分泌TRAIL的工程化巨噬细胞及其应用的制作方法

本发明涉及生物医药技术、免疫细胞治疗技术和抗肿瘤，具体涉及一种分泌trail的工程化巨噬细胞及其在抗肿瘤中的应用。

背景技术：

0、技术背景

1、巨噬细胞（macrophages，缩写为mø）是一种位于组织内的白血球，源自单核细胞，而单核细胞又来源于骨髓中的前体细胞。巨噬细胞和单核细胞皆为吞噬细胞，在脊椎动物体内参与非特异性防卫（先天性免疫）和特异性防卫（细胞免疫）。它们的主要功能是以固定细胞或游离细胞的形式对细胞残片及病原体进行噬菌作用（即吞噬以及消化），并激活淋巴球或其他免疫细胞，令其对病原体作出反应。巨噬细胞属免疫细胞是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2-3周，多用做原代培养，难以长期生存。

2、巨噬细胞具有多种的生物学功能，参与机体抗感染、抗肿瘤、免疫应答和免疫调节等过程，是机体非特异性免疫防御的关键环节，同时还是特异性免疫应答过程中的重要参与者。在抗肿瘤免疫中，巨噬细胞不仅是抗原呈递细胞（antigenpresenting cells, apc），也是参与杀伤肿瘤的效应细胞。巨噬细胞杀伤肿瘤细胞的机制有：第一，活化的巨噬细胞，通过溶解酶途径，直接杀伤肿瘤细胞；第二，巨噬细胞通过处理肿瘤抗原并将呈递肿瘤抗原呈递给t 细胞，进而诱导产生特异性的免疫应答抗肿瘤；第三，巨噬细胞通过抗体介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（antibody dependent cell-mediated cytotoxicity,adcc）实现对肿瘤细胞的杀伤；第四，活化的巨噬细胞，分泌tnf-α 等细胞毒性因子间接杀伤肿瘤细胞，tnf-α是具有最强的抗癌活性的细胞因子，不仅能增强宿主免疫力还能诱导肿瘤细胞凋亡；第五，巨噬细胞能产生细胞毒作用的 no，且 no 介导对肿瘤细胞的间接杀伤。巨噬细胞可分泌肿瘤坏死因子-α （tumor necrosis factor-α，tnf-α）、no 等抗瘤效应因子参与特异性免疫应答过程。

3、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，tnf)相关凋亡诱导配体trail （tnf-related apoptosis inducing-ligand）是继tnf、fasl 之后发现的肿瘤坏死家族中第三个凋亡分子，其与细胞膜上的 trail受体dr4/5 结合从而发挥生物学作用。在免疫系统中，免疫细胞的凋亡是重要的免疫调节，是机体维持自身的稳定，避免自身免疫疾病的重要机制。trail蛋白单体分子具有高度的寡聚化倾向，可形成分子量为48kda的二聚体和分子量为66kda的三聚体，其中，三聚体可进一步聚集为六聚体。蛋白的构型稳定性及聚集形式与其肿瘤杀伤活性、受体亲和性以及稳定性等有着密切的关系，当trail在空间上形成三聚体结构时，其抗肿瘤活性最佳而稳定性最高。

4、很多研究报道，trail 在自然杀伤（nk）细胞、中性粒细胞、t 淋巴细胞，单核巨噬细胞和树突状细胞（dc）中表达，参与其对机体的免疫监视，可能在促进免疫细胞凋亡，调节免疫耐受等方面有重要作用，是一种良好的抗肿瘤蛋白类药物，然而蛋白类生物大分子由于自身分子量较大及不稳定性，在静脉给药过程中主要面临血液和肿瘤基质两大屏障，首先是血液屏障，在血液循环中，蛋白类药物易受网状内皮系统(res)的吞噬、清除以及血浆中各种酶的降解，其次是肿瘤微环境中的基质屏障，肿瘤细胞的快速增殖及上皮间质转化作用形成了致密的肿瘤基质，同时肿瘤组织缺氧、偏酸及一系列慢性炎症反应形成了间质高压，致密的基质及高压极大地阻碍了大分子药物渗透进入肿瘤深层，这种不均匀的瘤内药物分布是造成肿瘤复发及转移的重要原因之一，也为肿瘤的治愈增加了难度，因此，对trail 蛋白非功能结构域进行改造，以改善其体内及瘤内分布是亟需解决的问题。

技术实现思路

1、鉴于现有技术的问题，本发明的目的在于提供一种工程化改造巨噬细胞及其在抗肿瘤中的应用。所述的工程化改造巨噬细胞基于应用基因工程的方法对巨噬细胞进行功能化构建与修饰，使其分泌trail，可针对不同肿瘤的特异性靶点，来实现更精准的高效定位肿瘤、靶向治疗癌症。

