能够在肠道内富集且增殖调节性T细胞的融合蛋白及应用的制作方法

能够在肠道内富集且增殖调节性t细胞的融合蛋白及应用
技术领域
1.本技术涉及蛋白质工程技术领域，尤其是涉及一种能够在肠道内富集且增殖调节性t细胞的融合蛋白及应用。


背景技术：

2.炎症性肠病(inflammatory bowel disease，ibd)，由溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，uc)和克罗恩病(crohn’s disease，cd)组成，是一种慢性复发性疾病，其特征是肠道炎症、组织损伤、腹痛、频繁/持续性腹泻、体重减轻、直肠出血、疲劳等。ibd属于免疫系统疾病(一般不认为是自身免疫病，不攻击自身，而是免疫系统紊乱)，现阶段ibd病因及发病机制尚不明确，一般认为与环境、感染、遗传易感性和免疫应答异常激活等因素有关。ibd最早发现于西方发达国家，近年来在我国的发病率不断上升，并成为结直肠癌重要的致病因素。炎症性肠炎一般表现为结构性肠上皮功能障碍，以及多种因素导致的免疫系统异常激活。传统的治疗包括氨基水杨酸类、皮质类固醇激素、免疫抑制剂等，主要目的在于诱导缓解(消除症状)和维持缓解(预防复发)，控制肠道炎症。相当多的患者在治疗后无法达到临床缓解，或随着时间推移失去应答。近年来基于ibd发病机理的不断深入研究，出现了炎症性肠炎新药研发的热潮。针对uc的新药研发主要有两个方向，一是干扰炎性细胞因子的作用，二是阻挡淋巴细胞大量进入肠道的固有层组织。但是无论那一个机制的作用，都希望药物作用的位点主要在胃肠道，而全身作用都有可能带来较大的副作用，所以针对肠道炎症组织的靶向药物尤为重要。
3.在ibd治疗中，降低炎症反应可以通过活化体内的免疫抑制型细胞来实现。调节性t细胞(regulatory t cells，treg)是一类具有显著免疫抑制作用的，是自我耐受的主要控制者。调节性t细胞可以分泌抗炎细胞因子如：il-4、il-10、tgf-β等，防止引起组织破坏的病理性免疫应答发生。白细胞介素-2(il-2)是一种t细胞生长因子，研究标明，低剂量的il-2可以促进人体内调节性t细胞的选择性激活和扩增，初步临床结果也显示了il-2在炎症性肠炎治疗中的有效性，但是il-2具有一定全身性的副作用。因此需要提供一种能够降低全身性副作用的增殖调节性t细胞的融合蛋白。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术的不足，本技术提供一种新的融合蛋白，该融合蛋白能够在肠道内富集，且选择性促进人体内调节性t细胞的增殖，因此能够选择性地降低肠道内的炎症反应，进而较好地应用在炎症性肠病的预防和治疗中。
5.为此，本技术第一方面提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白能够在肠道内富集且增殖调节性t细胞。
6.本技术中，所述融合蛋白能选择性促进人体内调节性t细胞的增殖，进而有效降低机体内的炎症反应；同时所述融合蛋白能够在肠道内富集，进而能选择性的降低机体肠道内的炎症反应，有效避免所述融合蛋白进入体内后所引起的全身性副作用。因此，本技术所
述的融合蛋白能够较好地应用在炎症性肠病的预防和治疗中。
7.本技术中，术语“能够在肠道内富集”是指本技术所述的融合蛋白进入机体内后，能够使得肠道内的所述融合蛋白的含量远远高于机体内其他组织内的含量。
8.在一些优选的实施方式中，所述融合蛋白的氨基酸序列如seq id no:1所示。
9.本技术中，所述氨基酸序列如seq id no:1所示的融合蛋白的制备可由公认的重组dna技术实现，所述公认的重组dna技术包括聚合酶链式反应(pcr)、克隆载体的制备、用限制性内切酶酶解dna、表达载体的制备、表达载体转染宿主细胞、宿主细胞的培养等。另外，所述氨基酸序列如seq id no:1所示的融合蛋白的制备也可直接通过基因合成的方式实现。通过基因合成的方式进行制备，首先要体外合成设计用于编码所述融合蛋白的核酸分子，然后将所合成的核酸分子连接到表达载体上，最后将所述表达载体转染到宿主细胞中，并对宿主细胞进行诱导表达，进而获得所述融合蛋白。
10.本技术第二方面提供了一种用于编码如本技术第一方面所述融合蛋白的核酸分子。
11.本技术中，所述核酸分子包括本领域已知的通过使本技术所提供的融合蛋白的氨基酸序列翻译成多核苷酸序列而获得的任何核酸分子。
12.在一些优选的实施方式中，所述核酸分子的核苷酸序列如seq id no:2所示。
13.本技术第三方面提供了一种包含如本技术第二方面所述核酸分子的表达载体。
14.本技术中，所述表达载体的构建可以通过限制性内切酶酶切、dna分子连接、大肠杆菌转化等步骤实现。对于本领域技术人员的而言，任何已知的表达载体均可用作本技术中的表达载体，并且可根据靶宿主细胞的性质选择来选择表达载体。
15.本技术第四方面提供了一种包含如本技术第三方面所述表达载体的宿主细胞。
16.本技术中，所述宿主细胞为真核细胞，例如为酵母、昆虫细胞、动物细胞；优选为动物细胞；更优选为哺乳动物细胞。
17.本技术中，可以通过转染将所述表达载体导入所述宿主细胞中。本技术对转染时采取的方式没有明确限定，本领域技术人员可以进行常规选择。例如，可以通过磷酸钙转染、病毒感染、deae-葡萄聚糖介导的转染、脂质体转染或电穿孔等方式，来将所述表达载体导入所述宿主细胞中。
18.本技术第五方面提供了一种药物组合物，其包括如本技术第一方面所述的融合蛋白。
