、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 76)。

60、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 77)。

61、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 78)。

62、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 79)。

63、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 80)。

64、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 81)。

65、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 82)。

66、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 83)。

67、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 84)。

68、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 85)。

69、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 86)。

70、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 87)。

71、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 88)。

72、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 89)。

73、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 90)。

74、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 91)。

75、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 92)。

76、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 93)。

77、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 94)。

78、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 95)。

79、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 96)。

80、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 97)。

81、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 98)。

82、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 99)。

83、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 100)。

84、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 101)。

85、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 102)。

86、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(seqid no 103)。

87、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含序列(ca)n或(ac)n，其中n是6-20的整数，诸如7-9。

88、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含选自由seq id no 1-18组成的组的序列或选自seq id no 1-34和seq id no 50-103的序列。

89、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列由以下序列组成：选自由seq id no 1-18组成的组的序列或选自seq id no 1-34和seq id no 50-103的序列。

90、本发明提供了一种选自由化合物id no#1至18组成的组的反义寡核苷酸或其药用盐。因此，本发明的寡核苷酸可以是选自由化合物id no#1至18组成的组的反义寡核苷酸或其药用盐。

91、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸具有至少12个或至少13个核苷酸的长度。

92、在一些实施例中，反义寡核苷酸的连续核苷酸序列的长度为至少12个核苷酸。

93、在一些实施例中，根据本发明的任何方面的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列具有至少12个连续核苷酸的长度。

94、在一些实施例中，根据本发明的任何方面的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列具有至少13个连续核苷酸的长度。

95、在一些实施例中，根据本发明的任何方面的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列具有至少14个连续核苷酸的长度。

96、在一些实施例中，根据本发明的任何方面的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列具有至少15个连续核苷酸的长度。

97、在一些实施例中，根据本发明的任何方面的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列具有至少16个连续核苷酸的长度。

98、在一些实施例中，根据本发明的任何方面的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列具有至少17个连续核苷酸的长度。

99、在一些实施例中，根据本发明的任何方面的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列具有至少18个连续核苷酸的长度。

100、在一些实施例中，根据本发明的任何方面的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列具有至少19个连续核苷酸的长度。

101、在一些实施例中，根据本发明的任何方面的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列具有至少20个连续核苷酸的长度。

102、在一些实施例中，根据本发明的任何方面的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列具有至少21个连续核苷酸的长度。

103、在一些实施例中，根据本发明的任何方面的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列具有至少22个连续核苷酸的长度。

104、在一些实施例中，根据本发明的任何方面的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列具有至少23个连续核苷酸的长度。

105、在一些实施例中，根据本发明的任何方面的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列具有至少24个连续核苷酸的长度。

106、在一些实施例中，根据本发明的任何方面的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列具有至少25个连续核苷酸的长度。

107、在一些实施例中，根据本发明的任何方面的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列具有至少26个连续核苷酸的长度。

108、在一些实施例中，根据本发明的任何方面的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列具有至少27个连续核苷酸的长度。

109、在一些实施例中，根据本发明的任何方面的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列具有至少28个连续核苷酸的长度。

110、在一些实施例中，根据本发明的任何方面的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列具有至少29个连续核苷酸的长度。

111、在一些实施例中，根据本发明的任何方面的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列具有至少30个连续核苷酸的长度。

112、在一些实施例中，根据本发明的任何方面的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列具有至少31个连续核苷酸的长度。

113、在一些实施例中，根据本发明的任何方面的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列具有至少32个连续核苷酸的长度。

114、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸具有低于约-10δg，诸如低于约-15δg，诸如低于约-17δg的反义寡核苷酸对互补靶rna的吉布斯自由能。有利地，此类反义寡核苷酸的连续核苷酸序列的长度为至少12个，例如至少13个核苷酸。

115、有利地，本发明的反义寡核苷酸可包含一个或多个经修饰的核苷。

116、有利地，本发明的反义寡核苷酸可以包含lna核苷。连续核苷酸序列中的lna核苷酸更有利。在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸可包含lna核苷和非lna核苷，诸如dna核苷。在一些实施例中，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列可包含lna核苷和dna核苷。在一些实施例中，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列的所有核苷独立地选自lna和dna核苷。有利地，存在于反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的连续dna核苷的长度受到限制，以防止导致靶rna降解的rna酶h募集。合适地，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列不包含超过四个连续dna核苷，更有利地不包含超过3个连续dna核苷。

