新型冠状病毒检测试剂、检测试剂盒和检测方法与流程

本发明涉及本发明属于分子生物学与体外分子诊断，特别涉及一种新型冠状病毒检测试剂、检测试剂盒和检测方法。

背景技术：

1、分子诊断主要是应用分子生物学方法检测生物体内遗传物质的结构或表达水平的变化而做出的诊断技术，可以从基因层次进行检测，因此在检测的灵敏度和准确性上的优势较为明显，能够在感染初期识别病毒或者提早确认基因缺陷，从而提供个性化的医疗诊断服务(如肿瘤缺陷基因检测)。目前，全球主要的分子诊断技术可以分为核酸检测和生物芯片两大类。核酸检测包括聚合酶链式反应(pcr)、荧光原位杂交技术(fish)和基因测序技术；生物芯片技术，又分为基因芯片和蛋白芯片技术，其中，和基因相关的检测是分子诊断的最重要组成部分，往往是医院对传染病诊断的“金标准”。

2、pcr是使用最为广泛的核酸扩增技术，因其灵敏性高和特异性强得到广泛应用，然而pcr需要反复的热变性，无法摆脱依赖仪器设备的局限，从而限制了其在临床现场检测中的应用。近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，基于核酸检测的诊断方法已大量建立并广泛应用于人类疾病的实验室检测中。与其他的核酸扩增技术相比，等温扩增有快速、高效、特异的优点且无需专用的设备，所以它一经出现就被许多学者认为是一种有可能与pcr媲美的检测方法。20世纪90年代初以来，已开发出：依赖核酸序列扩增技术(nucleic acidsequence-based amplification，nasba)，主要依赖amv逆转录酶、rnase h和t7 rna聚合酶和一对引物来完成等温扩增；借鉴微生物环状dna复制过程的滚环扩增技术(rollingcircle amplification，rca)；环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification，lamp)；模拟动物体内dna复制机制的依赖解旋酶扩增技术(helicase-dependent amplification，hda)；参照了t4噬菌体dna复制系统的重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，rpa)；重组酶介导等温核酸扩增技术(recombinase aided amplification，raa)；实时荧光核酸恒温扩增检测技术(simultaneous amplification and testing，sat)；交叉引物扩增技术(crossingpriming amplification，cpa)；链置换扩增技术(strand displacement amplification，sda)等。其中应用最广泛的是lamp和rpa，但是lamp仍然需要在60℃-65℃温度条件下进行反应，需要特殊的温控设备，在非最适温度条件下，其扩增效率会大大降低甚至无法扩增。rpa方法成分复杂、稳定性欠佳、操作难度较大。

3、成簇规律性间隔短回文重复序列(crispr)和相关核酸内切酶(cas)是古细菌和细菌中的适应性免疫系统，可在序列特异性rna分子(grna)的指导下降解外源核酸。一些cas酶(包括cas12a、cas12b、cas13a、cas13b和cas14)在与其特定靶点结合后表现出侧向切割活性，这已被充分评估并用于检测核酸的诊断方法。目标识别后，激活的cas核酸酶额外地切割单链dna(ssdna)。近年来，基于成簇规律性间隔短回文重复序列(crispr/cas)靶向识别和核酸酶切割活性的体外核酸检测技术已被广泛报道。比如：结合环介导方法的crispr/cas12等温放大或使用crispr/cas13的rpa来检测sars-cov-2病毒；通过结合rpa预扩增，cas13和cas12a核酸酶分别被用于开发sherlock(specifific high-sensitivityenzymatic reporter unlocking)系统和aiod-crispr系统，用于高灵敏度和特异性sars-cov-2病毒核酸的及时检测；除了rpa预扩增法，基于crispr-cas的核酸检测和lamp预扩增方法，如sars-cov-2detectr(dna endonuclease-targeted crispr trans reporter)系统，尽管sherlock和detectr可通过测流层析试纸条进行结果输出用于sars-cov-2poct检测，但由于均是使用单一crrna介导的crispr检测、其酶切效率较低，从扩增到结果输出大约需要一个小时才能完成；结合raa扩增和crispr-cas12a来检测新型冠状病毒，例如cn114350854a、cn113881806a、cn113549618a、cn113481327a等。然而，传统的结合核酸等温扩增和crispr/cas的检测技术在应用于经裂解液处理的样本中的新型冠状病毒的检测的过程中，灵敏度有待提升。

技术实现思路

1、基于此，本技术实施例的目的包括提供一种新型冠状病毒检测试剂，采用该检测试剂对经裂解液处理的样本中的新型冠状病毒的检测，灵敏度高。

2、在本技术的第一方面，提供一种新型冠状病毒检测试剂，所述检测试剂包括raa扩增引物对、raa扩增酶、cas12a核酸内切酶、crrna和探针，

3、所述检测试剂检测的靶基因包括orf1ab基因和n基因中的一种或者多种；

4、所述orf1ab基因对应的所述raa扩增引物对包括如seq id no.1和seq id no.2所示的引物；

5、所述n基因对应的所述raa扩增引物对包括如seq id no.3和seq id no.4所示的引物；

6、所述探针的序列如seq id no.9所示，一端连接荧光标记物，一端连接淬灭基团。

7、在本技术的一些实施例中，所述检测试剂还包括病毒裂解液，所述病毒裂解液包含5mm-50mm tris缓冲液、0.5％-2％(v/v)甘油、0.05-1.0％(v/v)tween-20、30mm-100mmnaoh、50mm-150mm kcl。