19.在一些实施方式中，所述药物组合物中还包括药学上可接受的辅料。
20.本技术中，所述药学上可接受的辅料例如可以为：盐溶液、葡萄糖溶液、防腐剂、增溶剂、止痛剂等。
21.本技术第六方面提供了一种如本技术第一方面所述的融合蛋白、或者第五方面所述的药物组合物在制备用于预防或治疗免疫系统疾病的药物中的应用。
22.本技术中，所述的免疫系统疾病不是自身免疫病，而是由于免疫系统紊乱所导致的疾病。
23.本技术中，“预防”可包括但不限于使用本技术所述的药物阻断疾病症状、或者抑制或延迟症状的任何行为。“治疗”可包括但不限于使用本技术所述的药物来改善或有益地改变疾病症状的任何行为。
24.在一些实施方式中，所述免疫系统疾病为炎症性肠病。
25.本技术中，所述炎症性肠病由溃疡性结肠炎和克罗恩病组成。
26.本技术的有益技术效果：本技术提供了一种新的融合蛋白，所述融合蛋白能选择性促进人体内调节性t细胞的增殖，进而有效降低机体内的炎症反应；同时所述融合蛋白能够在肠道内富集，进而能选择性的降低机体肠道内的炎症反应，有效避免所述融合蛋白进入体内后所引起的全身性副作用。因此，本技术所述的融合蛋白能够较好地应用在炎症性肠病的预防和治疗中。
附图说明
27.图1为在哺乳动物细胞中表达和纯化后的本技术所述的融合蛋白hg28的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱。
28.图2为本技术所述融合蛋白hg28在转基因小鼠不同组织内的含量分布图。
具体实施方式
29.为使本技术更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本技术，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本技术的应用范围。本技术中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。
30.实施例1：融合蛋白hg28的制备首先采用全基因合成的方式制得用于编码所述融合蛋白hg28的核酸分子，所述核酸分子的核苷酸序列如seq id no:2所示，然后将所述核酸分子连接到相应的表达载体上，构建包含所述核酸分子的表达载体。
31.将构建好的表达载体转染至哺乳动物细胞中，制得包含所述表达载体的哺乳动物细胞。然后对所述哺乳动物细胞进行培养，诱导融合蛋白hg28的表达，并对表达后的融合蛋白进行纯化，制得融合蛋白hg28。制得的融合蛋白hg28氨基酸序列如seq id no:1所示。
32.本技术中所述融合蛋白hg28委托第三方生物公司进行制备，因此对制备细节不做详细描述。
33.对制得的融合蛋白hg28进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，其电泳图谱如图1所示。图1中，“m”表示蛋白质分子量标准(蛋白质marker)，“r”表示对融合蛋白hg28进行还原后的电泳条带，“n-r”表示不对融合蛋白hg28进行还原的电泳条带。
34.从图1可知，经还原后，所述融合蛋白hg28被降解成两个片段，电泳结果出现了两个条带；而不进行还原，所述融合蛋白hg28的电泳结果仅出现一个条带，电泳结合符合预期。
35.实施例2：融合蛋白hg28在肠道内的富集通过静脉注射将实施例1制得的融合蛋白hg28注入转基因小鼠体内，并检测所述转基因小鼠的心脏、肺、肝、肾脏、肠道和胆囊中融合蛋白hg28的含量，结果如图2所示。
36.从图2可知，小鼠肠道内融合蛋白hg28的含量远远高于其他组织内的融合蛋白hg28的含量，说明本技术所制得的融合蛋白hg28能够在肠道内富集。
37.实施例3：融合蛋白hg28对调节性t细胞的增殖作用将融合蛋白hg28分别添加到细胞cd4
+
cd25
+
和细胞cd4
+
cd25-的细胞培养液中，融
合蛋白hg28在细胞培养液中的浓度均为100u/ml，培养6小时后收获细胞，并采用pcr技术检测培养后的细胞cd4
+
cd25
+
和细胞cd4
+
cd25-中foxp3基因表达情况，检测时采用的引物为：5
′‑
ggacgtccctttctgactg-3
′
(seq id no:3)和5
′‑
tcacctaccacatccaccag-3
′
(seq id no:4)。
38.检测结果表明，细胞培养液中添加融合蛋白hg28后，细胞cd4
+
cd25
+
中foxp3基因的表达量增加了5.6倍；而在细胞cd4
+
cd25-中，几乎检测不到foxp3基因的表达。说明本技术的融合蛋白hg28具有诱导调节性t细胞增殖的作用，因而能够降低机体肠道内的炎症反应。
39.应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本技术，并不构成对本技术的任何限制。通过参照典型实施例对本技术进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本技术权利要求的范围内对本技术作出修改，以及在不背离本技术的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本技术涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本技术限于其中公开的特定例，相反，本技术可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。