一种动物双歧杆菌SF及其在医药和食品中的应用

一种动物双歧杆菌sf及其在医药和食品中的应用
技术领域
1.本发明属微生物领域，具体涉及一种动物双歧杆菌sf及在医药和食品中的其应用。


背景技术：

2.伊利替康(cpt-11)是植物生物碱喜树碱的半合成水溶性衍生物，已被用于治疗多种类型的实体瘤。但在临床应用中常引起不良反应，如迟发性腹泻、呕吐、中性粒细胞减少等，限制了其临床应用。cpt-11在治疗过程中会产生肠道毒性，导致肠黏膜屏障受损，进而导致肠道功能下降，这些影响可能导致多达87％的患者出现延迟腹泻，其中30-40％的患者出现严重腹泻。近年来关于 cpt-11副作用机制研究以及预防和治疗，已成为国内外生物学、医药学研究的热点之一。
3.益生菌被定义为有活力的微生物，其中足够数量的益生菌以活跃状态到达肠道，从而对健康产生积极影响。益生菌可在肠道定殖，补充有益菌群，维持肠道菌群平衡，缓解疾病。有研究表明益生菌可通过调节肠道菌群缓解便秘、结肠炎等疾病。
4.双歧杆菌是最重要的益生菌之一，其对人体健康具有生物屏障、营养作用、抗肿瘤作用、免疫增强作用、改善胃肠道功能、抗衰老等多种重要的生理功能，广泛用于食品和医药行业。双歧杆菌有32个亚型，如双歧杆菌、长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、梭形双歧杆菌、链状双歧杆菌、假链状双歧杆菌和齿状双歧杆菌等。众多研究已经证明双歧杆菌能抑制人体有害细菌的生长，抵抗病原菌的感染，合成人体需要的维生素，促进人体对矿物质的吸收，产生醋酸、丙酸、丁酸和乳酸等有机酸刺激肠道蠕动，促进排便，防止便秘以及抑制肠道腐败作用、净化肠道环境、分解致癌物质、刺激人体免疫系统，从而提高抗病能力等方面有着重要作用。但即属于同一个属，不同种的双歧杆菌，生物活性或者生物功能也各有不同。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种新的动物双歧杆菌sf，以及其在医药和食品中的应用。
6.本发明的第一个方面，是提供了一种能促进伊利替康抑瘤作用和缓解伊利替康副作用动物双歧杆菌sf。
7.一种动物双歧杆菌(bifidobacterium animalis subsp.lactis)sf，其保藏号为cctcc no:m2021048。
8.本发明的第二个方面，是提供了上述动物双歧杆菌 (bifidobacterium animalis subsp.lactis)sf的应用。
9.所述动物双歧杆菌(bifidobacterium animalis subsp.lactis)sf或其代谢产物、或其提取液在制备预防和治疗结直肠癌的制剂中的应用。
10.所述动物双歧杆菌(bifidobacterium animalis subsp.lactis)sf或其代谢产
物、或其提取液在制备预防和治疗肠道炎症、肠道损伤和/或腹泻的制剂中的应用。
11.所述动物双歧杆菌(bifidobacterium animalis subsp.lactis)sf或其代谢产物、或其提取液在制备缓解伊利替康副作用的制剂中的应用。
12.所述动物双歧杆菌(bifidobacterium animalis subsp.lactis)sf或其代谢产物、或其提取液在制备促进伊利替康抑制肿瘤的作用的制剂中的应用。
13.在其中一些实施例中，所述制剂为药物或保健品或食品或者菌剂。
14.在其中一个实施例中，所述食品为乳制品、蔬菜制品、饮料制品和其他发酵类制品，例如饮料、酸奶或果冻。
15.所述保健品为液体状保健品、颗粒状保健品、粉末状保健品、胶囊保健品或片状保健品；或所述药品为溶液剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂或片剂
16.在其中一个实施例中，所述副作用包括由伊利替康导致的肠道损伤和/或腹泻。
17.本发明的第三个方面，是提供了一种益生菌菌剂，其包括活性成分以及药学上或者食品上可接受的辅料，所述活性成分包括上述动物双歧杆菌 (bifidobacterium animalis subsp.lactis)sf或其代谢产物、或其提取液。
