抗B7-H3的单克隆抗体及其在细胞治疗中的应用的制作方法

抗b7-h3的单克隆抗体及其在细胞治疗中的应用
1.本技术是申请日为2018年9月26日、申请号为201811125056.4、发明名称为“抗b7-h3的单克隆抗体及其在细胞治疗中的应用”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及抗b7-h3的单克隆抗体及其在细胞治疗中的应用。


背景技术：

3.肿瘤细胞表达的靶向分子是肿瘤能够被识别并进而应用于治疗的主要决定因素。目前各种肿瘤治疗技术包括靶向治疗、抗体或/和car-t细胞等免疫治疗手段，都有赖于肿瘤及其相关成分上表达的特异性靶向分子。靶向分子的特异性与肿瘤治疗的疗效、治疗副作用程度等密切相关。b7-h3在正常组织、细胞中不表达或极低表达，但在大部分实体性恶性肿瘤细胞上以及肿瘤内血管内皮细胞上呈高表达，是良好的特异性的肿瘤靶向分子。
4.单克隆抗体是针对某一特定抗原表位的由单一b细胞克隆产生的抗体。单克隆抗体通过识别特异性的靶向分子，已经广泛应用于生物、医学的研究，临床诊断和治疗等。
5.嵌合性抗原受体t细胞治疗是一种通过对t细胞进行嵌合抗原受体(car)的基因修饰，形成表达car的t细胞(car-t)后，将car-t细胞回输给机体用于治疗的一种技术方法。car-t细胞治疗肿瘤是当前研究和应用开发的热门领域。通常，car-t细胞通过car分子上的单链抗体可变区(scfv)来识别肿瘤细胞上的特异性靶向分子并杀伤肿瘤细胞，进而发挥抗肿瘤免疫效应。
6.目前针对b7-h3靶向分子的抗体在治疗肿瘤上的疗效尚不明确。这个抗体主要是作为免疫细胞上的抑制分子的阻断和调节来进行临床应用的，但是，由于b7-h3分子的免疫功能机制尚不明确，其疗效尚未可知。
7.目前，car-t细胞治疗实体瘤的疗效尚欠佳。有效的肿瘤特异性靶向分子是car-t细胞治疗的主要因素之一，针对实体瘤的目前已知的靶向分子的car-t细胞治疗都尚未取得确切和持久的疗效。
8.因此，本领域迫切需要开发一类特异性靶向b7-h3，且具有肿瘤良好杀伤效果的抗体、及其相应的工程化的免疫细胞。


技术实现要素：

9.本发明的目的在于提供一类特异性靶向b7-h3，且具有肿瘤良好杀伤效果的抗体、及其相应的工程化的免疫细胞。
10.本发明第一方面提供了一种抗体的重链可变区，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区cdr：
11.seq id no:1、2或3所示的cdr1，
12.seq id no:4、5或6所示的cdr2，和
13.seq id no:7、8或9所示的cdr3。
14.在另一优选例中，所述重链可变区的cdr包括seq id no:nh,nh+3,和nh+6所示的3个cdr，其中nh分别为1、2或3。
15.在另一优选例中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)氨基酸并能够保留b7-h3结合亲和力的衍生序列。
16.在另一优选例中，所述重链可变区还包括人源的fr区或鼠源的fr区。
17.在另一优选例中，所述重链可变区具有seq id no:19-24中任一所示的氨基酸序列。
18.本发明第二方面提供了一种抗体的重链，所述的重链具有如本发明第一方面所述的重链可变区。
19.在另一优选例中，所述的抗体的重链还包括重链恒定区。
20.在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源、鼠源或兔源的。
21.本发明第三方面提供了一种抗体的轻链可变区，所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区cdr：
22.seq id no:10、11或12所示的cdr1'，
23.seq id no:13、14或15所示的cdr2'，和
24.seq id no:16、17或18所示的cdr3'。
25.在另一优选例中，所述轻链可变区的cdr包括seq id no:n
l
,n
l
+3,和n
l
+6所示的3个cdr，其中n
l
分别为10、11或12。
26.在另一优选例中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)氨基酸并能够保留b7-h3结合亲和力的衍生序列。
27.在另一优选例中，所述轻链可变区还包括人源的fr区或鼠源的fr区。
28.在另一优选例中，所述轻链可变区具有seq id no:25-30中任一所示的氨基酸序列。
29.本发明第四方面提供了一种抗体的轻链，所述的轻链具有如本发明第三方面所述的轻链可变区。
30.在另一优选例中，所述的抗体的轻链还包括轻链恒定区。
31.在另一优选例中，所述的轻链恒定区为人源、鼠源或兔源的。
32.本发明第五方面提供了一种抗体，所述抗体具有：
33.(1)如本发明第一方面所述的重链可变区；和/或
34.(2)如本发明第三方面所述的轻链可变区。
35.在另一优选例中，所述抗体具有：如本发明第二方面所述的重链；和/或如本发明第四方面所述的轻链。
36.在另一优选例中，所述抗体对人b7-h3(野生型)的亲和力的ka(1/ms)≥1
×
105(例如1
×
105～9
×
105),较佳地≥2
×
105,更佳地≥2.5
×
105。
37.在另一优选例中，所述抗体对人b7-h3(野生型)的亲和力的kd(1/s)≤1.5
×
10-3
(例如2
×
10-5
～1.5
×
10-3
),较佳地≤5
×
10-4
,更佳地≤1
×
10-4
。
38.在另一优选例中，所述抗体对人b7-h3(野生型)的亲和力的kd(m)≤9
×
10-9
(例如1.0
×
10-10
～9
×
10-9
),较佳地≤5
×
10-9
,更佳地≤1
×
10-9
或≤3
×
10-10
。在另一优选例中，所述抗体对人b7-h3(优选野生型)的亲和力的ka(1/ms)为3.160e+5，kd(1/s)为2.184e-4，kd(m)为6.913e-10。
39.在另一优选例中，所述抗体对人b7-h3(优选野生型)的亲和力的ka(1/ms)为2.632e+5,kd(1/s)为1.464e-3,kd(m)为5.563e-9。(人源化hc1+lc1)
40.在另一优选例中，所述抗体对人b7-h3(优选野生型)的亲和力的ka(1/ms)为1.842e+5,kd(1/s)为1.034e-3,kd(m)为5.614e-9。(人源化hc1+lc2)
41.在另一优选例中，所述抗体对人b7-h3(优选野生型)的亲和力的ka(1/ms)为3.272e+5,kd(1/s)为1.358e-3,kd(m)为4.151e-9。(人源化hc1+lc3)
42.在另一优选例中，所述抗体对人b7-h3(优选野生型)的亲和力的ka(1/ms)为2.969e+5,kd(1/s)为4.488e-5,kd(m)为1.512e-10。(人源化hc2+lc1)
43.在另一优选例中，所述抗体对人b7-h3(优选野生型)的亲和力的ka(1/ms)为3.240e+5,kd(1/s)为3.582e-5,kd(m)为1.105e-10。(人源化hc2+lc2)
44.在另一优选例中，所述抗体对人b7-h3(优选野生型)的亲和力的ka(1/ms)为3.020e+5,kd(1/s)为4.257e-5,kd(m)为1.410e-10。(人源化hc2+lc3)
45.在另一优选例中，所述抗体对人b7-h3(优选野生型)的亲和力的ka(1/ms)为2.923e+5,kd(1/s)为6.360e-5,kd(m)为2.176e-10。(人源化hc3+lc1)
46.在另一优选例中，所述抗体对人b7-h3(优选野生型)的亲和力的ka(1/ms)为3.311e+5,kd(1/s)为6.296e-5,kd(m)为1.901e-10。(人源化hc3+lc2)
47.在另一优选例中，所述抗体对人b7-h3(优选野生型)的亲和力的ka(1/ms)为5.036e+5,kd(1/s)为6.333e-5,kd(m)为1.257e-10。(人源化hc3+lc3)
48.在另一优选例中，所述抗体选自下组：动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、或其组合。
49.在另一优选例中，所述的抗体为双链抗体、或单链抗体。
50.在另一优选例中，所述的抗体为单克隆抗体。
51.在另一优选例中，所述的抗体是部分或全人源化的单克隆抗体。
52.在另一优选例中，所述抗体的重链可变区序列如seq id no:19-24中任一所示；和/或
53.所述的抗体的轻链可变区序列如seq id no:25-30中任一所示。
54.在另一优选例中，所述的抗体为igg类型。
55.在另一优选例中，所述的抗体为药物偶联物形式。
56.本发明第六方面提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：
57.(i)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗体；以及
58.(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
59.在另一优选例中，所述的标签序列包括6his标签。
60.在另一优选例中，所述的重组蛋白(或多肽)包括融合蛋白。
61.在另一优选例中，所述的重组蛋白为单体、二聚体、或多聚体。
62.本发明第七方面提供了一种car构建物，所述的car构建物的抗原结合区为特异性结合于b7-h3的scfv，并且所述scfv具有如本发明第一方面所述的重链可变区和如本发明第三方面所述的轻链可变区。
63.在另一优选例中，所述car的结构如下式i所示：
64.l-scfv-h-tm-c-cd3ζ-z-p
ꢀꢀꢀꢀ(i)65.式中，
66.各
“‑”
独立地为连接肽或肽键；
67.l为无或信号肽序列；
68.scfv为靶向b7-h3的单链可变区序列；
69.h为无或铰链区；
70.tm为跨膜结构域；
71.c为共刺激信号分子；
72.cd3ζ为源于cd3ζ的胞浆信号传导序列；
73.z为无或自剪切蛋白的编码序列；
74.p为无或包含pd1-cd28或pd1-il7r融合蛋白的编码序列。
75.在另一优选例中，所述的scfv的结构如式a1或a2所示：
[0076]vl-vhꢀꢀꢀ
(a1)；或
[0077]vh-v
l
ꢀꢀ
(a2)
[0078]
其中，v
l
为抗b7-h3抗体的轻链可变区；vh为抗b7-h3抗体的重链可变区；
“‑”
为连接肽(或柔性接头)或肽键。
[0079]
在另一优选例中，所述的式a1和a2结构为从n端至c端。
[0080]
在另一优选例中，所述的v
l
和vh通过一柔性接头相连。
[0081]
在另一优选例中，所述的柔性接头为1-5个(较佳地，2-4个，更佳地，3-4个)连续的(g)4s所示的序列。
[0082]
在另一优选例中，所述的v
l
和vh各自独立地为鼠源的、人源的、兔源的或人的。
[0083]
在另一优选例中，v
l
的氨基酸序列包括选自seq id no.:25-30中任一所示的v
l
或其衍生v
l
(或其活性片段)。
[0084]
在另一优选例中，vh的氨基酸序列包括选自seq id no.:19-24中任一所示的vh或其衍生vh(或其活性片段)。
[0085]
在另一优选例中，所述的scfv为鼠源、人源、人源和鼠源嵌合、或者全人源化的单链抗体可变区片段。
[0086]
在另一优选例中，所述l为选自下组的蛋白的信号肽：cd8、cd28、gm-csf、csf2rb、cd4、cd137、il-2、ifnr、或其组合。