2、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

3、一种修饰巨噬细胞的trail融合蛋白基因，所述trail融合蛋白基因的核酸序列如seqid no:5和seqid no:9所示。

4、一种质粒，所述质粒具有所述的修饰巨噬细胞的trail融合基因。

5、一种载体，所述载体具有所述的修饰巨噬细胞的trail融合基因。

6、进一步地，所述的载体的核酸序列如seqid no:1- seqid no:3所示。

7、优选的，所述载体为慢病毒载体，例如pcdh。

8、一种哺乳动物细胞，其基因组上整合了所述的trail融合蛋白基因或所述的质粒或任意所述的载体，并且可表达和分泌所述trail蛋白或其片段。

9、进一步地，所述的哺乳动物细胞为人、小鼠、大鼠、猪或猴的巨噬细胞。

10、一种分泌trail的工程化巨噬细胞的制备方法，所述的制备方法包括如下步骤。

11、步骤1、获取如seqid no:5和seqid no:9所示的trail融合蛋白。

12、步骤2、将步骤1中的所述trail融合蛋白与辅助质粒混合培养，转染细胞。

13、步骤3、将转染的细胞转染至巨噬细胞中获取可表达trail蛋白的巨噬细胞。

14、进一步地，所述的转染选自如下方式：病毒转染、脂质体转染、电转移转染、基因编辑转染和mrna转染。

15、优选地，所述转染为病毒转染。

16、进一步地，所述辅助质粒包括：pcdh、 pmd2.g和pspax2。

17、进一步地，所述的巨噬细胞为raw264.7。

18、一种组合物，所述组合物含有所述的trail融合蛋白基因或所述的质粒、任意所述的载体、所述的哺乳动物细胞、所述制备方法制得的分泌trail的工程化巨噬细胞。

19、所述的trail融合蛋白基因、所述的质粒、任意所述的载体、所述的哺乳动物细胞、所述的制备方法制得的分泌trail的工程化巨噬细胞或所述的组合物在制备治疗肿瘤或者癌症产品中的应用。

20、进一步地，所述的肿瘤或者癌症为乳腺癌、黑色素瘤、结肠癌。

21、进一步地，所述产品为药物。

22、进一步地，所述药物为细胞治疗药物。

23、进一步地，所述药物包括有效量的巨噬细胞。

24、进一步地，所述药物含有药学上可用的载体或赋形剂。

25、进一步地，所述药物为注射剂。

26、本发明所述的工程化改造巨噬细胞可以被包括在用于治疗对象的组合物中。一方面，该组合物包含工程化改造巨噬细胞，该组合物可以包括药物组合物，并且进一步包括药学上可接受的载体。治疗有效量的包含工程化改造巨噬细胞的药物组合物可被给予。

27、一方面，本发明包括治疗对象的与肿瘤或癌症相关的疾病或状况的方法，包括向对象给予治疗有效量的包含本发明所述工程化改造巨噬细胞的药物组合物。另一方面，本发明包括治疗对象的实体肿瘤的方法，包括向对象给予治疗有效量的包含本发明所述工程化改造巨噬细胞的药物组合物。另一方面，本发明包括刺激对象对靶肿瘤细胞或肿瘤组织的免疫应答的方法，包括向对象给予治疗有效量的包含本发明所述工程化改造巨噬细胞的药物组合物。再另一方面，本发明包括本发明所述的工程化改造巨噬细胞在制备用于治疗对其有需要的对象的免疫应答的药物中的用途。在又一方面，本发明包括所述的工程化改造巨噬细胞在制备用于治疗对其有需要的对象中的肿瘤或癌症的药物中的用途。

28、本发明所述生成的工程化改造巨噬细胞具有目标效应活性。在实施例中，工程化改造巨噬细胞具有针对靶细胞上的抗原的目标效应活性，目标效应活性包括但不限于吞噬、目标的细胞的细胞毒性、抗原呈递和细胞因子分泌。

29、在实施方式例中，本发明所述的工程化改造巨噬细胞可作为制剂、生物剂或治疗剂，递送至靶标的能力。巨噬细胞可被修饰或改造以将用剂递送至靶标，其中该用剂选自核酸、抗生素、抗炎剂、抗体或其抗体片段、生长因子、细胞因子、酶、蛋白质、肽、融合蛋白、合成分子、有机分子、碳水化合物或类似物、脂质、激素、微粒体、其衍生物或变体、和其任意组合。作为非限制性实例，用靶向肿瘤抗原的工程化改造的巨噬细胞能够分泌诸如细胞因子或抗体的用剂，以协助巨噬细胞功能。

30、本发明的工程化改造巨噬细胞可以用于治疗癌症。癌症包括没有血管化或尚未实质上血管化的肿瘤以及血管化的肿瘤。癌症可以包括非实体肿瘤(如血液肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)，或可以包括实体肿瘤。用本发明的细胞治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤、以及某些白血病或淋巴恶性病、良性和恶性肿瘤、和恶性病(malignancy)，例如肉瘤、癌和黑素瘤。还包括成年人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症也被包括在内。