18.在其中一个实施例中，所述益生菌菌剂由动物双歧杆菌sf制备而成，并以新鲜活菌菌体形式存在。
19.本发明所述的动物双歧杆菌sf，2021年1月12日保存于武汉市中国典型培养物保藏中心(china center for type culture collection，简称cctcc m，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，邮编：430072)，保藏编号为cctcc no：m 2021048。
20.本发明的发明人筛选到一株新的动物双歧杆菌sf(cctcc no：m 2021048)，经过体外实验证明，本发明所述的动物双歧杆菌sf不但能抑制结肠癌细胞活性并促进其凋亡，而且，还能促进伊利替康的抑瘤作用，并且，经过动物实验证明，本发明动物双歧杆菌sf能有效缓解伊利替康造成的副作用，包括伊利替康导致的肠道损伤和/或腹泻，所述动物双歧杆菌sf(cctccm2021048)具有非常好的临床药用价值。
附图说明
21.图1是本发明所述动物双歧杆菌sf琼脂平板上生长的示意图。
22.图2是本发明所述动物双歧杆菌sf革兰氏染色100倍镜检的示意图。
23.图3是实施例1中所述细胞实验结果，动物双歧杆菌sf的胞外多糖可抑制结肠癌细胞活性并促进其凋亡；其中a为cck-8法检测hct-8细胞活性结果， b为cck-8法检测caco2细胞活性结果，c为hoechst 33258染色hct-8细胞的200倍镜检结果。
24.图4是实施例2中采用动物实验证明动物双歧杆菌sf促进伊利替康的抑瘤作用；其中a为反映8天中小鼠肿瘤体积变化的折线图，b为抑瘤率结果，c为小鼠肿瘤直拍图。
25.图5是实施例3中采用动物实验建模说明动物双歧杆菌sf影响了小鼠脾脏指数，对肝脏和肾脏指数没有影响，同时也减轻了小鼠腹泻；其中a为脾脏指数， b为肝脏指数，c为肾脏指数，d为腹泻评分。
26.图6是实施例4中所述动物实验结果，采用免疫荧光技术检测小鼠肿瘤组织中 cd4
+
与cd8
+
细胞的含量，说明动物双歧杆菌sf增加了小鼠肿瘤组织中cd4
+
与cd8
+
免疫细胞的含量。
27.图7是实例5中所述fitc-葡聚糖实验、实时荧光定量pcr与组化染色结果图，说明动物双歧杆菌sf缓解了伊利替康的肠道毒性，其中a为fitc浓度，b 为紧密连接蛋白的mrna水平，c为结肠组织中促炎细胞因子的表达水平，d 为结肠组织中抗炎因子的表达水平，e为结肠组织的h&e染色，f为结肠组织的pas染色。
具体实施方式
28.下面对本发明的实施例进行详细说明。
29.本发明提供了一种可缓解伊利替康副作用并促进其抑瘤作用的动物双歧杆菌sf，其可用于制备缓解伊利替康副作用并促进其抑瘤作用药物或保健品或食品。
30.以下实施例中所述的动物双歧杆菌sf，2021年1月12日保存于武汉市中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 2021048。
31.本发明所述的动物双歧杆菌sf的16s rdna序列为：
32.gctccgctccatcgcatggtggggtgggaaatgcttttgcggcatgggatggggtcgcgtcctatcagcttgttggcgg ggtgatggcccaccaaggcgttgacgggtagccggcctgagagggtgaccggccacattgggactgagatacggcc cagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagcgacgccgcgtgcggg atggaggccttcgggttgtaaaccgcttttgttcaagggcaaggcacggtttcggccgtgttgagtggattgttcgaataa gcaccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggtgcgagcgttatccggatttattgggcgtaaaggg