[0087]
在另一优选例中，所述h为选自下组的蛋白的绞链区：cd8、cd28、cd137、cd80、cd86、或其组合。
[0088]
在另一优选例中，所述的tm为选自下组的蛋白的跨膜区：cd28、cd3 epsilon、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、或其组合。
[0089]
在另一优选例中，所述的c为选自下组的蛋白的共刺激信号分子：ox40、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd70、cd134、4-1bb(cd137)、pd1、dap10、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、nkg2d、gitr、tlr2、或其组合。
[0090]
在另一优选例中，所述的c为cd28和/或4-1bb(cd137)来源的共刺激信号分子。
[0091]
在另一优选例中，所述自剪切蛋白选自下组：t2a、p2a、e2a、f2a、或其组合。
[0092]
在另一优选例中，所述自剪切蛋白选自下组：furin-v5-sgsg-t2a、furin-v5-sgsg-p2a、furin-v5—sgsg-e2a、furin-v5-sgsg-f2a、或其组合。
[0093]
在另一优选例中，所述自剪切蛋白选自下组：furin-sgsg-t2a、furin-sgsg-p2a、furin-sgsg-e2a、furin-sgsg-f2a、或其组合。
[0094]
在另一优选例中，所述融合蛋白的结构如式ii所示：
[0095]
l1-i1-l2-h1-tm1-c1
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(ii)
[0096]
式中，
[0097]
各
“‑”
独立地为连接肽或肽键
[0098]
l1为无或信号肽序列；
[0099]
i1为pd-1的胞外段；
[0100]
l2为无或连接肽元件；
[0101]
h1为任选的铰链区；
[0102]
tm1为无或跨膜结构域；
[0103]
c1为无或胞内结构域。
[0104]
在另一优选例中，所述l1为选自下组的蛋白的信号肽：gm-csf、cd4、cd8、il-2、ifnr、tnf、或其组合。
[0105]
在另一优选例中，所述l1的信号肽序列为malpvtalllplalllhaarp(seq id no:31)。
[0106]
在另一优选例中，所述pd-1胞外段具有如seq id no:32所示的氨基酸序列。
[0107]
在另一优选例中，所述pd-1胞外段的氨基酸序列如seq id no:32所示。
[0108]
在另一优选例中，所述连接肽元件为1-9个(较佳地，2-7个，更佳地，2-4个)连续的g4s、mlgg3uh、lfl、ctprs、zag、β2m、polypro(glyc)、polypro、glyser(glyc)、或其组合的序列。
[0109]
在另一优选例中，所述h1为选自下组的蛋白的绞链区：igg4、cd8、cd28、cd137、或其组合。
[0110]
在另一优选例中，所述的tm1为选自下组的蛋白的跨膜区：cd4、cd8、cd28、或其组合。
[0111]
在另一优选例中，所述tm1为选自下组的蛋白的跨膜区：cd28。
[0112]
在另一优选例中，所述tm1具有seq id no:33所示的氨基酸序列。
[0113]
在另一优选例中，所述tm1的氨基酸序列如seq id no:33所示。
[0114]
在另一优选例中，所述的c1为选自下组的蛋白的胞内段：cd137、cd28、il-7r、或其组合。
[0115]
在另一优选例中，所述c1为cd28和/或il-7r来源的胞内段。
[0116]
在另一优选例中，所述c1具有如seq id no:34所示的氨基酸序列。
[0117]
在另一优选例中，所述p元件具有如seq id no:35所示的氨基酸序列。
[0118]
在另一优选例中，所述p元件的编码序列具有如seq id no:36所示的核苷酸序列。
[0119]
在另一优选例中，所述car的氨基酸序列如seq id no:37所示。
[0120]
在另一优选例中，所述car的编码序列如seq id no:38所示。
[0121]
本发明第八方面提供了一种工程化的免疫细胞，所述的免疫细胞包括：
[0122]
(a)第一表达盒，所述第一表达盒用表达外源的如本发明第七方面所述的car构建物；和
[0123]
(b)任选的第二表达盒，所述第二表达盒表达包含pd1-cd28或pd1-il7r的融合蛋白。
[0124]
在另一优选例中，所述第一表达盒和所述第二表达盒之间通过自剪切蛋白的编码序列连接(或串联)。
[0125]
在另一优选例中，所述自剪切蛋白选自下组：t2a、p2a、e2a、f2a、或其组合。
[0126]
在另一优选例中，所述自剪切蛋白选自下组：furin-v5-sgsg-t2a、furin-v5-sgsg-p2a、furin-v5—sgsg-e2a、furin-v5-sgsg-f2a、或其组合。
[0127]
在另一优选例中，所述自剪切蛋白选自下组：furin-sgsg-t2a、furin-sgsg-p2a、furin-sgsg-e2a、furin-sgsg-f2a、或其组合。
[0128]
在另一优选例中，所述融合蛋白的结果如式ii所示：
[0129]
l1-i1-l2-h1-tm1-c1
ꢀꢀꢀꢀꢀ
(ii)
[0130]
式中，
[0131]
各
“‑”
独立地为连接肽或肽键
[0132]
l1为无或信号肽序列；
[0133]
i1为pd-1的胞外段；
[0134]
l2为无或连接肽元件；
[0135]
h1为任选的铰链区；
[0136]
tm1为无或跨膜结构域；
[0137]
c1为无或胞内结构域。
[0138]
在另一优选例中，所述融合蛋白具有如seq id no:35所示的氨基酸序列。
[0139]
在另一优选例中，所述融合蛋白的编码序列具有如seq id no:36所示的核苷酸序列。
[0140]
在另一优选例中，所述第一表达盒含有编码权利要求7所述的car构建物的核酸序列。
[0141]
在另一优选例中，所述第二表达盒含有编码所述融合蛋白的核酸序列。
[0142]
在另一优选例中，所述第一表达盒和第二表达盒分别还包含启动子和/或终止子。
[0143]
在另一优选例中，所述启动子为哺乳动物启动子，优选地为hef1。
[0144]
在另一优选例中，所述启动子的序列如seq id no:39所示。
[0145]
在另一优选例中，所述的第一表达盒和第二表达盒位于载体上或整合在所述工程化的免疫细胞的染色体中。
[0146]
在另一优选例中，所述的第一表达盒和第二表达盒是独立的或相连的。
[0147]
在另一优选例中，所述的第一表达盒和第二表达盒位于相同或不同的载体上。
[0148]
在另一优选例中，所述的第一表达盒和第二表达盒位于同一载体。
[0149]
在另一优选例中，所述的载体选自下组：dna、rna、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、溶瘤病毒载体、其他基因转移系统、或其组合。
[0150]
在另一优选例中，所述的载体为慢病毒载体。
[0151]
在另一优选例中，所述的载体为转座子载体。
[0152]
在另一优选例中，所述细胞为哺乳动物细胞。
[0153]
在另一优选例中，所述免疫细胞是离体的。
[0154]
在另一优选例中，所述免疫细胞为自体的。
[0155]
在另一优选例中，所述免疫细胞为非自体的。
[0156]
在另一优选例中，所述的免疫细胞来自人或非人哺乳动物(如鼠)。
[0157]
在另一优选例中，所述免疫细胞来自灵长目动物(优选为人)。
[0158]
在另一优选例中，所述的免疫细胞选自下组：
[0159]
(i)嵌合抗原受体t细胞(car-t细胞)；
[0160]
(ii)嵌合抗原受体nk细胞(car-nk细胞)；或
[0161]
(iii)外源t细胞受体(tcr)t细胞(tcr-t细胞)
[0162]
在另一优选例中，所述的免疫细胞包括：nk细胞、t细胞、nkt细胞、(γδ)t细胞、单核细胞、或巨噬细胞。
[0163]
本发明第九方面提供了一种抗体药物偶联物，所述的抗体药物偶联物含有：
[0164]
(a)抗体部分，所述抗体部分选自下组：如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗体、或其组合；和
[0165]
(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。
[0166]
在另一优选例中，所述的抗体部分与所述的偶联部分通过化学键或接头进行偶联。
[0167]
本发明第十方面提供了一种本发明第一方面所述的重链可变区、本发明第二方面所述的重链、本发明第三方面所述的轻链可变区、本发明第四方面所述的轻链、本发明第五方面所述的抗体、本发明第六方面所述的重组蛋白、本发明第七方面所述的car构建物、本发明第八方面所述的免疫细胞、或本发明第九方面所述的抗体药物偶联物的用途，用于(i)制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂；和/或(ii)制备检测试剂或试剂盒。
[0168]
在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：血液肿瘤、实体瘤、或其组合。
[0169]
在另一优选例中，所述血液肿瘤选自下组：急性髓细胞白血病(aml)、多发性骨髓瘤(mm)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、急性淋巴白血病(all)、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、或其组合。
[0170]
在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、骨肉瘤，前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(nsclc)、神经系统肿瘤、脑胶质瘤、神经母细胞瘤，转移行恶性肿瘤、实体瘤腹腔转移、实体瘤盆腔转移、或其组合。
[0171]
在另一优选例中，所述肿瘤表达或高表达b7-h3。
[0172]
在另一优选例中，所述肿瘤包括b7-h3阳性的肿瘤。
[0173]
在另一优选例中，所述肿瘤包括肿瘤血管内皮细胞阳性的肿瘤。
[0174]
在另一优选例中，所述的抗体包括药物偶联物(adc)形式的抗体。
[0175]
在另一优选例中，所述的检测试剂或试剂盒用于诊断表达或高表达b7-h3的肿瘤。
[0176]
在另一优选例中，所述检测试剂或试剂盒用于检测样品中的b7-h3蛋白。
[0177]
在另一优选例中，所述的检测试剂为检测片。
[0178]
本发明第十一方面提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括：
[0179]
本发明第一方面所述的重链可变区、本发明第二方面所述的重链、本发明第三方面所述的轻链可变区、本发明第四方面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗体、本发明第六方面所述的重组蛋白、本发明第七方面所述的car构建物、本发明第八方面所述的免疫细胞、和/或本发明第九方面所述的抗体药物偶联物，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
