促进蛋白二聚体形成的拉链扣结构及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物领域，特别具体涉及蛋白领域，特别涉及一种促进蛋白二聚体形成的拉链扣结构及其应用。


背景技术：

2.蛋白二聚体是一种蛋白质四级结构。同源双聚体是由两个相同的蛋白分子组合而成(此过程称为同源二聚作用homodimerization)，而异源二聚体则是由两种不同的蛋白质所形成(称为异源二聚作用heterodimerization)。生物化学中的大部分双聚体都不是用共价键相连结的。例如，反转录酶为一种非共价键连接的异源二聚体酵素，是由两种不同的氨基酸链连结的。另一个例外为双聚体蛋白nemo，由双硫键连结的双聚体。有些蛋白会包含特殊的区域，确保二聚作用(二聚区域)的形成。在细胞的生长，繁殖，信号传导中，蛋白的二聚对功能的实现有重要的作用。研究蛋白的二聚体对了解蛋白的功能，生产应用十分重要。设计蛋白质二聚体是一项挑战性十足的任务。
3.目前公布的设计蛋白二聚体的方法有半胱氨酸结设计，3个以上的成不对称的奇数的半胱氨酸残基，位于目标蛋白的c端（sherilynl，2001），这种方法亲和力高，但蛋白不稳定，易多聚沉淀；knob-in-hole设计，改造自抗体的fc片段，在双特异性单抗开发中有应用（elliotjm.2014）；亮氨酸拉链是出现在dna结合蛋白质和其它蛋白质中的一种结构基元（motif），即模体，这种蛋白上的亮氨酸总是有规律地每隔7个氨基酸就出现一次。蛋白质α-螺旋每绕一圈为3.6个氨基酸残基。这种一级结构形成α-螺旋时，亮氨酸必与螺旋轴平行而在外侧同一线上排布，每绕两圈出现一次，两组平行走向，带亮氨酸的α-螺旋形成的对称二聚体。其上的亮氨酸残基，侧链上r-基因的分支碳链，又刚好互相交错排列，故名氨酸拉链。这种结构融合蛋白部分太大，不适合作为二聚体的融合蛋白。二硫键常常用于蛋白的二聚体设计中，但它带来的问题常常超过了益处。很多蛋白本身就有半胱氨酸存在，这些半胱氨酸与蛋白的三维结构，功能发挥起着巨大的作用，在蛋白表达出来时，多余设计进去的二硫键会干扰重组蛋白的正确折叠，造成蛋白包涵体出现。特别的，多余的半胱氨酸还会造成多聚体的出现。
4.天然蛋白的三维结构十分复杂，除了离子键的相互作用，氢键，疏水氨基酸之间的相互作用力占主导地位。蛋白与蛋白之间的相互作用更多的需要天然三维结构的互补才能形成稳定的二聚体结构。这对重组蛋白二聚体的形成提出了更高的要求。
5.英文、缩写词对应表：1，flag标签：用于检测蛋白表达的标签，由8个氨基酸组成；2，esat6：结核杆菌分泌蛋白之一；3，cfp10：结核杆菌分泌蛋白之一；4，ccp：环化瓜氨酸多肽，用于类风湿关节炎疾病诊断；5，ra：类风湿关节炎缩写；6，k：赖氨酸；
7，d：天冬氨酸；8，ifnγ：细胞因子γ型干扰素；9，ip10：趋化因子ip-10(interferon-inducibleprotein-10)；10，il-6：白细胞介素6；11，il-8：白细胞介素6；12，tnfα：肿瘤坏死因子α；13，pha；植物血凝素（phytohaemagglutinin,pha）是一种发现于植物特别是豆科植物中的凝集素（lectin），具有促进t细胞有丝分裂和诱导干扰素分泌的活性；14，ires：内部核糖体进入位点序列；15，bcg:卡介苗；16，ect基因：esat6/cfp10/tb7.7三基因融合基因；17，vegf165：人血管内皮生长因子；18，ang1:人血管生成素1;19，rf:风湿因子；20，crp：c反应蛋白(c-reactionprotein，crp)，在细菌感染或组织损伤时，其浓度显著升高，故被认为具有检测价值；21，gpi：葡萄糖-6-磷酸异构酶，可用于类风湿关节炎检测；22，aka：血清抗角蛋白抗体，可用于类风湿关节炎检测。
