一种针对抗间皮素的高亲和力抗体及其应用的制作方法

本发明属于生物医药，具体涉及一种针对抗间皮素的高亲和力抗体及其应用。

背景技术：

1、间皮素(mesothelin，msln)是一种细胞表面糖蛋白，msln的cdna包含一段1884bp的开放阅读框，共有17个外显子，编码由628个氨基酸组成的相对分子质量约为69kda的前体蛋白，经糖基化后被弗林蛋白酶切割产生相对分子质量分别约为40kda和31kda的2个蛋白，羧基端的疏水序列被糖基磷脂酰肌醇取代并锚定在细胞膜上，分子量约为40kda，称为间皮素；氨基端部分释放进入血液或进一步降解，分子量约为31kda，称为巨核细胞集落刺激因子(megakaryocyte-potentiating factor，mpf)(参见：chang,k.&pastan,i.molecular cloning of mesothelin,a differentiation antigen present onmesothelium,mesotheliomas,and ovarian cancers.proceedings of the nationalacademy of sciences of the united states of america 93,136-140,doi:10.1073/pnas.93.1.136(1996).)。目前研究表明msln参与调控细胞的存活、增殖以及迁移，并且能使细胞抵抗部分细胞毒性药物的杀伤(tang,z.,qian,m.&ho,m.the role ofmesothelinin tumor progression and targeted therapy.anti-cancer agents in medicinalchemistry 13,276-280,doi:10.2174/1871520611313020014(2013).)。

2、msln是一种分化抗原，在胰腺癌、恶性间皮瘤、卵巢癌和非小细胞肺癌等肿瘤组织中高表达(参见：baldo,p.&cecco,s.amatuximab and novel agents targetingmesothelin for solid tumors.oncotargetsand therapy 10,5337-5353,doi:10.2147/ott.s145105(2017).)。免疫组织化学染色表明：在大多数的胰腺癌组织中(75％-100％)msln表达呈阳性，然而，在大多数的慢性胰腺炎组织(80％-100％)和几乎所有正常胰腺组织中msln表达呈阴性(参见：baruch,a.c.et al.immunocytochemical study oftheexpression of mesothelin in fine-needle aspirationbiopsy specimensofpancreatic adenocarcinoma.diagnostic cytopathology 35,143-147,doi:10.1002/dc.20594(2007).；ibrahim,d.a.&abouhashem,n.s.diagnostic value of imp3 andmesothelin in differentiating pancreatic ductal adenocarcinoma from chronicpancreatitis.pathology,research and practice 212,288-293,doi:10.1016/j.prp.2016.01.007(2016).)。上皮恶性胸膜间皮瘤(epithelial malignant肋膜间皮瘤，mpm)普遍表达间皮素，而肉瘤样胸膜间皮瘤不表达间皮素，大多数浆液性上皮性卵巢癌和相关的原发性腹膜癌表达间皮素。

3、msln也存在于部分正常组织中，使用由pastan小组开发的小鼠抗人间皮素抗体k1，在腹膜、胸膜和心包腔的间皮细胞中已经证实了强烈的k1反应性，但其水平低于在恶性组织中达到的水平(参见：chang k,pai l h,batra j k,et al.characterization oftheantigen(cak1)recognized by monoclonal antibody k1 present on ovarian cancersand normal mesothelium.[j].cancer research,1992,52(1):181-186.)；在输卵管上皮、气管基底上皮和扁桃体上皮中检测到弱k1反应；在角膜的各个层都可以发现间皮素，然而，在肝脏、肾脏、脾脏、骨髓、淋巴结、胸腺、心肌、舌头、骨骼肌、皮肤、大脑皮层、小脑、脊髓、周围神经、垂体、肾上腺、唾液腺、乳腺、甲状腺、甲状旁腺、睾丸、前列腺、附睾、宫颈上皮、肺实质、食道、小肠上皮、结肠上皮、膀胱上皮、胆囊上皮等大多数正常组织中未检测到k1反应(参见：chang k,pai l h,batra j k,et al.characterization ofthe antigen(cak1)recognized by monoclonal antibody k1 present on ovarian cancers and normalmesothelium.[j].cancer research,1992,52(1):181-186.)。

4、目前研究表明msln可作为治疗的靶点(参见：argani,p.,et al.,mesothelin isoverexpressed in the vast majority of ductal adenocarcinomas of the pancreas:identification of a new pancreatic cancer marker by serial analysis ofgeneexpression(sage).clin cancer res,2001.7(12):3862-8.)，pastan和他的同事们使用一种与免疫毒素结合的抗间皮素抗体的可溶性抗体片段来治疗间皮素阳性肿瘤的癌症患者，证明了这种方法在胰腺癌治疗中具有足够的安全性和一定的临床活性(参见：hassan r,etal.preclinical evaluation of morab-009,a chimeric antibody targeting tumor-associated mesothelin.cancer immun.2007；7:20–29；hassan r,et al.phase i studyof ss1p,a recombinant anti-mesothelin immunotoxin given as a bolusi.v.infusion to patients with mesothelin-expressing mesothelioma,ovarian,andpancreatic cancers.clin cancer res.2007；13(17):5144-5149.)，在卵巢癌中，这种治疗策略根据recist标准产生了一个轻微的反应，并在另一个患者腹水完全缓解的情况下病情稳定。