8、在本技术的一些实施例中，所述检测试剂还包括raa扩增缓冲液，所述raa扩增试剂包含3wt％-6wt％peg20000、40mm-100mm氯化钾、8mm-20mm醋酸镁、1.0mm-2.5mm二硫苏糖醇、2.0mm-4.0mm atp、0.2mm-0.55mm dntps、10mm-120mm磷酸肌酸以及30mm-60mm、ph7.5-8.5的tris-ac缓冲液。

9、在本技术的一些实施例中，所述raa扩增酶包括逆转录酶、核糖核酸酶、磷酸肌酸激酶、重组酶、重组酶辅助蛋白、单链结合蛋白和dna聚合酶；可选地，所述检测试剂还包括核糖核酸酶抑制剂。

10、在本技术的一些实施例中，所述检测试剂具有如下书特征中的一个或者多个：

11、(1)所述逆转录酶为amv和m-mlv中的一种或者多种；

12、(2)所述核糖核酸酶为核糖核酸酶a、核糖核酸酶h和核糖核酸酶t1中的一种或者多种；

13、(3)所述重组酶为t4 uvsx和rec a中的一种或者多种；

14、(4)所述重组酶辅助蛋白为t4 uvsy；

15、(5)所述单链结合蛋白为大肠杆菌单链dna结合蛋白或者t4噬菌体基因32蛋白；

16、(6)所述dna聚合酶为bst dna聚合酶i或者bsu dna聚合酶i；

17、(7)所述核糖核酸酶抑制剂为rnasin；

18、(8)所述cas12a核酸内切酶为lbcas12a核酸内切酶。

19、在本技术的第二方面，提供一种新型冠状病毒检测试剂盒，所述检测试剂盒包含第一方面中所述的检测试剂以及与其配套使用的显色部件。

20、在本技术的一些实施例中，所述显色部件为胶体金试纸条，所述胶体金试纸条包括背板以及依次搭接粘贴在所述背板上的样本垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述检测膜设有检测线和质控线，

21、所述金标垫喷涂有胶体金和抗所述荧光标记物的单克隆抗体的配合物，所述检测线上包被羊抗兔抗体，所述质控线包被sa链霉亲和素。

22、在本技术的第三方面，提供一种检测或者辅助检测新型冠状病毒的核酸的方法，所述方法包括如下步骤：

23、采用第二方面中所述的检测试剂盒对待测样本进行检测，并根据所述得检测结果判定所述待测样本中是否含有新型冠状病毒的核酸。

24、在本技术的一些实施例中，根据所述的检测结果判定所述待测样本中是否含有新型冠状病毒的核酸包括：

25、若仅所述胶体金试纸条的质控线显色，则所述测待测样本中不含有所述新型冠状病毒核酸；

26、若所述胶体金试纸条的检测线和质控线同时显色，则所述测待测样本中含有所述新型冠状病毒核酸；

27、若所述胶体金试纸条的质控线不显色但检测线显色，则所述测待测样本中含有所述新型冠状病毒核酸。

28、在本技术的一些实施例中，检测的条件包括：温度为23℃-42℃，时间为5min-30min。

29、相对于传统技术，本发明具备如下有益效果：

30、本发明提供的新型冠状病毒检测试剂，能够针对orf1ab基因和n基因进行两重检测，针对裂解液裂解待测样本释放的新冠病毒rna核酸，在raa扩增酶包括逆转录酶、重组酶、重组酶辅助蛋白、核酸酶、单链结合蛋白和dna聚合酶的共同作用合成双链dna，并实现对合成双链dna的指数放大；对扩增产物双链dna利用依赖原间隔邻近基序的双重crrna介导下结合cas12a核酸内切酶并特异性结合双链dna同源序列上，指导cas12a核酸内切酶高效侧向切割单链dna探针，最终能够通过试纸条是否显色从而判定待测样本中是否含有新冠病毒核酸。

31、本发明通过对检测试剂中的恒温扩增引物、正、负链的crrna和探针的整体设计，有效提升检测的灵敏度。并且，用本发明的检测试剂检测新型冠状病毒，还具有特异性好、灵敏度高的特点。

32、本发明将恒温扩增技术与crispr基因编辑技术相结合，无需提取rna，能够在常温恒温条件下实现多重扩增的核酸检测，且检测结果能够可视化检测，无需专门的核酸扩增仪和专业的操作人员，结果判读相对简单与直观，检测效率高，特别适合现场检测。

33、本发明的检测试剂，能够将恒温扩增与crispr检测放入同一反应管中进行，实现病毒核酸的一体化检测，减少扩增后开盖所带来的气溶胶污染。同时，能满足将多个扩增靶点引物加入同一反应管中的需求，实现多靶点的同时扩增，省试剂、省成本、省人力、耗时短。

34、本发明的检测试剂，稳定性强，可在37℃条件存放8天仍保持其检测性能。