31、实体肿瘤是通常不包含囊肿或液体区域的异常组织块。实体肿瘤可以是良性或恶性的。不同类型的实体肿瘤以形成其的细胞类型命名(如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体肿瘤(如肉瘤和癌)的实例包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其它肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性病、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、甲状腺乳头状癌、嗜铬细胞瘤、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝瘤、胆管癌、绒毛膜癌、wilms肿瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑素瘤和cns肿瘤(如神经胶质瘤(如脑干神经胶质瘤和混合神经胶质瘤)、成胶质细胞瘤(也称为多形性成胶质细胞瘤)、星形细胞瘤、cns淋巴瘤、生殖细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经鞘瘤(schwannoma)、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、menangioma、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移)。

32、血液癌症是血液或骨髓的癌症。血液(或血原性)癌症的实例包括白血病——包括急性白血病(如急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、急性髓原性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、髓单核细胞性、单核细胞性白血病和红白血病)、慢性白血病(如慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性髓原性白血病和慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、waldenstrom巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病和骨髓发育不良。

33、本发明的工程化改造巨噬细胞可以以在适当临床前和临床实验和试验中确定的剂量和途径以及次数给予。细胞组合物可以以这些范围内的剂量多次给予。本发明工程化改造巨噬细胞的给予可以与本领域技术人员所确定的可用于治疗期望疾病或状况的其它方法组合。

34、待给予的本发明工程化改造巨噬细胞可以相对于治疗进行的对象是自体的、同种异体的或异种的。

35、本发明细胞的给予可以以本领域技术人员已知的任何便利方式进行。本发明的细胞可以通过气雾吸入、注射、摄入、转输、植入或移植被给予对象。本文所述的组合物可经动脉、皮下、皮内、瘤内、结节内、髓内、肌内、静脉内(i.v.)注射或腹膜内来给予。在其它情况下，本发明的细胞被直接注射到对象的炎症部位、对象的局部疾病部位、淋巴结、器官、肿瘤和类似位置中。

36、本发明的药物组合物可以包含所述的工程化改造巨噬细胞-与一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合。这样的组合物可以包含缓冲剂，如中性缓冲盐水、磷酸缓冲盐水和类似物；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露糖醇；蛋白质；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如edta或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选被配制用于静脉内给予。

37、本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)疾病的方式被给予。给药的数量和频率将通过诸如患者状况和患者疾病类型和严重程度的因素确定，尽管适当的剂量可通过临床试验确定。

38、与现有技术比，本发明的有益效果如下。

39、本发明成功构建了trail-cm、tri-trail-cm和arg1- trimtrail-cm质粒，被该质粒转染的巨噬细胞能够表达并外泌具有穿膜功能的trail-tat蛋白，在到达肿瘤组织后借助富正电的tat结构域，协助trail结构域穿透肿瘤微环境的基质屏障，抵达肿瘤深部，激活肿瘤细胞凋亡通路，发挥抗肿瘤作用；同时，快速凋亡的肿瘤细胞碎片能够为免疫系统提供丰富的抗原，进一步激活效应t细胞，促进树突状细胞的成熟，通过激活固有免疫进一步增强抗肿瘤作用。

40、分泌trail的工程化巨噬细胞抗肿瘤的原理是通过发挥巨噬细胞的分泌功能，并结合巨噬细胞的肿瘤趋化性和浸润性，将药物蛋白递送到实体瘤内部，达到肿瘤治疗的作用。分泌trail的工程化巨噬细胞最大优势是不需要靶向肿瘤特异性标志物，选择适当的抗肿瘤蛋白，就可以发挥治疗作用。

41、体外通过病毒或其他转染方式将响应免疫微环境（tme）启动分泌肿瘤细胞杀伤因子的人工合成蛋白序列（arg1-trail）构建到巨噬细胞中。然后将构建好的巨噬细胞回输给肿瘤患者。构建好的分泌trail的工程化巨噬细胞会向肿瘤募集并持续释放杀伤因子，延缓肿瘤进展。分泌trail的工程化巨噬细胞发挥的抗肿瘤作用：肿瘤患者分泌il-10等炎症因子，分泌trail的工程化巨噬细胞响应这些炎症因子并向肿瘤部位趋化并通过释放肿瘤杀伤蛋白延缓肿瘤进展。分泌trail的工程化巨噬细胞可以弥补car-m靶点单一的问题，对异质性较强的非特异膜蛋白表达的肿瘤进行有效杀伤，单独发挥抗肿瘤作用。

42、分泌trail的工程化巨噬细胞还可以结合car-m，即将car序列的启动子转换为tme响应的启动子，并同时分泌促免疫激活的因子。增强car-m对肿瘤部位的聚集和免疫治疗的效果。可以减少car-m治疗的细胞量同时增加全体免疫细胞的抗瘤活性。