117、当使用时，有利地，根据本发明的反义寡核苷酸能够调节两种或更多种tdp-43靶前体mrna(靶rna)的剪接。举例来说，两种或更多种tdp-43靶rna可以独立地选自由以下项组成的组：stmn2前体mrna、arhgap32前体mrna、slc5a7前体mrna、cert1前体mrna、camk2b前体mrna、kalrn前体和unc13a前体mrna。

118、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸能够调节两种或更多种tdp-43靶前体mrna(靶rna)的剪接。

119、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸能够调节三种或更多种tdp-43靶前体mrna(靶rna)的剪接。

120、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸能够调节四种或更多种tdp-43靶前体mrna(靶rna)的剪接。

121、在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸能够调节两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种tdp-43靶前体mrna(靶rna)的剪接。

122、在一些实施例中，当施用于tdp-43耗竭的细胞时，反义寡核苷酸能够增强stmn2(野生型)的表达，并且进一步能够增强选自由以下项组成的组的至少一种，诸如两种或更多种前体mrna的前体mrna剪接的保真度：arhgap32前体mrna、slc5a7前体mrna、cert1前体mrna、camk2b前体mrna、kalrn前体mrna和unc13a前体mrna。在一些实施例中，两种或更多种选定的前体mrna选自由以下项组成的组：stmn2和arhgap32；stmn2和slc5a7；stmn2和cert1；arhgap32和slc5a7；arhgap32和cert1；以及slc5a7和cert1。

123、在一些实施例中，当用于tdp-43耗竭的细胞时，反义寡核苷酸施能够增强选自由以下项组成的组的两种或更多种前体mrna的前体mrna剪接的保真度：stmn2前体mrna、arhgap32前体mrna、slc5a7前体mrna、cert1前体mrna、camk2b前体mrna、kalrn前体mrna和unc13a前体mrna。在一些实施例中，两种或更多种选定的前体mrna选自由以下项组成的组：stmn2和arhgap32；stmn2和slc5a7；stmn2和cert1；arhgap32和slc5a7；arhgap32和cert1；以及slc5a7和cert1。

124、在一些实施例中，当施用于tdp-43耗竭的细胞时，反义寡核苷酸能够增强选自由以下项组成的组的三种或更多种前体mrna的前体mrna剪接的保真度：stmn2前体mrna、arhgap32前体mrna、slc5a7前体mrna、cert1前体mrna、camk2b前体mrna、kalrn前体mrna和unc13a前体mrna。

125、在一些实施例中，两种或更多种选定的前体mrna选自由以下项组成的组：stmn2和arhgap32；stmn2和slc5a7；以及stmn2和cert1前体mrna。

126、在一些实施例中，当施用于tdp-43耗竭的细胞时，反义寡核苷酸能够增强以下项的前体mrna剪接的保真度：stmn2前体mrna、arhgap32前体mrna、slc5a7前体mrna、cert1前体mrna、camk2b前体mrna、kalrn前体mrna和unc13a前体mrna。

127、在一些实施例中，当施用于表达stmn2前体mrna的tdp-43耗竭的细胞时，反义寡核苷酸能够增加stmn2的表达。

128、在一些实施例中，当施用于表达stmn2前体mrna的tdp-43耗竭的细胞时，与具有连续外显子1/外显子2结点的野生型stmn2成熟mrna相比，反义寡核苷酸能够降低在外显子1和外显子2之间包含隐蔽外显子(ce1)的stmn2成熟mrna的比例。

129、在一些实施例中，当施用于表达arhgap32前体mrna的tdp-43耗竭的细胞时，反义寡核苷酸能够降低异常剪接的arhgap32成熟mrna的水平。

130、在一些实施例中，当施用于表达slc5a7前体mrna的tdp-43耗竭的细胞时，反义寡核苷酸能够降低slc5a7 mrna转录本中异常外显子包涵体的水平。