[0180]
在另一优选例中，所述药物组合物是液态制剂。
[0181]
在另一优选例中，所述药物组合物的剂型是注射剂。
[0182]
在另一优选例中，所述药物组合物中，所述细胞的浓度为1
×
10
3-1
×
109个细胞/ml，较佳地1
×
10
5-1
×
108个细胞/ml。
[0183]
在另一优选例中，所述药物组合物还含有选择性杀伤肿瘤细胞的其他药物(如核酸药物、抗体药物、靶向性药物，其他免疫细胞药物、其他car-t药物、化疗药物、或其组合)。
[0184]
本发明第十二方面提供了一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码选自下组的多肽：
[0185]
(1)本发明第一方面所述的重链可变区、本发明第二方面所述的重链、本发明第三方面所述的轻链可变区、本发明第四方面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗体；
[0186]
(2)本发明第六方面所述的重组蛋白；和
[0187]
(3)本发明第七方面所述的car构建物。
[0188]
本发明第十三方面提供了一种载体，所述的载体含有本发明第十二方面所述的多核苷酸。
[0189]
在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。
[0190]
本发明第十四方面提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第十三方面所述的载体或基因组中整合有本发明第十二方面所述的多核苷酸。
[0191]
本发明第十五方面提供了一种制备工程化免疫细胞的方法，包括以下步骤：
[0192]
(a)提供一待改造的免疫细胞；和
[0193]
(b)将第一表达盒和/或任选的第二表达盒导入到所述待改造的免疫细胞，其中所述第一表达盒表达如本发明第七方面所述的car构建物，所述第二表达盒表达包含pd1-cd28或pd1-il7r的融合蛋白，从而获得工程化的免疫细胞。
[0194]
在另一优选例中，在步骤(b)中，包括(b1)将表达本发明第七方面所述的car构建物的第一表达盒导入所述免疫细胞；和任选的，(b2)将表达所述融合蛋白的第二表达盒导入所述免疫细胞；其中所述的步骤(b1)可在步骤(b2)之前、之后、同时、或交替进行。
[0195]
在另一优选例中，所述第一表达盒含有编码本发明第七方面所述的car构建物的核酸序列。
[0196]
在另一优选例中，所述第二表达盒含有编码所述融合蛋白的核酸序列。
[0197]
在另一优选例中，所述的第一表达盒和第二表达盒位于载体上或整合在所述工程化的免疫细胞的染色体中。
[0198]
在另一优选例中，所述的第一表达盒和第二表达盒位于相同或不同的载体上。
[0199]
在另一优选例中，所述的第一表达盒和第二表达盒位于同一载体。
[0200]
在另一优选例中，所述的载体选自下组：dna、rna、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、溶瘤病毒载体、其他基因转移系统、或其组合。
[0201]
在另一优选例中，所述的载体为病毒载体(如慢病毒载体)。
[0202]
在另一优选例中，所述的载体为转座子载体。
[0203]
在另一优选例中，所述免疫细胞为t细胞或nk细胞。
[0204]
在另一优选例中，所述的方法还包括对获得的工程化免疫细胞进行功能和有效性检测的步骤。
[0205]
本发明第十六方面提供了一种体外检测样品中b7-h3蛋白的方法，所述方法包括步骤：
[0206]
(1)在体外，将所述样品与如本发明第五方面所述的抗体接触；
[0207]
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在b7-h3蛋白。
[0208]
在另一优选例中，所述方法是非诊断和非治疗的。
[0209]
本发明第十七方面提供了一种检测板，所述的检测板包括：基片(支撑板)和测试条，所述的测试条含有如本发明第五方面所述的抗体或如本发明第九方面所述的抗体药物偶联物。
[0210]
本发明第十八方面提供了一种用于制备本发明第八方面所述的工程化的免疫细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
[0211]
(a)第一容器，以及位于第一容器内的第一核酸序列，所述第一核酸序列含有表达权利要求7所述的car构建物的第一表达盒；和
[0212]
任选的(b)第二容器，以及位于第二容器的第二核酸序列，所述第二核酸序列含有表达所述融合蛋白的第二表达盒。
[0213]
在另一优选例中，所述的第一、第二核酸序列为独立的或相连的。
[0214]
在另一优选例中，所述的第一、第二核酸序列位于相同或不同的容器内。
[0215]
在另一优选例中，所述的第一、第二核酸序列位于相同或不同的载体上。
[0216]
在另一优选例中，所述的第一、第二核酸序列位于同一载体。
[0217]
本发明第十九方面提供了一种诊断试剂盒，包括：
[0218]
(1)第一容器，所述第一容器中含有本发明第五方面所述的抗体；和/或
[0219]
(2)第二容器，所述第二容器中含有抗本发明第五方面所述的抗体的二抗。
[0220]
在另一优选例中，所述试剂盒含有本发明第十七方面所述的检测板。
[0221]
本发明第二十方面提供了一种治疗癌症或肿瘤的方法，所述方法包括：给需要的对象施用本发明第五方面所述的抗体、本发明第六方面所述的重组蛋白、本发明第七方面所述的car构建物、本发明第八方面所述的免疫细胞、本发明第九方面所述的抗体药物偶联物、本发明第十一方面所述的药物组合物。
[0222]
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
[0223]
图1显示了b7-h3膜蛋白在不同类型肿瘤细胞上的表达。应用b7-h3单克隆抗体作为一抗，apc标记的抗migg单抗作二抗，对肿瘤细胞进行染色，通过流式细胞仪检测b7-h3在各种肿瘤细胞膜上的表达；以小鼠igg2a为同型一抗对照。
[0224]
图2显示了抗人b7-h3单克隆抗体及其单链抗体蛋白对b7-h3均具有特异性结合能力。应用抗人b7-h3单克隆抗体(antibody)和抗人b7-h3单链抗体蛋白(sc-fv)分别对稳定表达b7-h3的cho细胞进行染色，以小鼠igg2a抗体(isotope)为同型对照，通过流式检测显示，抗人b7-h3单克隆抗体和抗人b7-h3单链抗体蛋白均能特异性结合b7-h3。
[0225]
图3显示了抗人b7-h3单链抗体蛋白和b7-h3单克隆抗体对b7-h3具有相近的特异性结合能力。用不同浓度的抗人b7-h3单克隆抗体和抗人b7-h3单链抗体蛋白分别分别对稳定表达b7-h3的cho细胞进行染色，通过流式检测显示，抗人b7-h3单克隆抗体和抗人b7-h3单链抗体蛋白特异性结合b7-h3的能力基本相近。
[0226]
图4显示了抗b7-h3嵌合抗原受体或共表达分子的抗b7-h3嵌合抗原受体的构造示意图。
[0227]
分别为：b7-h3 car-pdca7r(bb-z
‑‑
pdca7r)、b7-h3 4-1bb-car(bb-z)、共表达pd1-cd28分子的b7-h3 4-1bb-car(bb-z
–
pd28)、b7-h3 cd28-4-1bb-car(28bb-z)、缺失完整cd3ξ功能的b7-h3 car(del-z)。
[0228]
图5显示了不同构造的针对b7-h3的car-t细胞对b7-h3靶细胞抗原刺激的细胞增殖应答。b7-h3 car-pdca7r t细胞(bb-z
‑‑
pdca7r)具有最好的增殖能力；b7-h3 4-1bb-car t细胞(bb-z)，共表达pd1-cd28分子的b7-h3 4-1bb-car t细胞(bb-z
–
pd28)，和b7-h3 cd28-4-1bb-car t细胞(28bb-z)也具有较好的相近的增殖能力；作为对照，缺失完整cd3ξ功能的b7-h3 car t细胞(del-z)由于缺乏活化功能，没有有效的细胞增殖。
[0229]
图6显示了不同构造的针对b7-h3的car-t细胞对靶肿瘤细胞的细胞因子分泌应答。不同构造的car-t细胞对b7-h3阳性肿瘤细胞的特异性识别和活化后，产生不同水平的细胞因子(tnf，il-2，ifn-r，il-10，il-6，il-4)的分泌应答。mb231-h3ko为b7-h3敲除后阴性的乳腺癌细胞，作为细胞株阴性对照，pbs作为空白对照。
[0230]
图7显示了不同构造的针对b7-h3的car-t细胞对靶肿瘤细胞的体外特异性杀伤。不同构造的针对b7-h3的car-t细胞按不同的效靶比分别和靶肿瘤细胞共孵育后，检测其杀伤功能，除了缺失完整cd3ξ功能的b7-h3 car t细胞(del-z)由于缺乏活化功能，没有有效的杀伤作用外，其它各种car-t细胞均具有相近的杀伤功能。
[0231]
图8显示了不同构造的针对b7-h3的car-t细胞治疗能有效抑制动物模型中乳腺癌的生长。在小鼠乳腺癌模型中，用不同构造的针对b7-h3的car-t细胞进行静脉注射治疗，除了作为对照的缺失完整cd3ξ功能的b7-h3 car t细胞(del-z)不能抑制肿瘤生长外，其它各种car-t细胞均能有效抑制肿瘤生长。
[0232]
图9显示了不同构造的针对b7-h3的car-t细胞治疗延长肺转移癌模型小鼠的生存
时间。在肺转移癌模型小鼠中，应用不同构造的针对b7-h3的car-t细胞进行静脉注射治疗，结果，作为对照的缺失完整cd3ξ功能的b7-h3 car t细胞(del-z)治疗的小鼠生存期最短，而b7-h3 car-pdca7r t细胞(bb-z
‑‑
pdca7r)，共表达pd1-cd28分子的b7-h3 4-1bb-car t细胞(bb-z
–
pd28)和b7-h3cd28-4-1bb-car t细胞(28bb-z)治疗均能明显延长小鼠的生存期。
[0233]
图10显示了b7-h3 car-t细胞治疗腹腔种植结直肠癌的效果。将荧光素酶标记的lovo细胞，通过腹腔注射入ncg小鼠(5
×
104lovo细胞/只)，建立结直肠癌腹腔种植肿瘤模型。肿瘤种植4天后，用b7-h3 car-t细胞经腹腔注射进行治疗，1.0
×
107细胞/只，作为治疗组；用cd19 car-t细胞进行同种治疗，1.0
×
107细胞/只，作为对照组。分别在治疗前、治疗后第7天、治疗后第23天，进行小动物成像检测肿瘤细胞荧光素强度，以检测肿瘤生长。
[0234]
图11显示了不同亲和力的人源化单链抗体所构建的car-t细胞对靶细胞的杀伤作用。人源化后不同轻链和重链的组合所形成的单链抗体，具有不同的抗体亲和力。依据这些不同亲和力单链抗体分别构建car-t细胞，包括b7h3-car-t-ori(未人源化序列构建的car-t)，人源化后的不同组合序列构建的car-t：b7h3-car-t-h22-01，b7h3-car-t-h22-02，b7h3-car-t-h22-03，b7h3-car-t-h22-11，b7h3-car-t-h12-01，和b7h3-car-t-h21-01；这些car-t细胞分别通过和肿瘤靶细胞(b7h3阳性的lovo结直肠癌细胞，skov3卵巢癌细胞)共孵育(8小时)后，检测其杀伤效应(细胞裂解率)及其细胞因子分泌(il-2，ifn-γ)。结果显示，不同组合单链抗体来源的car-t细胞对靶细胞具有不同的杀伤效应，以及t细胞激活后不同程度的细胞因子il-2和ifn-γ的分泌。pbmc-only是未转染的t细胞，作为阴性对照；cd19-car-t及其靶向肿瘤细胞nalm6(cd19阳性，b7h3阴性)，作为靶向特异性的试验对照。