6.未注明英文缩写的为本领域通用的缩写。
7.参考文献：bellsl,gongqiaoxu,forstnerjf.roleofthecystine-knotmotifatthec-terminusofratmucinproteinmuc2indimerformationandsecretion[j].biochemicaljournal,2001,357(1):203-9.elliottjm,ultschm,leej,etal.antiparallelconformationofknobandholeaglycosylatedhalf-antibodyhomodimersismediatedbyach2
–
ch3hydrophobicinteraction[j].journalofmolecularbiology,2014,426(9):1947-1957.sherilynl，2001，roleofthecystine-knotmotifatthec-terminusofratmucinproteinmuc2indimerformationandsecretion.biochemicaljournaljul01,2001,357(1)203-209。


技术实现要素：

[0008]
本发明的一个目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种可以促进蛋白二聚体或环肽形成的方法。
[0009]
本发明的第一个方面，提供：一种促进蛋白二聚体或环肽形成的方法，包括在肽链的末端引入二聚体拉链扣，所述二聚体拉链扣具有如下特性：1)含有2～9个，优选3～8个，3～7个，4～6个荷电氨基酸残基；2)具有1个无电荷的间隔区，间隔区的长度为1～5个氨基酸，优选1～4、1～3个、1
～2个；3)所述间隔区中的至少一个含有至少一个半胱氨酸残基；优选的，半胱氨酸残基的数量为1～4，1～3个，1～2个；4)所述两段二聚体拉链扣之间可以通过荷电氨基酸的静电作用相互亲和并通过间隔区的半胱氨酸残基形成二硫键。
[0010]
对于蛋白二聚体而言，其2条肽链上分别至少引入有至少一段二聚体拉链扣。二聚体拉链扣的引入方式可以是直接偶联在肽链上，也可以通过连接肽间接偶联在蛋白二聚体的肽链上。在基本不影响蛋白二聚体的活性且有利于两段二聚体拉链扣相互接近的前提下，可以根据具体的需要选择合适的引入方式，优选通过连接肽间接偶联的方式引入二聚体拉链扣。
[0011]
对于环肽而言，在需要环化的肽链两端同时引入二聚体拉链扣，二聚体拉链扣的引入方式和原则和蛋白二聚体的相同。
[0012]
两段二聚体拉链扣之间通过半胱氨酸残基形成二硫，可以进一步稳定二聚体拉链扣的稳定性。
[0013]
间隔区的设置可以避免荷电氨基酸过于集中导致局部极性变化过大，减少其对原肽链活性的影响，间隔区的加入还方便二聚体拉链扣的弯曲，更有利拉链区的相互结合。间隔区的氨基酸可以是甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸等易折叠的小氨基酸；当间隔区的氨基酸亮氨酸，异亮氨酸或缬氨酸等疏水氨基酸时，又可以通过疏水的相互作用力加强二聚体拉链的结合。
[0014]
半胱氨酸相互作用形成的二硫键（二聚体扣），可提高二聚体或环肽的稳定性。二硫键的个数越多，相应的二聚体拉链扣的稳定性就越高。在不影响蛋白或肽活性的情况下，二聚体拉链扣的二硫键可以实际的需要相应增加。但是，单个间隔区内半胱氨酸残基太多会影响配对，因此单个间隔区内的半胱氨酸残基优选不超过两对。