131、在一些实施例中，当施用于表达cert1前体mrna的tdp-43耗竭的细胞时，反义寡核苷酸能够降低cert1 mrna转录本中异常外显子包涵体的水平。

132、在一些实施例中，当施用于表达camk2b前体mrna的tdp-43耗竭的细胞时，反义寡核苷酸能够降低camk2b mrna转录本中异常外显子包涵体的水平。

133、在一些实施例中，当施用于表达kalrn前体mrna的tdp-43耗竭的细胞时，反义寡核苷酸能够降低kalrn mrna转录本中异常外显子包涵体的水平。

134、在一些实施例中，当施用于表达unc13a前体mrna的tdp-43耗竭的细胞时，反义寡核苷酸能够降低unc13a mrna转录本中异常外显子包涵体的水平。

135、在一些实施例中，反义寡核苷酸能够纠正tdp-43耗竭的细胞中stmn2、cert1、slc5a7、arhgap32、camk2b、kalrn和unc13a前体mrna中的两个或更多个的异常剪接。

136、在一些实施例中，反义寡核苷酸不包含超过3个或超过4个连续dna核苷的区域。

137、在一些实施例中，反义寡核苷酸不能介导rna酶h切割。

138、在一些实施例中，反义寡核苷酸为吗啉代反义寡核苷酸。

139、在一些实施例中，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含一种或多种亲和力增强核苷，诸如2'糖修饰的核苷，其增强反义寡核苷酸与互补rna分子之间的结合亲和力，例如且有利地，以提供较低的吉布斯自由能，诸如低于-10的吉布斯自由能，诸如低于-15的吉布斯自由能。

140、在一些实施例中，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含一种或多种经修饰的核苷，诸如一种或多种亲和力增强的2'糖修饰的核苷，诸如独立地选自由以下项组成的组的2'糖修饰的核苷：2'-o-烷基-rna；2'-o-甲基rna(2'-ome)；2'-烷氧基-rna；2'-o-甲氧基乙基-rna(2'-moe)；2'-氨基-dna；2'-氟-rna；2'-氟-dna；阿拉伯核酸(ana)；2'-氟-ana；锁核酸(lna)或其组合。

141、在一些实施例中，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含2'-o-甲氧基乙基-rna(2'-moe)核苷。在一些实施例中，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列的所有核苷均为2'-o-甲氧基乙基-rna(2'-moe)核苷，其任选地通过硫代磷酸酯核苷间键合连接。

142、在一些实施例中，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含2'-o-甲基核苷。在一些实施例中，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列的所有核苷均为2'-o-甲基核苷，其任选地通过硫代磷酸酯核苷间键合连接。

143、在一些实施例中，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的一个或多个经修饰的核苷是锁核酸核苷(lna)，诸如选自由受限的乙基核苷(cet)或β-d-氧基-lna组成的组的lna核苷。

144、在一些实施例中，反义寡核苷酸的连续核苷酸序列包含核苷lna核苷和dna核苷，其任选地通过硫代磷酸酯核苷间键合连接。

145、在一些实施例中，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列为混聚物或全聚物。

146、在一些实施例中，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含选自由seq id no 1-18组成的组的核碱基序列、选自seq id no 1-34和seq id no 50-103的序列、或其至少8个连续核苷酸。

147、在一些实施例中，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含选自由seq id no 1-18组成的组的核碱基序列、选自seq id no 1-34和seq id no 50-103的序列、或其至少9个连续核苷酸。

148、在一些实施例中，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含选自由seq id no 1-18组成的组的核碱基序列、选自seq id no 1-34和seq id no 50-103的序列、或其至少10个连续核苷酸。

149、在一些实施例中，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含选自由seq id no 1-18组成的组的核碱基序列、选自seq id no 1-34和seq id no 50-103的序列、或其至少11个连续核苷酸。

150、在一些实施例中，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含选自由seq id no 1-18组成的组的核碱基序列、选自seq id no 1-34和seq id no 50-103的序列、或其至少12个连续核苷酸。

151、在一些实施例中，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含选自由seq id no 1-18组成的组的核碱基序列、选自seq id no 1-34和seq id no 50-103的序列、或其至少13个连续核苷酸。