具体实施方式
[0235]
本发明人通过广泛而深入的研究，经过大量筛选，首次意外地开发了一类对b7-h3具有高特异性和高亲和力抗体以及基于所述抗体的高特异性的嵌合抗原受体免疫细胞。具体地，本发明意外地获得具有极其优异的亲和力和特异性的抗b7-h3单克隆抗体，并且基于该抗体获得了人源化抗体。本发明抗体能够高特异性地结合b7-h3抗原，其具有很高的亲和力(测定其ka(1/ms)、kd(1/s)和kd(m)均非常优异)。本发明的抗体及其相应的嵌合抗原受体免疫细胞可特异性地靶向b7-h3阳性或表达或高表达b7-h3的肿瘤细胞，并具有优异的肿瘤杀伤效果，而对正常细胞则无杀伤能力。在此基础上完成了本发明。
[0236]
术语
[0237]
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本技术中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。
[0238]
术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。
[0239]
如本文所用，“嵌合抗原受体(car)”是一种融合蛋白，其包含能够结合抗原的胞外结构域，与胞外结构域衍生自不同多肽的跨膜结构域，以及至少一个胞内结构域。“嵌合抗原受体(car)”也称为“嵌合受体”、“t-body”或“嵌合免疫受体(cir)”。所述的“能够结合抗原的胞外结构域”是指能够结合某一抗原的任何寡肽或多肽。“胞内结构域”是指已知的作
为传递信号以激活或抑制细胞内生物过程的结构域的任何寡肽或多肽。
[0240]
如本文所用，“结构域”是指多肽中独立于其它区域且折叠成特异结构的区域。
[0241]
如本文所用，“肿瘤抗原”是指具有抗原性的生物分子，其表达导致癌症。
[0242]
如本文所用，"单链可变区片段(scfv)"是指衍生自抗体的单链多肽，其保留结合抗原的能力。scfv的实例包括经重组dna技术形成的抗体多肽，并且其中免疫球蛋白重链(h链)和轻链(l链)片段的fv区经由间隔序列连接。改造scfv的各种方法是本领域技术人员已知的。
[0243]
如本文所用，术语“给予”和“处理”是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物应用于动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体。“给予”和“处理”可以指治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触、以及试剂与流体的接触、流体与细胞的接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理。“处理”当应用于人、动物或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断；包括抗人lag-3抗体与人或动物、受试者、细胞、组织、生理区室或生理流体的接触。
[0244]
如本文所用，术语“治疗”指给予患者内用或外用治疗剂，包含本发明的任何一种抗人b7-h3抗体及其组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，以有效缓解一种或多种疾病症状的治疗剂的量(治疗有效量)给予患者。
[0245]
如本文所用，术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”是指特定序列的抗体重链可变区可以有但不是必须有，可以是1个、2个或3个。
[0246]
本发明所述的“序列同一性”表示当具有适当的替换、插入或缺失等突变的情况下最佳比对和比较时，两个核酸或两个氨基酸序列之间的同一性程度。本发明中所述的序列和其具有同一性的序列之间的序列同一性可以至少为85％、90％或95％，优选至少为95％。非限制性实施例包括85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％。
[0247]
b7-h3
[0248]
人b7-h3分子是b7家族的成员，是含有506个氨基酸、分子量为110kda的i型跨膜蛋白。人b7-h3基因首先从人类树突状细胞来源的cdna文库克隆而来，因其结构与b7家族基因类似，故命名为b7 homolog3，简称b7-h3。b7-h3蛋白是由信号肽引导表达的胞外为igc和igv样结构域和胞内为高度可变的信号域的i型跨膜蛋白，在氨基酸序列上与b7家族的其他成员有20％～27％的同源性。
[0249]
b7-h3发现之初主要集中在免疫学上的研究，但在不同研究中，b-h3对t细胞既有正性共刺激活化，又有免疫抑制功能的不同报道，因此其功能尚不确切。有研究报道，b7-h3分子可以共刺激cd4
+
t细胞和cd8
+
t细胞的增殖、增强诱导t细胞免疫杀伤反应，选择性刺激分泌ifn-γ、il-8，tnf-α及il-10等。后续更多研究证明b7-h3能负性调控t细胞活化，抑制cd4
+
t细胞活化以及相应细胞因子如ifn-γ、il-4的分泌。同时，b7-h3还可能参与treg抑制dc活化和递呈抗原的功能。
[0250]
b7-h3蛋白在正常组织、细胞中不表达或极低表达，但却高表达于多种肿瘤组织，
并与肿瘤的进展、患者预后不良和临床转归差相关。在不同的各项研究中，发现b7-h3在非小细胞肺癌，前列腺癌，黑色素瘤，乳腺癌以及胰腺癌等多种病人肿瘤组织中表达，而且，b7-h3高表达与相关肿瘤的淋巴结转移或骨转移、肿瘤治疗抵抗，术后进展复发以及病人死亡率正相关。因此，b7-h3分子可以作为一种新的实体瘤靶向分子。
[0251]
pd-1胞外段
[0252]
pd-1胞外段为pd-1分子的胞外片段：
[0253]
pgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptah(seq id no:32)
[0254]
抗体
[0255]
如本文所用，术语“抗体”指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即igm、igd、igg、iga和ige，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、和ε链。同一类ig根据其较链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如igg可分为igg1，igg2、igg3，igg4。轻链根据恒定区的不同分为κ链或λ链。五类ig中每类ig都可以有κ链或λ链。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。
[0256]
本发明所述的抗体轻链可进一步包含轻链恒定区，所述的轻链恒定区包含人源或鼠源的κ、λ链或其变体。
[0257]
在本发明中，本发明所述的抗体重链可进一步包含重链恒定区，所述的重链恒定区包含人源或鼠源的igg1、igg2、igg3、igg4或其变体。抗体重链和轻链靠近n端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(fv区)；靠近c端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区。可变区包括3个高变区(hvr)和4个序列相对保守的骨架区(fr)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(cdr)。每条轻链可变区(lcvr)和重链可变区(hcvr)由3个cdr区和4个fr区组成，从氨基端到竣基端依次排列的顺序序为:fr1，cdr1，fr2，cdr2，fr3，cdr3和fr4。轻链的3个cdr区指lcdr1、lcdr2和lcdr3；重链的3个cdr区指hcdr1，hcdr2和hcdr3。
[0258]
本发明的抗体包括鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，优选人源化抗体。术语“鼠源抗体”在本发明中为根据本领域知识和技能制备的抗人b7-h3的单克隆抗体。制备时用b7-h3抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。在本发明一个优选的实施方案中，所述的鼠源b7-h3抗体或其抗原结合片段，可进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，或进一步包含鼠源igg1、igg2、igg3或其变体的重链恒定区。
[0259]
术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。
[0260]
术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为cdr移植抗体(cdr-grafted antibody)，是指将鼠的cdr序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体构架序列中产生的抗体。人源化抗体可以克服嵌合抗体由于携带大量鼠蛋白成分，从而诱导的异源性反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共dna数据库或公开的参考文献获得。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少反向突变或回复突变，以保持活性。
[0261]
术语“抗体的抗原结合片段”(或简称“抗体片段”)是指抗体的保持特异性结合抗原(例如，b7-h3)的能力的一个或多个片段。己显示可利用全长抗体的片段来进行抗体的抗原结合功能。术语“抗体的抗原结合片段”中包含的结合片段的实例包括
[0262]
(i)fab片段，由v
l
、vh、cl和ch1结构域组成的单价片段；
[0263]
(ii)f(ab')2片段，包含通过较链区上的二硫桥连接的两个fab片段的二价片段；
[0264]
(iii)由vh和ch1结构域组成的fd片段；
[0265]
(iv)由抗体的单臂的vh和v
l
结构域组成的fv片段。
[0266]
fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，fv抗体还包含vh和v
l
结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。
[0267]
术语“cdr”是指抗体的可变结构域内主要促成抗原结合的6个高变区之一。所述6个cdr的最常用的定义之一由kabat e.a等人，(1991)sequences of proteins of immunological interest.nih publication91-3242)提供。
[0268]
术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位(例如，b7-h3分子上的特定部位)。表位通常以独特的空间构象包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个连续或非连续的氨基酸。
[0269]
术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，抗体以大约小于10-7