ctcgtaggcggttcgtcgcgtccggtgtgaaagtccatcgcctaacggtggatctgcgccgggtacgggcgggctgga gtgcggtaggggagactggaattcccggtgtaacggtggaatgtgtagatatcgggaagaacaccaatggcgaaggc aggtctctgggccgtcactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacg ccgtaaacggtggatgctggatgtggggccctttccacgggtcccgtgtcggagccaacgcgttaagcatcccgcctg gggagtacggccgcaaggctaaaactcaaagaaattgacgggggcccgcacaagcggcggagcatgcggattaatt cgatgcaacgcgaagaaccttacctgggcttgacatgtgccggatcgccgtggagacacggtttcccttcggggcggtt cacaggtggtgcatggtcgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttggttaagtcccgcaacgagcgcaaccctcgccgca tgtgcagcggtgatgcggactcatgtggacgcgggtcactcgaggaggtgggatgacgtcagaatcatcatgccctac gttcagcctcacgcatgctacaatggcgtacacgcggtgcaacggtacctggggcggatccgcctgaaaaccggttct ctcagttccggataaagggtgttctaccttagacggctcccccacaagggtcgggccaccggcttcgggtgctacccac tttcatgacttgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgcattcaccgcggcgttgctgatccgcgattactagcga ctccgccttcacgcagtcgagttgcagactgcgatccgaactgagaccggttttcagcgatccgccccacgtcaccgtg tcgcaccgcgttgtaccggccattgtagcatgcgtgaagccctggacgtaaggggcatgatgatctgacgtcatcccca ccttcctccgagttgaccccggcggtcccacatgagttcccggcatcacccgctggcaacatgcggcgagggttgcgc tcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacgaccatgcaccacctgtgaaccggccccgaag ggaaaccgtgtctccacggcgatccggcacatgtcaagcccaggtaaggttcttcgcgttgcatcgaattaatccgcatg ctccgccgcttgtgcgggcccccgtcaatttctttgagttttagccttgcggccgtactccccaggcgggatgcttaacgc gttggctccgacacgggacccgtggaaagggccccacatccagcatccaccgtttacggcgtggactaccagggtatc taatcctgttcgctccccacgctttcgctcctcagcgtcagtgacggcccagagacctgccttcgccattggtgttcttccc gatatctacacattccaccgttacaccgggaattccagtctcccctaccgcactccagcccgcccgtacccggcgcaga tccaccgttaggcgatggactttcacaccggacgcgacgaaccgcctacgagcccttt
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33.本发明所述的动物双歧杆菌sf菌落小而凸圆、边缘完整，呈乳白色，表面光滑湿润有光泽，如图1所示。