152、在一些实施例中，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含选自由seq id no 1-18组成的组的核碱基序列、选自seq id no 1-34和seq id no 50-103的序列、或其至少14个连续核苷酸。

153、在一些实施例中，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含选自由seq id no 1-18组成的组的核碱基序列、选自seq id no 1-34和seq id no 50-103的序列、或其至少15个连续核苷酸。

154、在一些实施例中，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含选自由seq id no 1-18组成的组的核碱基序列、选自seq id no 1-34和seq id no 50-103的序列、或其至少16个连续核苷酸。

155、在一些实施例中，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含选自由seq id no 1-18组成的组的核碱基序列、选自seq id no 1-34和seq id no 50-103的序列、或其至少17个连续核苷酸。

156、在一些实施例中，其中存在于反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的胞嘧啶碱基独立地选自由以下项组成的组：胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶。

157、在一些实施例中，存在于反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的胞嘧啶碱基是5-甲基胞嘧啶。

158、在一些实施例中，存在于反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的lna胞嘧啶碱基是lna 5-甲基胞嘧啶。

159、在一些实施例中，存在于反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的lna胞嘧啶碱基是lna 5-甲基胞嘧啶，并且dna胞嘧啶碱基是胞嘧啶。

160、有利地，位于连续核苷酸序列上的核苷之间的一个或多个核苷间键合被修饰。在一些实施例中，位于连续核苷酸序列上的核苷之间的至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％的核苷间键合被修饰。

161、在一些实施例中，一个或多个或所有经修饰的核苷间键合是硫代磷酸酯键合。在一些实施例中，连续核苷酸序列内的一个或多个或所有的键合是硫代磷酸酯键合。

162、在一些实施例中，连续核苷酸序列中存在的所有核苷间键合均为硫代磷酸酯核苷间键合。

163、在一些实施例中，反义寡核苷酸中存在的所有核苷间键合均为硫代磷酸酯核苷间键合。

164、在一些实施例中，连续核苷酸序列的长度为8-32个核苷酸。

165、在一些实施例中，连续核苷酸序列的长度为8-20个核苷酸。

166、在一些实施例中，连续核苷酸序列的长度为12-18个核苷酸。

167、在一些实施例中，连续核苷酸序列的长度为13-18个核苷酸。

168、在一些实施例中，连续核苷酸序列的长度为14-18个核苷酸。

169、在一些实施例中，连续核苷酸序列的长度为10-32个核苷酸。

170、在一些实施例中，连续核苷酸序列的长度为20-32个核苷酸。

171、在一些实施例中，连续核苷酸序列的长度为21-32个核苷酸。

172、在一些实施例中，连续核苷酸序列的长度为22-32个核苷酸。

173、在一些实施例中，连续核苷酸序列的长度为23-32个核苷酸。

174、在一些实施例中，连续核苷酸序列的长度为24-32个核苷酸。

175、在一些实施例中，连续核苷酸序列的长度为25-32个核苷酸。

176、在一些实施例中，连续核苷酸序列的长度为26-32个核苷酸。

177、在一些实施例中，连续核苷酸序列的长度为27-32个核苷酸。

178、在一些实施例中，反义寡核苷酸由连续核苷酸序列组成。

179、在一些实施例中，反义寡核苷酸包含选自由以下项组成的组的寡核苷酸或由其组成：16,1、8,3、18,3、18,4、16,2、18,2、7,2、15,2、16,3、15,3、8,1、8,2、7,3、6,4、6,3、18,1、7,1、14,2、6,2、14,4、15,4、10,1和15,5。

180、本发明提供了一种反义寡核苷酸，其选自由以下项组成的组的(化合物id#)：16,1、8,3、18,3、18,4、16,2、18,2、7,2、15,2、16,3、15,3、8,1、8,2、7,3、6,4、6,3、18,1、7,1、14,2、6,2、14,4、15,4、10,1和15,5。