m，例如大约小于1o-8
m、1o-9
m或lo-10
m或更小的亲和力(kd)结合。
[0270]
术语“竞争结合”是指与本发明的单克隆抗体识别人b7-h3的胞外区上的相同表位(也称为抗原决定簇)或相同表位的一部分并与所述抗原结合的抗体。与本发明的单克隆抗体结合相同表位的抗体是指识别并结合于本发明的单克隆抗体所识别的人b7-h3的氨基酸序列的抗体。
[0271]
术语“kd”或“kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。通常，本发明的抗体以小于大约10-7
m，例如小于大约1o-8
m、1o-9
m或lo-10
m或更小的解离平衡常数(kd)结合b7-h3，由使用表面等离子体共振(spr)技术在biacore仪中测定的。
[0272]
如本文所用，术语“抗原决定簇”指抗原上不连续的，由本发明抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。
[0273]
本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
[0274]
在本发明中，抗体包括用本领域技术人员熟知技术所制备的鼠的、嵌合的、人源化的或者全人的抗体。重组抗体，例如嵌合的和人源化的单克隆抗体，包括人的和非人的部分，可以采用本领域熟知的dna重组技术制备。
[0275]
如本文所用，术语“单克隆抗体”指得自单个细胞来源的克隆分泌的抗体。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原表位。所述的细胞可能是真核的、原核的或噬菌体的克隆细胞株。
[0276]
在本发明中，抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性、或者更多的多重特异性。
[0277]
在本发明中，本发明的抗体还包括其保守性变异体，指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或
相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表a进行氨基酸替换而产生。
[0278]
表a
[0279]
最初的残基代表性的取代优选的取代ala(a)val；leu；ilevalarg(r)lys；gln；asnlysasn(n)gln；his；lys；argglnasp(d)gluglucys(c)sersergln(q)asnasnglu(e)aspaspgly(g)pro；alaalahis(h)asn；gln；lys；argargile(i)leu；val；met；ala；pheleuleu(l)ile；val；met；ala；pheilelys(k)arg；gln；asnargmet(m)leu；phe；ileleuphe(f)leu；val；ile；ala；tyrleupro(p)alaalaser(s)thrthrthr(t)sersertrp(w)tyr；phetyrtyr(y)trp；phe；thr；serpheval(v)ile；leu；met；phe；alaleu
[0280]
人b7-h3特异性抗体
[0281]
本发明提供抗人b7-h3抗体(以下简称b7-h3抗体)。具体地，本发明提供一种针对b7-h3的高特异性和高亲和力的抗体，其包括重链和轻链，所述重链含有重链可变区(vh)氨基酸序列，所述轻链含有轻链可变区(v
l
)氨基酸序列。本发明b7-h3抗体通过剌激抗原特异性t细胞应答，增强t细胞的抗肿瘤作用，从而最大限度的提高患者自身对肿瘤的免疫系统反应，达到对肿瘤细胞进行杀伤的目的。
[0282]
优选地，重链可变区(vh)氨基酸序列和轻链可变区(v
l
)氨基酸序列的各自cdr选自下组：
[0283]
a1)seq id no:1；
[0284]
a2)seq id no:2；
[0285]
a3)seq id no:3；
[0286]
a4)seq id no:4；
[0287]
a5)seq id no:5；
[0288]
a6)seq id no:6；
[0289]
a7)seq id no:7；
[0290]
a8)seq id no:8；
[0291]
a9)seq id no:9；
[0292]
a10)seq id no:10；
[0293]
a11)seq id no:11；
[0294]
a12)seq id no:12；
[0295]
a13)seq id no:13；
[0296]
a14)seq id no:14；
[0297]
a15)seq id no:15；
[0298]
a16)seq id no:16；
[0299]
a17)seq id no:17；
[0300]
a18)seq id no:18
[0301]
上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-5、1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)氨基酸的具有b7-h3结合亲和力的序列。
[0302]
在另一优选例中，所述经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸序列所形成的序列优选为同源性为至少80％，较佳地至少85％，更佳地至少为90％，最佳地至少95％的氨基酸序列。
[0303]
本发明的抗体可以是双链或单链抗体，并且可以是选自动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，更优选为人源化抗体、人-动物嵌合抗体，更优选为全人源化抗体。
[0304]
本发明所述抗体衍生物可以是单链抗体、和/或抗体片段，如：fab、fab'、(fab')2、或该领域内其他已知的抗体衍生物等，以及iga、igd、ige、igg以及igm抗体或其他亚型的抗体中的任意一种或几种。
[0305]
其中，所述动物优选为哺乳动物，如鼠。
[0306]
本发明抗体可以是靶向人b7-h3的鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、cdr嫁接和/或修饰的抗体。
[0307]
在本发明的一种优选实施例中，上述seq id no:1、2、3、4、5、6、7、8和9中任意一种或几种序列、或它们经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的具有b7-h3结合亲和力的序列，位于重链可变区(vh)的cdr区。
[0308]
在本发明的一种优选实施例中，上述seq id no:10、11、12、13、14、15、16、17和18中任意一种或几种序列、或它们经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的具有b7-h3结合亲和力的序列，位于轻链可变区(v
l
)的cdr区。
[0309]
在本发明的一种更优选实施例中，v
h cdr1、cdr2、cdr3分别独立地选自seq id no:1、2、3、4、5、6、7、8和9中任意一种或几种序列、或它们经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的具有b7-h3结合亲和力的序列；v
l cdr1、cdr2、cdr3分别独立地选自seq id no:10、11、12、13、14、15、16、17和18中任意一种或几种序列、或它们经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的具有b7-h3结合亲和力的序列。
[0310]
本发明上述内容中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，优选为不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40％，更优选为不超过35％，更优选为1-33％，更优选为5-30％，更优选为10-25％，更优选为15-20％。
[0311]
在本发明中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量通常是1、2、3、4或5个，
较佳地为1-3个，更佳地为1-2个，最佳地为1个。
[0312]
抗体的制备
[0313]
任何适于产生单克隆抗体的方法都可用于产生本发明的b7-h3抗体。例如，可以用连接或天然存在的b7-h3蛋白或其片段免疫动物。可以使用合适的免疫接种方法，包括佐剂、免疫刺激剂、重复加强免疫接种，可以使用一种或多种途径。
[0314]
任何合适形式的b7-h3都可以作为免疫原(抗原)，用于产生对b7-h3特异的非人抗体，筛选所述抗体的生物学活性。免疫原可以单独使用，或与本领域已知的一种或多种免疫原性增强剂组合使用。免疫原可以由天然来源纯化，或者在遗传修饰的细胞中产生。编码免疫原的dna在来源上可以是基因组或非基因组的(例如cdna)。可以使用合适的遗传载体表达编码免疫原的dna，所述载体包括但不限于腺病毒载体、杆状病毒载体、质粒和非病毒载体。
[0315]
生产本发明的b7-h3抗体的示例性方法描述于实施例1。
[0316]
人源化抗体可以选自任何种类的免疫球蛋白，包括igm、igd、igg、iga和ige。在本发明中，抗体是igg抗体，使用igg1或igg4亚型。
[0317]
同样，任一类轻链都可以在本文的化合物和方法中使用。具体地说，κ、λ链或其变体在本发明的化合物和方法中是可以用的。
[0318]
人源化本发明b7-h3抗体的示例性方法描述于实施例1。
[0319]
本发明抗体或其片段的dna分子的序列可以用常规技术，比如利用pcr扩增或基因组文库筛选等方法获得。此外，还可将不同轻链和重链的编码序列，以不同的组合形式融合在一起，形成单链抗体。并通过对不同组合或不同链接修饰的单链抗体的功能进行检测分析，获得优化的单链抗体。
[0320]
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
[0321]
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。然后可将该dna序列引入本领域中已知的各种现有的dna分子(或如载体)和细胞中。
[0322]
术语“核酸分子”是指dna分子和rna分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链dna。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，核酸是“有效连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么启动子或增强子有效地连接至所述编码序列。
[0323]
术语“载体”是指能够运输己与其连接的另一个核酸的核酸分子。在一个实施方案中，载体是“质粒”，其是指可将另外的dna区段连接至其中的环状双链dna环。
[0324]
本发明还涉及包含上述的适当dna序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
[0325]
术语“宿主细胞”是指已向其中引入了表达载体的细胞。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物或动物细胞(如哺乳动物细胞)。
[0326]