[0015]
在可以促进蛋白二聚体或者环肽的前提下，所述二聚体拉链扣的长度可以根据需要进行设置，其最短长度为3 aa，可以是3～20 aa。
[0016]
本发明第一个方面得到的一些蛋白二聚体的实例如图1所示，二聚体拉链扣可以具体是：(1)二聚体拉链扣以半胱氨酸（c）残基为间隔区（对称点），间隔区两侧对称分布有荷电氨基酸，两段二聚体拉链扣通过正负电荷的静电作用亲和，然后半胱氨酸的-sh反应生成二硫键，形成“扣”，将两条蛋白链或肽链结合在一起，形成蛋白二聚体（图1-1，1-3，1-6）。
[0017]
(2)二聚体拉链扣以半胱氨酸（c）残基为间隔区，间隔区两侧的荷电氨基酸不对称分布，两段二聚体拉链扣通过正负电荷的静电作用亲和，然后半胱氨酸的-sh反应生成二硫键，形成“扣”，将两条蛋白链或肽链结合在一起，形成蛋白二聚体（图1-2，1-4、1-5）。
[0018]
(3)荷电氨基酸在含半胱氨酸的间隔氨基酸两侧对称分布，可以是2到9个（图1-1）。
[0019]
(4)荷电氨基酸在含半胱氨酸的间隔氨基酸两侧非对称分布，都位于目标蛋白的n端（图1-2）。
[0020]
(5)荷电氨基酸对称分布式二聚体拉链扣位于目标蛋白的c端（图1-3）。
[0021]
(6)非对称分布式二聚体拉链扣位于目标蛋白的c端（图1-4）。
[0022]
(7)交叉分布式二聚体拉链扣位于目标蛋白的c端（图1-5）。
[0023]
(8)天然蛋白的二聚体形式是首尾相连，带连结肽结构的二聚体拉链扣可分别位于它们的n端和c端，也可形成正确的三维构像（图1-6）。
[0024]
具有拉链扣环肽结构示意图如图2所示。二聚体拉链扣以半胱氨酸（c）残基为间隔区（对称点），间隔区两侧对称分布有荷电氨基酸，两段二聚体拉链扣通过正负电荷的静电作用亲和，然后半胱氨酸的-sh反应生成二硫键，形成“扣”，将肽链两端结合在一起，形成环肽。构成环肽的二聚体拉链扣可以是对称式的，也可以是非对称式的，也可以是交叉分布式的。
[0025]
在一些实例中，所述间隔区两侧的荷电氨基酸对称排列或非对称排列。间隔区两侧的荷电氨基酸通过不同的排列组合，可以控制形成的二聚体拉链扣的方向与结合强度。间隔区两侧的荷电氨基酸对称排列，意味着两条互补的二聚体拉链扣可以通过两种不同的方向吸附在一起，更有利于得到蛋白二聚体或环肽。但对于蛋白二聚体而言，这意味着无法精确控制蛋白二聚体的构象，即得到的蛋白二聚体中，肽链可能在二聚体拉链扣的同侧或不同侧。所述间隔区两侧的荷电氨基酸非对称排列时，这样二聚体拉链扣只能以特定的方向结合，进而可以更好地控制蛋白二聚体的构象，保证其2条肽链具有预期的构象。理论两条互补的二聚体拉链扣间互补配对的荷电氨基酸越多，二者间的静电亲和力就越强。
[0026]
一些实例的蛋白二聚体结构示意图如图3所示。二聚体拉链扣以半胱氨酸（c）残基为间隔区，间隔区两侧的荷电氨基酸不对称分布，两段二聚体拉链扣只能以确定的方向通过正负电荷的静电作用亲和，然后半胱氨酸的-sh反应生成二硫键，形成“扣”，将两条蛋白链或肽链结合在一起，形成蛋白二聚体。当两个蛋白或两个多肽各自拥有一个二聚体拉链扣组分，则可以形成蛋白二聚体或延伸肽。
[0027]
在一些实例中，所述荷电氨基酸为荷正电的氨基酸或荷负电的氨基酸，所述荷正电的氨基酸选自k（赖氨酸）、r（精氨酸）或h（组氨酸）；所述荷负电的氨基酸选自d（天冬氨酸）或e（谷氨酸）。
[0028]
在一些实例中，至少一条肽链的n端和c端分别连接有二聚体拉链扣；特别的，肽链的n端和c端分别连接有二聚体拉链扣。通过在肽链的两端分别引入二聚体拉链扣，可以将肽链进一步延伸，得到更长的肽链。