181、本发明的反义寡核苷酸可包含一个或多个缀合物基团，即寡核苷酸可为反义寡核苷酸缀合物。

182、本发明提供了包含根据本发明的寡核苷酸和与所述寡核苷酸共价连接的至少一个缀合物部分的缀合物。

183、本发明提供一种盐，诸如本发明的反义寡核苷酸或缀合物的药用盐，诸如钠盐或钾盐。

184、本发明提供了一种药物组合物，其包含权利要求书的寡核苷酸或本发明的缀合物以及药用稀释剂、溶剂、载体、盐和/或佐剂。

185、本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的寡核苷酸或本发明的缀合物以及药用稀释剂或溶剂和阳离子。阳离子可以例如是钠阳离子或钾阳离子。稀释剂/溶剂可以是水。

186、本发明提供了一种用于增强表达异常或耗竭水平的tdp-43的细胞中的tdp-43功能的方法，诸如体内或体外方法，所述方法包括以有效量向所述细胞施用本发明的寡核苷酸或根据本发明的缀合物、或根据本发明的盐或组合物。

187、本发明提供了一种用于治疗或预防受试者中的tdp-43病理的方法，其包括向患有或易患tdp-43病理的受试者施用治疗或预防有效量的本发明的寡核苷酸或根据本发明的缀合物、或根据本发明的盐或组合物。

188、本发明提供了本发明的寡核苷酸、或根据本发明的缀合物、或根据本发明的盐或组合物用作药物的用途。

189、本发明提供了本发明的寡核苷酸、或根据本发明的缀合物、或根据本发明的盐或组合物用于治疗tdp-43病理的用途。

190、本发明提供了本发明的寡核苷酸、或根据本发明的缀合物、或根据本发明的盐或组合物在制备用于治疗或预防tdp-43病理的药物中的用途。

191、本发明提供了本发明的用途或方法，其中tdp-43病理是选自由以下项组成的组的神经系统疾患：肌萎缩侧索硬化(als)、额颞叶变性(ftld)、进行性核上麻痹(psp)、原发性侧索硬化症、进行性肌萎缩、阿尔茨海默病、帕金森病、孤独症、海马硬化性痴呆、唐氏综合征、亨廷顿病、多聚谷氨酰胺疾病，诸如脊髓小脑性共济失调3、肌病和慢性创伤性脑病。

192、在一些实施例中，tdp-43病理是选自由肌萎缩侧索硬化(als)、额颞叶变性(ftld)组成的组的神经系统疾患。

193、在另一方面，本发明提供了包含本发明的反义寡核苷酸和药用稀释剂、载体、盐和/或佐剂的药物组合物。

194、本发明提供了本发明的反义寡核苷酸的药用盐。在一些实施例中，药用盐为钠盐、钾盐或铵盐。

195、本发明提供了本发明的寡核苷酸的药物溶液，其中该药物溶液包含本发明的寡核苷酸和药用溶剂，诸如磷酸盐缓冲盐水。

196、本发明提供了以固体粉末形式的本发明的寡核苷酸，诸如冻干粉末的形式。

197、通常，本发明的反义寡核苷酸包含长度为至少8个或至少10个核苷酸(长度为诸如10-32个、15-32个、20-32个、21-32个、22-32个、23-32个、24-32个、25-32个、26-32个、27-32个或10-20个核苷酸)的连续核苷酸序列，其中连续核苷酸序列与tdp-43rna结合序列至少75％互补，诸如至少90％互补或完全互补。在一些实施例中，反义寡核苷酸的所有核苷形成连续核苷酸序列。

198、在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸能够调节至少两个人前体mrna的剪接。例如，人stmn2、cert1、slc5a7、arhgap32、camk2b、kalrn和unc13a前体mrna的剪接取决于tdp-43结合，如实例中展示。

199、在另一方面，本发明提供了用于治疗或预防神经变性疾病诸如肌萎缩侧索硬化(als)的方法，该方法包括向患有或易患该疾病的受试者施用治疗或预防有效量的本发明的寡核苷酸。

200、在另一方面，本发明的寡核苷酸或组合物用于治疗或预防神经变性疾病，如以tdp-43病理或tdp-43从细胞核错误定位为特征的神经变性疾患，诸如肌萎缩侧索硬化(als)。

201、序列表

202、与本技术一起提交的序列表通过引用并入本文。