本发明中所述的用重组dna转化宿主细胞的步骤可用本领域熟知的技术进行。获得的转化子可用常规方法培养，转化子表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主
细胞，用常规培养基在合适的条件下培养。
[0327]
通常，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白a-sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的抗体。
[0328]
所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。比如，单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(ria)或酶联免疫吸附测定(elisa))来测定。
[0329]
嵌合抗原受体(car)
[0330]
嵌合免疫抗原受体(chimeric antigen receptors，cars)由胞外抗原识别区域，通常是scfv(single-chain variable fragment)，跨膜区以及胞内共刺激信号区域组成。cars的设计经历了以下过程：第一代car只有一个胞内信号组份cd3ζ或者fcγri分子，由于胞内只有一个活化结构域，因此它只能引起短暂的t细胞增殖和较少的细胞因子分泌，而并不能提供长时间的t细胞增殖信号和持续的体内抗肿瘤效应，所以并没有取得很好地临床疗效。第二代cars在原有结构基础上引入一个共刺激分子，如cd28、4-1bb、ox40、icos，与一代cars相比功能有很大提高，进一步加强car-t细胞的持续性和对肿瘤细胞的杀伤能力。在二代cars基础上串联一些新的免疫共刺激分子如cd27、cd134，发展成为三代和四代cars。
[0331]
cars的胞外段可识别一个特异的抗原，随后通过胞内结构域转导该信号，引起细胞的活化增殖、细胞溶解毒性和分泌细胞因子，进而清除靶细胞。首先分离病人自体细胞(或者异源供体)，激活并进行基因改造产生car的免疫细胞，随后注入同一病人体内。这种方式患移植物抗宿主病概率极低，抗原被免疫细胞以非mhc限制方式识别。
[0332]
car-免疫细胞治疗在血液恶性肿瘤治疗中取得了非常高的临床反应率，这样的高反应率是以往任何一种治疗手段都无法达到的，在世界各引发了临床研究的热潮。
[0333]
具体地，本发明的嵌合抗原受体(car)包括细胞外结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域。胞外结构域包括靶-特异性结合元件(也称为抗原结合结构域)。细胞内结构域包括共刺激信号传导区和/或ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。
[0334]
在car的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在car的胞浆结构域和跨膜结构域之间，可并入接头。如本文所用的，术语“接头”通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。接头可包括0-300个氨基酸，优选地2至100个氨基酸和最优选地3至50个氨基酸。
[0335]
本发明的car当在t细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性进行抗原识别。当其结合其关联抗原时，影响肿瘤细胞，导致肿瘤细胞不生长、被促使死亡或以其他方式被影响，并导致患者的肿瘤负荷缩小或消除。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和/或ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。优选地，抗原结合结构域与4-1bb信号传导结构域和/或cd3ζ信号结构域组合的细胞内结构域融合。
[0336]
如本文所用，“抗原结合结构域”“单链抗体片段”均指具有抗原结合活性的fab片段，fab'片段，f(ab')2片段，或单一fv片段。fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，fv抗体还包含vh和v
l
结构域
之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。抗原结合结构域通常是scfv(single-chain variable fragment)。scfv的大小一般是一个完整抗体的1/6。单链抗体优选是由一条核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。作为本发明的优选方式，所述scfv包含特异性识别肿瘤高表达抗原b7-h3的抗体，较佳地为单链抗体。
[0337]
在本发明中，本发明的scfv还包括其保守性变异体，指与本发明scfv的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。
[0338]
在本发明中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，优选为不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40％，更优选为不超过35％，更优选为1-33％，更优选为5-30％，更优选为10-25％，更优选为15-20％。
[0339]
在本发明中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量通常是1、2、3、4或5个，较佳地为1-3个，更佳地为1-2个，最佳地为1个。
[0340]
对于绞链区和跨膜区(跨膜结构域)，car可被设计以包括融合至car的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与car中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。
[0341]
在本发明中，本发明的car如本发明第七方面所述。
[0342]
嵌合抗原受体t细胞(car-t细胞)
[0343]
如本文所用，术语“car-t细胞”、“car-t”、“本发明car-t细胞”均指本发明第七方面所述的car-t细胞，本发明car-t细胞可靶向肿瘤抗原(如b7-h3)。
[0344]
本发明所述的car表达后，会穿过细胞膜并定位在细胞膜上。
[0345]
car-t细胞较其它基于t细胞的治疗方式存在以下优势：(1)car-t细胞的作用过程不受mhc的限制；(2)鉴于很多肿瘤细胞表达相同的肿瘤抗原，针对某一种肿瘤抗原的car基因构建一旦完成，便可以被广泛利用；(3)car既可以利用肿瘤蛋白质抗原，又可利用糖脂类非蛋白质抗原，扩大了肿瘤抗原的靶点范围；(4)使用患者自体细胞降低了排异反应的风险；(5)car-t细胞具有免疫记忆功能，可以长期在体内存活。
[0346]
嵌合抗原受体nk细胞(car-nk细胞)
[0347]
如本文所用，术语“car-nk细胞”、“car-nk”、“本发明car-nk细胞”均指本发明第一方面所述的car-nk细胞。本发明car-nk细胞可靶向肿瘤抗原(如b7-h3)。
[0348]
自然杀伤(nk)细胞是一类主要的免疫效应细胞，通过非抗原特异性途径去保护机体免受病毒感染和肿瘤细胞的侵袭。通过工程化(基因修饰)的nk细胞可能获得新的功能，包括特异性识别肿瘤抗原的能力及具有增强的抗肿瘤细胞毒作用。
[0349]
与自体car-t细胞相比，car-nk细胞还具有一下优点，例如：(1)通过释放穿孔素和颗粒酶直接杀伤肿瘤细胞，而对机体正常的细胞没有杀伤作用；(2)它们释放很少量的细胞因子从而降低了细胞因子风暴的危险；(3)体外极易扩增及发展为“现成的”产品。除此之外，与car-t细胞治疗类似。
[0350]
外源t细胞抗原受体
[0351]
如本文所用，外源t细胞抗原受体(t cell receptor,tcr)为通过基因转移技术从
肿瘤反应性t细胞中克隆出tcr的α链和β链，通过基因工程的手段，以慢病毒或逆转录病毒为载体，外源性转入到t细胞内的tcr。
[0352]
外源tcr修饰的t细胞能够特异性识别和杀伤肿瘤细胞，并通过优化tcr与肿瘤性特异性抗原的亲和力，可以提高t细胞与肿瘤的亲和力，提高抗肿瘤效果。
[0353]
载体
[0354]
编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。
[0355]
本发明也提供了其中插入本发明的表达盒的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的优点。
[0356]
简单概括，通常可操作地连接本发明的表达盒或核酸序列至启动子，并将其并入表达载体。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。
[0357]
本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗法载体。
[0358]
该核酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
[0359]
进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如sambrook等(2001,molecular cloning:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory,new york)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，wo01/96584；wo01/29058；和美国专利号6,326,193)。
[0360]
已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。
[0361]
额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以起动转录。
[0362]
合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(cmv)启动子序列。该启动子序
列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(ef-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(sv40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(mmtv)、人免疫缺陷病毒(hiv)长末端重复(ltr)启动子、momulv启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(epstein-barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
[0363]
为了评估car多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段dna上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。
[0364]