[0029]
在一些实例中，至少一条肽链上有标签序列；优选的，两肽链各带一个标签序列；优选的，所述标签序列包括flag标签序列和组氨酸序列。通过引入标签序列，可以方便蛋白的分离和纯化。
[0030]
优选的，所述二聚体拉链扣具有4个荷电氨基酸残基，荷电氨基酸优选分别为k和d，所述二聚体拉链扣中间具有1或2个半胱氨酸；优选的，环肽的整体结构为：kkck-ccp线性氨基酸序列-dcdd。
[0031]
本发明的第二个方面，提供：一种带有二聚体拉链扣的蛋白或多肽，所述蛋白或多肽的至少一个末端连接有二聚体拉链扣，所述二聚体拉链具有如下特性：1)含有 2～9个，优选3～8个，3～7个，4～6个荷电氨基酸残基；2)具有无电荷的间隔区，间隔区的长度为1～5个氨基酸，优选1～4、1～3个、1～2个；
3)所述间隔区中的至少一个含有至少一个半胱氨酸残基；优选的，半胱氨酸残基的数量为1～4，1～3个，2～3个；4)所述两段二聚体拉链扣之间可以通过荷电氨基酸的静电作用相互亲和并通过间隔区的半胱氨酸残基形成二硫键。
[0032]
在一些实例中，所述间隔区两侧的荷电氨基酸对称排列或非对称排列。
[0033]
在一些实例中，所述蛋白为结核蛋白esat6和结核蛋白cfp10；所述二聚体拉链扣分别位于结核蛋白esat6和结核蛋白cfp10的c端；所述蛋白ccp线性氨基酸序列，所述二聚体拉链扣分别位于ccp线性氨基酸序列的n端和c端；优选的，所述二聚体拉链扣具有4个电荷的荷电氨基酸残基，荷电氨基酸优选分别为k和d，所述二聚体拉链扣中间具有1或2个半胱氨酸；优选的，环肽的整体结构为：kkck-ccp线性氨基酸序列-dcdd。
[0034]
本发明的第三个方面，提供：一种表达载体，其插入有可表达本发明第一个方面或本发明第二个方面所公开的具有二聚体拉链扣的肽链的核酸序列。
[0035]
表达载体可以是周知的各种载体，没有限定。
[0036]
本发明的第四个方面，提供：一种制备拉链扣型蛋白二聚体或环肽的方法，包括：1)构建表达载体：其中，表达载体如本发明第三个方面所述；2)表达：将表达载体转入表达菌株或细胞，表达、分离、纯化得到拉链扣型蛋白二聚体或环肽。
[0037]
本发明的有益效果是：本发明一些实例的二聚体拉链扣，由于荷电氨基酸组的存在，同电荷的二聚体拉链扣将会互相排斥，只有互补的拉链才会接合，进一步定位了半胱氨酸的位置，可减少因半胱氨酸二硫键引起的多聚体形成的机会。
[0038]
本发明的一些实例，可以有效辅助蛋白之间二聚体的形成，稳定已形成的二聚体蛋白，让天然有二聚体趋势的蛋白之间更快形成稳定的结构。
[0039]
同时，本发明一些实例的二聚体蛋白可以使用常规的重组蛋白表达方法得到，二聚体的形成可以在表达体系内完成，得到的多肽或蛋白聚合体可以使用同一个分离标签分离，大幅提高了蛋白的分离纯化效率。
[0040]
本发明的一些实例，由于帮助蛋白形成稳定的结构，从而提高了整合蛋白的表达量，并提高了两个蛋白的溶解度，简化二聚体蛋白的纯化操作，提高了纯化出蛋白的纯度。
[0041]
本发明的一些实例，可以得到接近天然构象的esat6-cfp10二聚体，该二聚体具有更好的可溶性，对记忆性t细胞刺激效果要好于线性融合表达的esat6-cfp10蛋白。
[0042]
本发明的一些实例，可以帮助合成的多肽形成稳定的环状结构，例如稳定的环状结构有利于ccp多肽对类风湿关节炎特异性自身抗体的识别，增加检测的灵敏度，这种多肽可用于类风湿关节炎诊断试剂盒的开发。
[0043]