34.本发明所述的动物双歧杆菌sf革兰氏染色100倍镜检，如图2所示动物双歧杆菌sf是革兰氏阳性杆菌，菌体长短不一，呈弯曲状、刮勺状。
35.实施例1动物双歧杆菌sf的胞外多糖可抑制结肠癌细胞活性并促进其凋亡
36.动物双歧杆菌sf的胞外多糖(eps)的提取；(1)活化动物动物双歧杆菌sf，按接种量1％接至bs培养基，37℃厌氧培养24h；(2)8000r/min，离心10min，将上清转移至另一锥形瓶中；(3)发酵上清液加入3倍体积95％乙醇，4℃沉淀24h；(4)8000r/min，离心10min，弃上清，得沉淀，吹干后加入蒸馏水溶解；(5)sevag法脱蛋白：加入1/3体积的sevag液(氯仿：正丁醇＝3：1)，震荡30min，4000r/min，15min离心去沉淀；(6)重复步骤5，直到没有白色沉淀析出；(7)乙醇沉淀：加入3倍体积的95％乙醇，充分震荡至多糖如絮状沉淀析出，4000r/min，15min离心，收集沉淀；(8)多糖溶解：吹干沉淀，用5ml蒸馏水溶解，取2ml用14000da透析袋透析72h；(9)吸取剩余的液体真空冷冻干燥得多糖。
37.小鼠结肠腺癌细胞株hct-8和caco2在含有10％胎牛血清、100u/ml 青霉素和100μg/ml链霉素的rpmi-1640培养基中于5％co2的加湿培养箱中 37℃培养。
38.按照每孔约1
×
104hct-8或caco2细胞接种在96孔细胞培养板中。然后，在37℃、5％co2的潮湿环境中孵育12小时后，在与上述相同的条件下，将动物双歧杆菌sf胞外多糖(eps)与细胞在37℃下共孵育24小时和48小时。最后每孔加入10μl cck-8试剂，37℃孵育1h后测定od450。每个浓度占对照的百分比表示为细胞活力。
39.用hoechst 33258染色后，在荧光显微镜下测定细胞凋亡的形态变化。细胞用不同浓度的eps(0、100、200、400、800和1600μg/ml)处理48h，用 5mg/l hoechst 33258在37℃染色30分钟，然后在标准激发的荧光显微镜下观察过滤器。凋亡细胞被定义为显示细胞核和细胞质收缩、染色质浓缩和凋亡小体的细胞。
40.实施例1结果如图3a与3b所示，不同浓度的动物双歧杆菌胞外多糖eps 对hct-8细胞(a)与caco2(b)细胞的活性有一定的抑制作用，当处理时间为48h且eps浓度达到1600μg/ml时，eps对hct-8细胞的抑制率高达41.2％，而浓度为800、1600μg/ml的eps对caco2细胞活性有明显的抑制作用，当eps 浓度达到1600μg/ml，处理时间为48h时，抑制率达36.4％。参见图3c，对于 hoechst染色实验，control组的细胞核呈正常的蓝色，而加入了较高浓度eps 的处理组的部分细胞染色质固缩，呈致密浓染的状态，颜色发白，说明eps可促进结肠癌细胞hct-8凋亡。*p《0.05；**p《0.01。
41.实施例2：动物双歧杆菌sf促进了伊利替康的抑瘤作用
42.将-80℃冻存的植物乳杆菌动物双歧杆菌sf冻干粉用接种环挑取，于无菌 bs固体平板上划线活化，37℃厌氧培养24h复苏，经2次传代活化后转接无菌bs液体培养基，过夜培养。将活化2代后的动物双歧杆菌sf按2％接种于无菌bs液态培养基中，37℃厌氧培养24h后
进行活菌计数。将培养液以 8000rpm离心3min后弃去上清液，根据活菌计数结果，用无菌1
×
pbs缓冲液将菌体制成1
×
109cfu/ml的菌液，每天制备一次菌液。
43.正常日粮预饲一周后，采用购自北京维通利华公司的balb/c小鼠皮下注射肿瘤细胞构建荷瘤小鼠模型。根据肿瘤大小，将18只荷瘤小鼠分为三组，肿瘤(md)组，给药(cpt)组和动物双歧杆菌辅助(sf)组。md组与cpt 组小鼠灌胃无菌1
×
pbs，sf组小鼠灌胃动物双歧杆菌sf菌液(1
×
108cfu/ml) 0.1ml，连续灌胃8天。md组每2天腹腔注射0.1ml生理盐水，cpt组与sf 组每2天腹腔注射0.1ml cpt-11溶液。实验总共持续8天，每天使用游标卡尺监测肿瘤大小，并通过以下公式计算：(宽度mm)2×