报告基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常地，报告基因为以下基因：其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织进行表达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。在dna已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报告基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白的基因(例如，ui-tei等，2000febs letters479:79-82)。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5个侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子-驱动转录的能力。
[0365]
将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。
[0366]
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如sambrook等(2001,molecular cloning:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory,new york)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。
[0367]
将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用dna和rna载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒i、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。
[0368]
将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(delivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。
[0369]
在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，
以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/dna或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。
[0370]
在本发明的一个优选地实施方式中，所述载体为慢病毒载体。
[0371]
制剂
[0372]
本发明提供了一种含有本发明第一方面所述的重链可变区、本发明第二方面所述的重链、本发明第三方面所述的轻链可变区、本发明第四方面所述的轻链、第五方面所述的抗体、本发明第六方面所述的重组蛋白、本发明第七方面所述的car构建物、本发明第八方面所述的免疫细胞、或本发明第九方面所述的抗体药物偶联物，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一个实施方式中，所述制剂为液态制剂。优选地，所述制剂为注射剂。优选地，所述制剂中所述car-t细胞的浓度为1
×
10
3-1
×
109个细胞/ml，较佳地1
×
10
5-1
×
108个细胞/ml。
[0373]
在一个实施方式中，所述制剂可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如edta或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的制剂优选配制用于静脉内施用。
[0374]
治疗性应用
[0375]
本发明包括用编码本发明表达盒的慢病毒载体(lv)转导的细胞(例如，t细胞)进行的治疗性应用。转导的t细胞可靶向肿瘤细胞的标志物b7-h3蛋白，协同激活t细胞，引起细胞免疫应答，从而显著提高其对来自恶性肿瘤的肿瘤细胞的杀伤效率。
[0376]
因此，本发明也提供了刺激对哺乳动物的靶细胞群或组织的t细胞-介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤：给哺乳动物施用本发明的car-t细胞。
[0377]
在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，分离病人自体t细胞(或者异源供体)，激活并进行基因改造产生car-t细胞，随后注入同一病人体内。这种方式患移植物抗宿主病概率极低，抗原被t细胞以无mhc限制方式识别。此外，一种car-t就可以治疗表达该抗原的所有癌症。不像抗体疗法，car-t细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。
[0378]
在一个实施方式中，本发明的car-t细胞可经历稳固的体内t细胞扩展并可持续延长的时间量。另外，car介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中car-修饰t细胞诱导对car中的抗原结合结构域特异性的免疫应答。例如，b7-h3的car-t细胞引起抗表达b7-h3的细胞的特异性免疫应答。
[0379]
尽管本文公开的数据具体公开了包括抗b7-h3的scfv、铰链和跨膜区、和cd28和/
或4-1bb(cd137)、和cd3ζ信号传导结构域、以及任选的自剪切蛋白的编码序列和任选的包pd1-cd28或pd1-il7r融合蛋白的编码序列的慢病毒载体，但本发明应被解释为包括对构建体组成部分中的每一个的任何数量的变化。
[0380]
可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体瘤(诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体瘤。用本发明的car治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。
[0381]
血液学癌症为血液或骨髓的癌症。血液学(或血原性)癌症的例子包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、粒-单核细胞型、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。
[0382]
实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、骨肉瘤，前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(nsclc)、神经系统肿瘤、脑胶质瘤、神经母细胞瘤，转移行恶性肿瘤、实体瘤腹腔转移、实体瘤盆腔转移。
[0383]
本发明的car-t细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。
[0384]
对于离体免疫，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生：i)扩增细胞，ii)将编码car的核酸引入细胞，和/或i ii)冷冻保存细胞。
[0385]
离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细胞从哺乳动物(优选人)中分离并用表达本文公开的car的载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。car-修饰的细胞可被施用给哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可为人，和car-修饰的细胞可相对于接受者为自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。
[0386]
除了就离体免疫而言使用基于细胞的疫苗之外，本发明也提供了体内免疫以引起针对患者中抗原的免疫应答的组合物和方法。
[0387]
本发明提供了治疗肿瘤的方法，其包括施用给需要其的对象治疗有效量的本发明的car-修饰的t细胞。
[0388]
本发明的car-修饰的t细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如edta或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内
施用。
[0389]
本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度——尽管适当的剂量可由临床试验确定。
[0390]
当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的t细胞的药物组合物可以以103至108个细胞/kg体重的剂量，优选105至106个细胞/kg体重的剂量(包括那些范围内的所有整数值)施用。t细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如rosenberg等，neweng.j.of med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。
[0391]
对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的t细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的t细胞组合物优选通过i.v.注射施用。t细胞的组合物可被直接注入肿瘤，淋巴结或感染位置。
[0392]
在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将t细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗：所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知为ara-c)或对ms患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对pml患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的t细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和fk506，抗体或其他免疫治疗剂。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(xrt)、环磷酰胺结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。
[0393]
施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1
×
103个至1
×
109个本发明经修饰的t细胞，通过例如静脉回输的方式，施用于患者。
[0394]
检测用途和试剂盒
[0395]
本发明的抗体可用于检测应用，例如用于检测样本，从而提供诊断信息。
[0396]