本发明的一些实例，通过在常规的ccp氨基酸序列两端增加拉链扣，代替原有的二硫键，得到拉链扣型扣ccp环肽。拉链扣型ccp环肽可以增强形成的环肽的稳定性，这种拉链
扣型环肽作为抗原，包被在固相载体上，可用于检测类风湿关节炎患者血清中的自身性瓜氨酸化抗体。 所述固相载体为酶标板、磁珠、亲和膜或液相芯片中的任意一种或至少两种的组合。所述试剂盒还包括酶标抗人抗体、阴性对照品、阳性对照品、临界对照品、样品稀释液、封闭液、洗涤液、底物溶液和终止液。
附图说明
[0044]
图1是一些带有二聚体拉链扣的蛋白二聚体的实例示意图；1）荷电氨基酸在含半胱氨酸的间隔氨基酸两侧对称分布，可以是2到9个；2）荷电氨基酸在含半胱氨酸的间隔氨基酸两侧非对称分布， 都位于目标蛋白的n端；3）荷电氨基酸对称分布式二聚体拉链扣位于目标蛋白的c端；4）非对称分布式二聚体拉链扣位于目标蛋白的c端；5）交叉分布式二聚体拉链扣位于目标蛋白的c端；6）天然蛋白的二聚体形式是首尾相连， 带连结肽结构的二聚体拉链扣可分别位于它们的n端和c端，也可形成正确的三维构像。
[0045]
图2是带有二聚体拉链扣的环肽的实例示意图；构成环肽的二聚体拉链扣可以是对称式的，也可以是非对称式的，也可以是交叉分布式的。
[0046]
图3是带有二聚体拉链扣的肽链二聚体和延伸肽的实例示意图。
[0047]
图4是不同菌株经iptg诱导后表达的拉链扣型二聚体蛋白的sds-page图。
[0048]
图5是纯化后拉链扣型二聚体蛋白的sds-page胶考马斯亮蓝染色图， 天然构象的二聚体蛋白经过sds和还原剂b-me打开二硫键后呈两个单体状态；未还原状态的蛋白则呈清晰的二聚体状态。
[0049]
图6是不同浓度的拉链扣型二聚体蛋白抗原对最终ifn-γ刺激水平的影响；拉链扣型二聚体蛋白活性较强，在较低浓度就达到了饱和。
[0050]
图7是刺激时间对t细胞分泌ifn-γ的影响。
[0051]
图8是刺激温度对t细胞分泌ifn-γ的影响。
[0052]
图9是不同结构蛋白刺激对t细胞分泌ifn-γ的影响，显示拉链扣型二聚体蛋白活性较强，与非拉链扣形成的二聚体蛋白比较，同等浓度下刺激对t细胞分泌ifn-γ的影响更大， 产生的ifn-γ更多。
[0053]
图10是拉链扣型ccp环肽与普通二硫键ccp环肽在类风湿关节炎检测中的灵敏度与特异性的比较。
[0054]
图11是拉链扣型ccp环肽与普通二硫键ccp环肽在选取的有差异的26例类风湿关节炎样本检测中的表现，有12例拉链扣型ccp环肽的检测s/co值更高， 由阴性检测不出变成了可以被检测出来的阳性。
具体实施方式
[0055]
下面结合实施例，进一步说明本发明的技术方案。此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与本发明相关的部分而非全部结构。
[0056]
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
[0057]
实施例1：拉链扣型二聚体蛋白esat6-cfp10表达载体的构建在esat6的c端加入一个带负电的氨基酸组和cfp10的表达基因c端都加入一个带正电氨基酸组，在所述cfp10前端添加组氨酸纯化标签，其中：esat6表达后的氨基酸序列为：dykddddkgg（seq id no.：3）-maemktdaatlaqeagnferisgdlktqidqvestagslqgqwrgaagtaaqaavvrfqeaankqkqeldeistnirqagvqysradeeqqqalssqmgf-ggddcdd（seq id no.：1）；cfp10表达后的氨基酸序列为：hhhhhhgg（seq id no.：4）-mteqqwnfagieaaasaiqgnvtsihslldegkqsltklaaawggsgseayqgvqqkwdatatelnnalqnlartiseagqamastegnvtgmfa-ggkkckk（seq id no.：2）；将添加序列后的esat6和cfp10基因片段合成后插入pet表达载体中的ires序列两端，构成表达质粒，纯化后的表达质粒转化到bl21（de3）感受态细胞中。
