单加氧酶突变体及其应用的制作方法

本发明涉及酶催化领域，具体而言，涉及一种单加氧酶突变体及应用。

背景技术：

1、手性亚砜是一类手性有机硫化合物，广泛用作不对称催化的手性助剂或配体，和医药工业中的生物活性分子。许多手性亚砜都含有一个或多个手性中心，不同手性药物的药理活性、代谢过程、代谢速率以及毒性有显著差异，通常一种对映体是有效的，而另一种对映体则是低效或无效的。例如：作为手性亚砜类消化道药物的奥美拉唑和兰索拉唑，对映体纯度对该类药物的药效有很大影响。左旋的奥美拉唑即埃索美拉唑，药效优于右旋体；右旋的兰索拉唑药效优于左旋体。因此，如何高立体选择性地构建含手性中心的化合物在医药研发中有着重要意义。

2、手性亚砜可以采用化学方法和生物方法来合成，化学方法包括手性辅剂诱导、手性拆分和不对称催化等方法。然而，在合成过程中存在一些明显的缺点，如使用有害的氧化剂和有机金属试剂。此外，高光学纯度亚砜的效率不足以实现，异构体的下游去除又通常会比较棘手。与之相比，利用生物法实现手性亚砜的合成，由于相对温和的反应条件和无毒废物产生的“绿色”优势，以及更好的对映选择性和非对映选择性，越来越多的受到人们的青睐。但是，野生型的单加氧酶普遍存在的底物范围窄，活性低，稳定性差，选择性不够高，副产物砜生成等问题。我们可以通过定向进化的方法对单加氧酶进行改造，提高酶的各种性质，从而使其可以被用于工业化生产中。

技术实现思路

1、本发明的主要目的在于提供一种单加氧酶突变体及应用，以解决现有技术中的问题单加氧酶活性低、产品手性不足、杂质砜较多的问题。

2、为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种单加氧酶突变体，包括(a)具有seq id no：1所示的氨基酸序列的蛋白质；或(b)在(a)中的所述氨基酸序列的如下至少一个位点：w60，y65，d71，y77，d163，v166，s178，t179，t199，g200，s201，r222，t223，h337，p338，k342，r343，s344，r365，i393，f395，d396，a397，l448，d505，s506，y508或r509，经过氨基酸突变且具有单加氧酶功能的蛋白质；(c)与(a)和(b)中任一项限定的所述氨基酸序列具有80％以上同源性且具有单加氧酶功能的蛋白质。

3、进一步地，(b)的氨基酸突变各自独立地选自如下：d163v或d163a或d163e；v166s或v166y或v166m或v166c或v166d或v166h或v166i或v166n或v166k或v166m或v166l或v166a或v166t或v166p或v166g或v166f；h337y或h337m或h337k或h337p或h337f或h337a或h337l或h337e或h337d或h337r；p338a或p338m或p338l或p338y；k342a或k342e或k342l或k342y；r343a或r343y或r343h或r343v；s344f或s344y或s344l或s344m或s344k或s344a或s344t或s344n或s344r或s344d或s344e；r365a或r365g或r365d或r365t或r365y；i393a或i393k或i393p或i393w或i393r或i393c或i393m或i393t或i393v或i393y或i393g或i393l；f395s或f395q或f395v；d396a或d396r或d396s或d396f或d396h或d396q或d396k；a397v或a397l或a397i或a397m或a397r或a397h或a397w；其中，数字前字母代表原始氨基酸，数字后字母代表突变氨基酸；优选地，所述(c)中，与(a)或(b)中限定的所述氨基酸序列具有85％以上，优选90％以上，更优选95％以上，进一步优选99％以上同源性且具有单加氧酶功能的蛋白质。