本发明中，所采用的样本(样品)包括细胞、组织样本和活检标本。本发明使用的术语“活检”应包括本领域技术人员已知的所有种类的活检。因此本发明中使用的活检可以包括例如通过内窥镜方法或器官的穿刺或针刺活检制备的组织样本。
[0397]
本发明中使用的样本包括固定的或保存的细胞或组织样本。
[0398]
本发明还提供了一种指含有本发明的抗体(或其片段)、scfv、的试剂盒，在本发明
的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。在优选例中，本发明的抗体可以固定于检测板。
[0399]
本发明的主要优点包括：
[0400]
(1)本发明的抗体具有高亲和力，高特异性的特点。
[0401]
(2)本发明的人源化抗体或scfv仍具有针对b7-h3高亲和力和高特异性。
[0402]
(3)本发明的工程化免疫细胞可靶向肿瘤抗原(如b7-h3)，从而选择性地杀伤肿瘤细胞。
[0403]
(4)本发明的工程化免疫细胞可靶向肿瘤内增生的血管内皮细胞，通过破坏肿瘤的血管形成和血液供给，抑制或损伤肿瘤细胞，从而可以同时靶向肿瘤细胞和肿瘤血管，双重、更有效地杀伤肿瘤细胞。
[0404]
(5)本发明的一类工程化免疫细胞可共表达靶向b7-h3的car和靶向pd-l1的car或分泌蛋白，从而增强对肿瘤细胞的杀伤效果。
[0405]
(6)本发明中靶向b7-h3的car、以及靶向pd-l1的融合蛋白具有协同效果，可提高car-t细胞的活化、增殖、细胞因子分泌及迁移，提高car-t细胞在体内的杀伤功能，促进car-t细胞向肿瘤组织的迁移归巢，提高car-t细胞在体内的存留时间，加强形成记忆细胞的能力，因此，相对于单一的car，能够增强car-t细胞的治疗效果，尤其是提高car-t细胞治疗实体瘤的效果。
[0406]
(7)本发明首次利用b7-h3单克隆抗体来源的单链抗体可变区(scfv)进行b7-h3特异性car-t细胞(b7-h3-car-t)的构建，在体外和动物模型体内验证了b7-h3-car-t细胞的功能，及其对多种肿瘤的治疗疗效。
[0407]
(8)本发明的b7-h3的单克隆抗体可以进一步应用于双特异性抗体，adc抗体、生物试剂、临床诊断试剂、影像试剂等。
[0408]
(9)b7-h3 car细胞及其新型car结构和技术，不仅可以用于t细胞形成car-t，也可以用于其他的免疫细胞进行基因修饰和改进，比如nk细胞。
[0409]
(10)本发明的新型car-t结构和技术可以用于和其他靶向分子的结合进行研发和应用。
[0410]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
[0411]
除非特别说明，否则本发明实施例中所用材料和试剂均为市售产品。
[0412]
实施例1抗体的制备
[0413]
用常规方法，将b7-h3蛋白免疫小鼠后，收获血清，验证血清对b7-h3的亲和力。而后，取小鼠脾脏细胞制备并筛选单抗杂交瘤细胞。取单抗杂交瘤细胞进行总rna的提取并纯化。通过rna的反转录以及5'-race-cdna的扩增获得单克隆抗体的cdna。以获得的cdna为模版，通过pcr方法扩增获得单克隆抗体的轻链和重链可变区的cdna序列，进而通过ta载体克隆技术将轻链和重链可变区的cdna序列连接在质粒载体上。
[0414]
实施例2抗体序列的测定
[0415]
通过将重链、轻链质粒在感受态细菌上进行转化，在克隆菌板上进行单克隆菌落的筛选。
[0416]
从单克隆菌落中提取纯化质粒，通过常规dna测序获得轻链和重链可变区的cdna序列。
[0417]
将抗体可变区测序结果与kabat数据库比对，进行cdr区判读，选择正确抗体序列。
[0418]
通过短多肽linker连接重链、轻链可变区序列获得单链抗体片段(scfv)，并与phigv、pmigv质粒载体连接。
[0419]
质粒载体转染293t重新获得单链抗体的蛋白，而后进行单链抗体蛋白的功能验证。
[0420]
实施例3b7-h3在各种类型肿瘤细胞中表达
[0421]
通过常规方法对多种肿瘤的石蜡切片进行免疫组化进行染色：通过柠檬酸/微波蒸汽水浴100℃的抗原修复方法进行抗原修复；用b7-h3 mab一抗，abc complex试剂盒以及streptavidin-hrp，进行染色。通过显微镜观察发现b7-h3在多种实体性肿瘤中高表达，包括结直肠癌，卵巢癌，乳腺癌，胃癌，肝癌，胰腺癌，前列腺癌，恶性胶质瘤，神经母细胞瘤，头颈部肿瘤，恶性黑色素瘤等等。同时，b7-h3还特异性地在实体瘤内增殖的血管内皮细胞内表达。
[0422]
应用b7-h3 mab，通过常规流式细胞仪方法，测定b7-h3在各种肿瘤细胞株上的表达。结果显示，b7-h3在多种实体瘤细胞株上高表达。
[0423]
实施例4b7-h3的单链抗体scfv结合能力的鉴定
[0424]
将标记的b7-h3单链抗体或其scfv蛋白与表达人b-h3的ch0细胞结合后，通过流式细胞仪检测进行亲和力的检测。在同条件情况下，加入不同浓度的b7-h3蛋白，进行亲和力的中和试验，验证其结合的特异性。比较不同浓度的单克隆抗体与其单链抗体蛋白scfv的结合人b7-h3的能力，比较两者的结合能力。
[0425]
结果显示，b7-h3单克隆抗体和它的单链抗体scfv有等同的对b7-h3的结合能力，可以有效特异性靶向b7-h3分子。
[0426]
实施例5b7-h3 car及其和不同的分子共表达形成新型car-t细胞
[0427]
通过重叠延伸pcr技术，将抗人b7-h3的单链抗体片段(scfv),cd8铰链区和跨膜区，cd28和/或4-1bb的胞内信号传递结构域，cd3ζ的活化功能结构域，连接构建car的cdna结构。通过重叠延伸pcr技术，将pd-1胞外片段和cd28胞内段，pd-1胞外片段和il-7的胞内功能突变受体片段，分别连接构建pd1-cd28(pd28)和pdca7r的融合cdna。通过重叠延伸pcr技术，应用fu-v5-sgsg-t2a序列做为剪切连接序列，将car cdna分别和pd28、pdca7r、cd28，和/或egfp片段，连接构建不同分子共表达的car分子的基因结构。
[0428]
典型的car结构如图4所示，其中含有共表达分子的car结构的氨基酸序列如seq id no.:37所示，编码含有共表达分子的car结构的核苷酸序列如seq id no.:38所示。
[0429]
通过分子克隆技术，将上述car或共表达分子的car结构连接在慢病毒表达载体上。通过常规pei或磷酸钙沉淀方法，在lenti-x 293t细胞或293t细胞细胞上，进行二代或三代慢病毒的包装制备。生产的慢病毒原液以0.45μm过滤器过滤后，通过离心进行浓缩，滴度鉴定后于液氮速冻后放于负80℃保存。
[0430]
将病毒和经过稀释纤连蛋白包备的培养板共孵育，使得病毒颗粒粘附于培养板
上，而后将活化pbmcs或t细胞连同含il-2的t细胞培养液接种于培养板中，800g离心1小时后置入培养箱，进行pbmcs或t细胞的病毒转染。培养48小时后检测car以及共表达分子的表达及其表型。其后，car-t细胞在含il-2，il-7，il-15等细胞因子的培养液中继续培养直至收获。
[0431]
实施例6car-t细胞应答靶细胞抗原刺激
[0432]
新鲜感染的car-t细胞，更换新鲜培养基，用辐照的靶细胞按照1:1的效靶比刺激3天后，用台盼蓝染色计数。之后再重复刺激3轮反应，每轮反应5-7天，过程中不添加外源细胞因子，仅半量换液。每轮反应后计数car-t细胞的总量。
[0433]
各种结构的b7-h3 car-t细胞受到b7-h3抗原刺激后均能有效增殖；同时，共表达pdca7r的b7-h3 car-t细胞(b7-h3 car-carpdca7r t细胞)在抗原特异刺激后维持细胞稳定性和增殖能力上更有优势。
[0434]
实施例7car-t细胞与肿瘤细胞共培养后细胞因子分泌水平
[0435]
各种结构的b7-h3 car-t细胞与经过100gy辐照或未经辐射的靶肿瘤细胞共孵育后，应用cba试剂盒，通过流式细胞技术检测和分析各种细胞因子的分泌。
[0436]
b7-h3 car-t细胞经过靶细胞刺激后可以大量释放干扰素(ifn-γ),白介素2(il-2)、肿瘤坏死因子(tnf-a)等th1型细胞因子,而仅分泌少量的白介素4、6、10(il-4、il-6、il-10)等th2型细胞因子。b7-h3 car-pdca7r细胞组在与b7-h3阳性的肿瘤细胞系共孵育诱导各种细胞因子的表达量明显高于其余组b7-h3car-t细胞。提示b7-h3 car-t细胞对b7-h3抗原的特异性，以及b7-h3car-pdca7r具有更高的活化功能。
[0437]
实施例8car-t细胞对肿瘤细胞的杀伤
[0438]
各种结构的car-t细胞按不同比例与靶肿瘤细胞共孵育后，应用dapi或annexin v等试剂/试剂盒染色后，通过流式细胞仪检测car-t细胞对靶肿瘤细胞的杀伤功能。
[0439]
多种结构的b7-h3 car-t细胞均能够有效杀伤表达b7-h3的肿瘤细胞，其杀伤功能具有抗原特异性。
[0440]
实施例9car-t细胞动物模型体内抗肿瘤的作用
[0441]
在小鼠肿瘤皮下，乳腺脂肪垫，通过腹腔或通过尾静脉注射相应的表达b7-h3的肿瘤细胞，分别建立多种皮下肿瘤模型，乳腺癌模型，腹腔转移模型，肺转移模型等。用于car-t细胞或共表达分子的car-t细胞分别进行静脉或腹腔注射进行治疗(单独或联合治疗)试验；分别通过检测肿瘤生长，小鼠的生存时间，小鼠血清中细胞因子分泌，car-t效应细胞在肿瘤中的浸润和在体内的增殖等分析car-t细胞治疗的效果。
[0442]
b7-h3 car-t细胞经腹腔注射的治疗能有效抑制腹腔转移恶性肿瘤的的生长，并最终消除肿瘤负荷。
[0443]
b7-h3 car-t细胞能有效抑制移植体内的皮下肿瘤的生长，ifn-γ明显上调分泌。同时，共表达分子的car-t细胞，包括b7-h3 car-pd28和b7-h3-car-pdca7r t细胞具有更好的治疗效果。三代的b7-h3 car-t细胞联合pd-1抗体治疗能够有效抑制肿瘤的生长，并最终消除肿瘤负荷。
[0444]
b7-h3 car-t细胞能有效抑制体内乳腺原位移植瘤的生长，而且对肿瘤生长有持续的抑瘤作用。b7-h3-car-pdca7r t细胞较b7-h3 car-t细胞具有更好的促进肿瘤消退的效果。
[0445]
b7-h3 car-t细胞治疗有效抑制了肿瘤肺转移的发生并且能延长小鼠生存期,而对照组小鼠发生了较明显的肺转移而且生存期短暂。b7-h3 car-pdca7r t细胞较b7-h3 car-t细胞具有更明显的抑制肿瘤肺转移和延长生存期的效果。
[0446]
实施例10人源化抗体及其活性测定
[0447]
将获得的鼠源抗b7-h3抗体的可变区fr序列与人源fr序列进行比对和筛选，对fr区序列进行人源化突变后，分别获得3条轻链(l1，l2，l3)和3条重链(h1，h2，h3)的人源化抗b7-h3抗体序列，进而，通过biacore检测各个轻链和重链组合形成的9个单链抗体的亲和力常数。
[0448]
同时，将各个组合的单链抗体序列分别用于构建car-t细胞，并通过杀伤试验可以分别检测及比较各组合car-t细胞对靶向肿瘤细胞的杀伤功能。相对于亲和力弱(如，l1/h1组合)的单链抗体，亲和力高的单链抗体(如，l2/h2组合)构建的car-t细胞通常对靶细胞具有更高的杀伤效能。因此，选择合适亲和力(比如，h2/l2或h2/l1)单链抗体用于car-t细胞构建，可能既可保持car-t细胞有效杀伤靶肿瘤细胞的功能，又可降低其对正常组织的脱靶损伤等副反应。
[0449]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。