[0058]
重组蛋白的表达和纯化选取构建成功的单克隆菌株进行2l扩大培养，37℃培养，iptg诱导4h后，离心收集菌体，超声波破碎；ni柱亲和纯化，得到目的蛋白拉链扣型二聚体蛋白esat6-cfp10（简记为e6c10）。
[0059]
采用sds-page检测蛋白的浓度，结果如图4所示。从图4可以看出，重组蛋白在37℃诱导表达4小时即可得到可溶性的二聚体，从图5可以看出，可通过ni亲合柱一步纯化可得到90%以上的纯度；将纯化蛋白经过类毒素去除处理后，进行记忆性t细胞刺激实验。
[0060]
拉链扣型二聚体蛋白的记忆性t细胞刺激实验在本实验中，使用来自肺结核患者的新鲜外周全血，比较不同浓度的拉链扣型二聚体蛋白抗原(2，4，6)对最终的刺激水平(即ifn-γ的水平)的影响：1)分别从2个健康人，7个肺结核患者采集新鲜外周全血，将采集的9个全血样品各自分成5份，每份1ml，使用阴性对照，阳性对照，拉链扣型二聚体蛋白的3种浓度进行刺激；2)再将混匀的45份样本在37℃静置培养20小时；3)离心后收集各样品 (包括阴性对照)的血浆上清；4)使用human ifn-γ elisa kit(标准双抗体夹心法elisa检测试剂盒，可检测最低ifn-γ浓度为5pg/ml)检测各血浆样品中ifn-γ的水平。
[0061]
检测结果如表1和图6所示（阴阳性对照结果未显示）。
[0062]
从图6可以看出，在对7例结核患者，2例健康人的检测中，根据实施例1表达，纯化出的拉链扣型二聚体蛋抗原以2μg/ml的刺激量刺激细胞后，7例基本上达到平台期，加大刺激量到4μg/ml和6μg/ml后，并不能增加ifn-γ的表达与分泌，只有两例有稍有增加。在本发明后续的检测方法中，采用的抗原刺激浓度为2μg/ml。
[0063]
拉链扣型二聚体蛋白刺激细胞的培养温度的选择在本实验中，使用来自肺结核患者的新鲜外周全血，比较不同培养温度(25℃，30℃，37℃，38℃和 39℃)对最终的刺激水平(即ifn-γ的水平)的影响，具体操作包括：1)分别从4个肺结核患者采集新鲜外周全血，将采集的全血样品各自分成10份，各分别使用阴性对照，拉链扣型二聚体蛋白进行刺激5份(二聚体蛋白的终浓度为2μg/ml)；2)将4个人的5份分别在25℃，30℃，37℃， 38℃和39℃静置培养22小时；3)离心收集各样品 (包括阴性对照)的血浆上清；4)使用human ifn-γelisa kit（标准双抗体夹心法elisa检测试剂盒，可检测最低ifn-γ浓度为5pg/ml）检测各血浆样品中 ifn-γ的水平。
[0064]
结果如表2和图8所示。
[0065]
从图8可以看出，在温度30～38℃时，刺激后的ifn-γ的水平都会产生变化，培养温度为37℃时，刺激后的ifn-γ的水平最高，刺激效果最佳。25℃时，完全没有刺激效果，39℃时，部分阴性对照会有非特异性反应。因此，在本发明的方法中，培养温度可以在30～38℃，优选为37℃。
[0066]
拉链扣型二聚体蛋白刺激实验培养时间的选择在本实验中，使用来自肺结核患者的新鲜外周全血，比较不同培养时间 (14，18，20，22，24，26h)对最终的刺激水平(即ifn-γ的水平)的影响。