4、进一步地，单加氧酶突变体的突变包括如下任意一种氨基酸突变：d163v；d163a；d163e；a397v；a397l；a397i；v166s；v166y；v166m；i393a；i393k；i393p；d396a；d396r；d163a+a397l；d163a+a397v；d163a+a397i；d163a+a397m；d163a+a397r；d163a+a397h；d163a+a397w；d163a+i393w；d163a+i393r；d163a+i393c；d163a+i393l；d163a+i393m；d163a+i393t；d163a+i393v；d163a+i393y；d163a+i393g；d163a+v166c；d163a+v166d；d163a+v166h；d163a+v166i；d163a+v166n；d163a+v166k；d163a+v166m；d163a+v166l；d163a+h337y；d163a+h337m；d163a+h337k；d163a+h337p；d163a+h337f；d163a+s344f；d163a+s344y；d163a+s344l；d163a+s344m；d163a+s344k；d163a+s344a；d163a+s344t；d163a+a397l+i393r；d163a+a397l+i393c；d163a+a397l+i393l；d163a+a397l+i393m；d163a+a397l+i393t；d163a+a397l+i393v；d163a+a397l+v166i；d163a+a397l+v166c；d163a+a397l+v166h；d163a+a397l+v166a；d163a+a397l+v166y；d163a+a397l+v166d；d163a+a397l+v166t；d163a+a397l+v166n；d163a+a397l+s344f；d163a+a397l+s344m；d163a+a397l+s344l；d163a+a397l+s344y；d163a+a397l+s344k；d163a+a397l+s344n；d163a+a397l+s344r；d163a+a397l+i393l；d163a+a397l+i393l+v166c；d163a+a397l+i393l+v166h；d163a+a397l+i393l+v166d；d163a+a397l+i393l+v166i；d163a+a397l+i393l+v166n；d163a+a397l+i393l+v166p；d163a+a397l+i393l+v166g；d163a+a397l+i393l+v166f；d163a+a397l+i393l+v166l；d163a+a397l+i393l+h337y；d163a+a397l+i393l+h337a；d163a+a397l+i393l+h337l；d163a+a397l+i393l+h337e；d163a+a397l+i393l+h337d；d163a+a397l+i393l+s344a；d163a+a397l+i393l+s344d；d163a+a397l+i393l+s344f；d163a+a397l+i393l+s344l；d163a+a397l+i393l+s344r；d163a+a397l+i393l+s344y；d163a+a397l+i393l+v166i+h337y；d163a+a397l+i393l+v166i+h337a；d163a+a397l+i393l+v166i+h337l；d163a+a397l+i393l+v166i+h337r；d163a+a397l+i393l+v166i+h337f；d163a+a397l+i393l+v166i+s344m；d163a+a397l+i393l+v166i+s344y；d163a+a397l+i393l+v166i+s344l；d163a+a397l+i393l+v166i+s344f；d163a+a397l+i393l+v166i+s344a；d163a+a397l+i393l+v166i+s344e；d163a+a397l+i393l+v166i+s344t；d163a+a397l+i393l+v166i+s344y+p338a；d163a+a397l+i393l+v166i+s344y+p338m；d163a+a397l+i393l+v166i+s344y+p338l；d163a+a397l+i393l+v166i+s344y+p338y；d163a+a397l+i393l+v166i+s344y+k342a；d163a+a397l+i393l+v166i+s344y+k342e；d163a+a397l+i393l+v166i+s344y+k342l；d163a+a397l+i393l+v166i+s344y+k342y；d163a+a397l+i393l+v166i+s344y+r343a；d163a+a397l+i393l+v166i+s344y+r343a；d163a+a397l+i393l+v166i+s344y+r343y；d163a+a397l+i393l+v166i+s344y+r343h；d163a+a397l+i393l+v166i+s344y+r343v；d163a+a397l+i393l+v166i+s344y+r365a；d163a+a397l+i393l+v166i+s344y+r365g；d163a+a397l+i393l+v166i+s344y+r365d；d163a+a397l+i393l+v166i+s344y+r365t；d163a+a397l+i393l+v166i+s344y+r365y；d163a+a397l+i393l+v166i+s344y+d396s；d163a+a397l+i393l+v166i+s344y+d396f；d163a+a397l+i393l+v166i+s344y+d396h；d163a+a397l+i393l+v166i+s344y+f164a；d163a+a397l+i393l+v166i+s344y+f164l；d163a+a397l+i393l+v166i+s344y+f164m；d163a+a397l+i393l+v166i+s344y+d165a；d163a+a397l+i393l+v166i+s344y+d165m；d163a+a397l+i393l+v166i+s344y+d165y；d163a+a397l+i393l+v166i+s344y+k162a；d163a+a397l+i393l+v166i+s344y+k162s；d163a+a397l+i393l+v166i+s344y+k162g；d163a+a397l+i393l+v166i+s344y+g394a；d163a+a397l+i393l+v166i+s344y+g394l；d163a+a397l+i393l+v166i+s344y+g394t；d163a+a397l+i393l+v166i+s344y+f395s；d163a+a397l+i393l+v166i+s344y+f395q；d163a+a397l+i393l+v166i+s344y+f395v；d163a+a397l+i393l+v166i+s344y+d396q；d163a+a397l+i393l+v166i+s344y+d396s；d163a+a397l+i393l+v166i+s344y+d396f；d163a+a397l+i393l+v166i+s344y+d396h；d163a+a397l+i393l+v166i+s344y+d396k。

5、为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种dna分子，该dna分子编码上述的单加氧酶突变体。

6、为了实现上述目的，根据本发明的第三个方面，提供了一种重组质粒，该重组质粒连接上述dna分子。

7、为了实现上述目的，根据本发明的第四个方面，提供了一种宿主细胞，该宿主细胞内转化有上述重组质粒。

8、进一步地，宿主细胞包括原核细胞；优选地，原核细胞包括大肠杆菌。

9、为了实现上述目的，根据本发明的第五个方面，提供了一种手性亚砜化合物的制备方法，该制备

10、方法包括利用上述单加氧酶突变体与式i和/或式ⅱ所示硫醚类底物进行加氧反应，得到手性亚砜化合物，

11、

12、

13、r1选自烷基、环烷基、芳基或杂芳基，所述烷基的c原子数选自1～8，所述环烷基、芳基或杂芳基的c原子数选自5～10；r2选自烷基、环烷基、芳基或杂芳基，所述烷基的c原子数选自1～8，所述环烷基、芳基或杂芳基的c原子数选自5～10；或，所述r1和r2与硫原子共同形成杂环基、碳环基或杂芳基，所述杂环基、碳环基或杂芳基的c原子数选自5～10；所述杂环基或杂芳基中的杂原子各自独立地选自氮、氧和硫中的至少一种；所述芳基中的芳基、杂芳基中的杂芳基、碳环基中的碳环基或杂环基中的杂环基各自独立地未被取代或取代基选自卤素、烷氧基或烷基中的至少一个基团。

14、进一步地，硫醚类底物选自

15、应用本发明的技术方案，以来源于rhodococcus jostii rha1的单加氧酶突变体(seq id no：1)为母本，进行了单点定点突变、饱和突变、组合突变等蛋白质工程改造，获得了可生产高纯度光学纯手性亚砜化合物、杂质砜较少、酶活性高的单加氧酶突变体。