(长度mm)/2。
44.实施例2结果如图4所示，在动物双歧杆菌sf作用下，sf组荷瘤小鼠的肿瘤体积增长速度明显低于单药cpt组，且抑瘤率显著提高。*p《0.05；***p 《0.001。
45.实施例3：动物双歧杆菌sf影响了小鼠脾脏指数，对肝脏和肾脏指数没有影响，同时也减轻了小鼠腹泻
46.动物实验建模同实施例2。处死小鼠后对小鼠进行眼球采血，收集小鼠肝脏、肾脏和脾脏，计算脏器指数同时，通过腹泻评分标准，记录小鼠腹泻指数，0(正常)，固体大便；1(轻度腹泻)，略湿软便；2(中度腹泻)，湿而未成形的大便，有中度的肛周染色；3(严重腹泻)，水样大便，有严重的肛周染色。
47.结果如图5a-5c所示，与md组相比，cpt组的脾脏指数显著升高，而肝脏指数与肾脏指数没有影响，说明cpt-11可能影响了小鼠的免疫系统，而 sf组的脾脏指数较之cpt组有更为显著的变化，这说明动物双歧杆菌sf的加入或许进一步加深了小鼠免疫系统的变化。同时，如图5d所示，cpt-11的摄入显著增加了md组小鼠的腹泻评分，而动物双歧杆菌sf对腹泻有所缓解。
48.*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001。
49.实施例4：动物双歧杆菌sf增加了小鼠肿瘤组织中cd4+与cd8+免疫细胞的含量
50.动物实验建模同实施例2。处死小鼠后收集小鼠肿瘤组织，采用免疫荧光技术检测小鼠cd4+与cd8+细胞的含量。
51.可以看出，cpt组的cd4+(红色荧光)和cd8+t(绿色荧光)细胞明显多于md组。动物双歧杆菌sf干扰后，sf组cd4
+
(红色荧光)和cd8
+
t(绿色荧光)细胞多于cpt组。cd4
+
t细胞(辅助性t细胞)和cd8+t细胞(细胞毒性t细胞)是幼稚t细胞分化获得的两种类型，两者都是肿瘤免疫治疗过程中重要的t淋巴细胞。cd4
+
t细胞可协助其他淋巴细胞参与免疫反应，如识别抗原、释放调节性细胞因子、激活效应t细胞等，而cd8
+
t细胞可直接破坏异常组织细胞，或释放il-2、ifn-γ等效应分子参与免疫反应。因此，动物双歧杆菌sf可以有效促进淋巴细胞的增殖和分化从而抑制肿瘤生长。**p《 0.01(图6)。
52.实施例5：动物双歧杆菌sf缓解了伊利替康的肠道毒性，包括肠道屏障受损、肠道炎症以及肠道病理损伤
53.动物实验建模同实施例2。处死小鼠后取实验小鼠的结肠组织，采用实时荧光定量pcr检测小鼠肠道紧密连接蛋白(zonula occludin-1、claudin-3和 occludin)和炎症因子(图7b-d)，制作石蜡切片，进行he染色和pas染色(图7e-f)，并通过fitc-葡聚糖实验(图7a)检测肠道通透性。如图7，与 md组相比，cpt组fitc-葡聚糖浓度显著增加，而sf组fitc-葡聚
糖浓度与 md组相似。同时，与md组相比，cpt-11治疗还降低了claudin-3、zo-1和 occludin的mrna水平，而sf组抑制了这种下降趋势。在cpt组中，结肠中促炎细胞因子(il-6、tnf-α、ifn-γ和il-1β)的mrna表达显著上调，动物双歧杆菌sf干预显著下调这些促炎细胞因子的表达。此外，cpt-11处理还增加了tgf-β和il-22的mrna表达水平，同时降低了il-10的表达水平。然而，动物双歧杆菌sf干预也显著下调tgf-β和il-22的表达，并上调荷瘤小鼠中 il-10的表达。结肠组织h&e和pas染色显示，与md组相比，cpt组肠道损伤明显，表现为炎症浸润和上皮增生，杯状细胞大量丢失。然而，sf组的炎症细胞浸润减少，表明动物双歧杆菌sf干预显着减轻了结肠炎症。*p《0.05； **p《0.01；***p《0.001；*is compared with cpt。
54.结果预示动物双歧杆菌sf可能在未来成为有效的缓解伊利替康造成的肠道毒性，包括肠道屏障受损、肠道炎症以及肠道病理损伤等副作用药物。
55.以上仅为本发明的具体实施例，并不以此限定本发明的保护范围；在不违反本发明构思的基础上所作的任何替换与改进，均属本发明的保护范围。