[0067]
1)从肺结核患者采集新鲜外周全血，将采集的全血样品使用拉链扣型二聚体蛋白进行刺激(拉链扣型二聚体蛋白的终浓度为2μg/ml)；2)将刺激后的全血样品在37℃静置培养12，16，18，20，22，24，26和28小时，未经刺激原刺激的使用对应培养时间的全血用作阴性对照；3)离心后收集各样品 (包括阴性对照)的血浆上清；4)使用human ifn-γ elisa 试剂盒 (标准双抗体夹心法elisa检测试剂盒，可检测最低ifn-γ浓度为5pg/ml) 检测各血浆样品中ifn-γ的水平。
[0068]
结果如图7所示。从图7可以看出，刺激水平(即ifn-γ的水平)在培养20小时后基本上达到平台，因此，在本发明的方法中，优选的培养时间为20小时，前后浮动2～4个小时不影响实验结果。
[0069]
拉链扣型二聚体蛋白与线性融合蛋白对刺激水平的影响在本实验中，使用来自肺结核患者的新鲜外周全血，比较拉链扣型二聚体蛋白和线性融合蛋白对最终的刺激水平(即ifn-γ的水平)的影响。
[0070]
1)从7例肺结核患者采集新鲜外周全血，将采集的全血样品分别使用拉链扣型二聚体蛋白和线性融合蛋白进行刺激(蛋白的终浓度为2μg/ml)；2)将刺激的全血样品在37℃静置培养20小时，未经抗原刺激的全血用作阴性对照；3)离心收集各样品等分(包括阴性对照)的全血血浆；4)使用human ifn-γ elisa 试剂盒 (标准双抗体夹心法elisa检测试剂盒，可检测最低ifn-γ浓度为5pg/ml)检测各血浆样品中ifn-γ的水平。
[0071]
结果如图9所示。从图9可以看出，在7个结核病人血细胞用拉链扣型二聚体蛋白抗原刺激和线性融合蛋白抗原刺激比较中，拉链扣二聚体蛋白抗原均比线性融合蛋白抗原的刺激明显效果更好，产生的ifn-γ量更高。
[0072]
综上所述，本发明通过对刺激条件的考察，在拉链扣型二聚体蛋白浓度为2μg/ml、刺激温度为37℃下进行20～22小时的刺激，细胞因子水平最高，刺激效果最佳，检测效果最好。
[0073]
实施例2：环肽设计在ccp检测中的应用：在传统的ccp基础上，更换了二硫键的位置，添加了二聚体拉链扣在多肽的两侧后，新的多肽结构为kkck-ccp-dcdd；拉链扣环肽对类风湿关节炎血清中自身免疫性抗体的检出率有了10%的提升。说明成环的稳定性对于ccp的检测灵敏度非常重要，增加环肽的稳定性可进一步提高ccp在检测瓜氨酸化自身抗体的灵敏度。
[0074]
以链霉亲和素-二聚体拉链扣环肽ccp按照5
µ
g/ml的浓度进行包被，脱脂奶粉封闭后检测样本，二抗为hrp-羊抗人。对照试剂为欧洲诊断的ccpelisa检测试剂盒。
[0075]
如图10所示，在95例ra患者中，没有二聚体扣的ccp检出率为78%，增加了二聚体拉链扣的ccp多肽的检出率为89%；在71例健康人中，增加了二聚体拉链扣的ccp多肽的特异性为91%，相比ccp的98%略有降低。
[0076]
如图11所示，拉链扣型ccp环肽与普通二硫键ccp环肽在选取的有差异的26例类风湿关节炎样本检测中的表现，有12例拉链扣型ccp环肽的检测s/co值更高， 由阴性检测不出变成了可以被检测出来的阳性。
[0077]
上述仅为本发明的较佳实施例及所运用技术原理。本领域技术人员会理解，本发明不限于这里所述的特定实施例，对本领域技术人员来说能够进行各种明显的变化、重新调整和替代而不会脱离本发明的保护范围。因此，虽然通过以上实施例对本发明进行了较为详细的说明，但是本发明不仅仅限于以上实施例，在不脱离本发明构思的情况下，还可以包括更多其他等效实施例，而本发明的范围由所附的权利要求范围决定。