5、stromnes等人构建了表达识别msln的tcr-t细胞，在体外实验能诱导胰腺癌细胞的大量死亡，在体内实验能显著延长荷瘤小鼠的生存时间(参见：stromnes,i.m.et al.tcells engineered against a native antigen can surmount immunologic andphysical barriers to treat pancreatic ductal adenocarcinoma.cancer cell 28,638-652,doi:10.1016/j.ccell.2015.09.022(2015).)。然而，此项研究只是进行了小鼠体内实验，并没有进行临床研究。2015年，宾夕法尼亚大学的研究人员完成了一例靶向msln的car-t细胞(meso-car-t)靶向治疗胰腺导管腺癌患者的临床试验(nct01897415)，该实验控制了患者的肿瘤生长，但是由于移植物抗宿主反应，降低了car-t的治疗效果，造成控制肿瘤生长的时间非常短暂(参见：deselm,c.j.,tano,z.e.,varghese,a.m.&adusumilli,p.s.car t-cell therapy for pancreatic cancer.journal of surgical oncology116,63-74,doi:10.1002/jso.24627(2017).)。2018年宾夕法尼亚大学的研究团队又发表了一项临床实验报告，评估了6例使用了meso-car-t靶向治疗的难治性胰腺导管腺癌转移复发患者，结果显示2例患者疾病稳定，4例患者发生了疾病进展，6例患者均未发生细胞因子释放综合征或神经症状的不良反应(参见：beatty,g.l.et al.activity ofmesothelin-specific chimeric antigen receptor t cells againstpancreaticcarcinoma metastases in a phase 1trial.gastroenterology 155,29-32,doi:10.1053/j.gastro.2018.03.029(2018).)。

6、综上所述，间皮素可作为肿瘤治疗的靶点，提供具备高特异性和亲和力的抗间皮素抗体，对于治疗肿瘤领域具有重要意义。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足和实际需求，本发明的提供一种针对抗间皮素的高亲和力抗体及其应用。所述抗体具有高亲和力，能够作为嵌合抗原受体分子的抗原结合结构域制备car-t细胞，所得car-t细胞在肿瘤治疗方面具有较好的应用前景。

2、为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种抗间皮素的纳米抗体，所述纳米抗体的cdr1的氨基酸序列包括seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3或seq id no.4所示的序列，所述纳米抗体的cdr2的氨基酸序列包括seq id no.5、seq id no.6或seq id no.7所示的序列，所述纳米抗体的cdr3的氨基酸序列包括seq id no.8、seq id no.9或seq id no.10所示的序列。

4、本发明中，以间皮素重组蛋白免疫一只未经免疫的羊驼，构建噬菌体展示纳米抗体库，根据该噬菌体展示纳米抗体库对抗间皮素抗体进行筛选，得到可特异性的结合间皮素抗原的单克隆抗体。

5、seq id no.1：gftfrnyg。

6、seq id no.2：gftfsryg。

7、seq id no.3：grtfstys。

8、seq id no.4：gftfrryg。

9、seq id no.5：ifsdgst。

10、seq id no.6：iswiggst。

11、seq id no.7：iysdgst。

12、seq id no.8：atdpgsgtttlhrpfgs。

13、seq id no.9：aatksewrdpdy。

14、seq id no.10：atdpgsgtttlhrsfgs。

15、优选地，所述纳米抗体的cdr1的氨基酸序列包括seq id no.1所示的序列，cdr2的氨基酸序列包括seq id no.3所示的序列，cdr3的氨基酸序列包括seq id no.8所示的序列。

16、优选地，所述纳米抗体的cdr1的氨基酸序列包括seq id no.2所示的序列，cdr2的氨基酸序列包括seq id no.3所示的序列，cdr3的氨基酸序列包括seq id no.8所示的序列。

17、优选地，所述纳米抗体的cdr1的氨基酸序列包括seq id no.3所示的序列，cdr2的氨基酸序列包括seq id no.6所示的序列，cdr3的氨基酸序列包括seq id no.9所示的序列。

18、优选地，所述纳米抗体的cdr1的氨基酸序列包括seq id no.2所示的序列，cdr2的氨基酸序列包括seq id no.7所示的序列，cdr3的氨基酸序列包括seq id no.10所示的序列。

19、优选地，所述纳米抗体的cdr1的氨基酸序列包括seq id no.4所示的序列，cdr2的氨基酸序列包括seq id no.7所示的序列，cdr3的氨基酸序列包括seq id no.8所示的序列。

20、优选地，所述纳米抗体的重链可变区还包括：seq id no.11或seq id no.12所示的框架区1(fr1)、seq id no.13、seq id no.14、seq id no.15、seq id no.16或seq idno.17所示的框架区2(fr2)、seq id no.18、seq id no.19、seq id no.20或seq id no.21所示的框架区3(fr3)和seq id no.22所示的框架区4(fr4)。

21、seq id no.11：qvqlvesggglvqpggslrlscaas。

22、seq id no.12：qvqlvesggglvpaggslrlscaas。

23、seq id no.13：mgwarqvpgqglewvsg。

24、seq id no.14：mgwarqvpgkelewvsg。

25、seq id no.15：mgwfrqapgkerepvav。

26、seq id no.16：mgwarqvpgkglewvsg。

27、seq id no.17：mgwarqvsgkglewvsg。

28、seq id no.18：

29、yyadsvkgrftisrdnakntvylqmnslkpedtavyyc。

30、seq id no.19：

31、yyadsvkgrftisrdnaqntvylqmnslkpedtavyyc。

32、seq id no.20：

33、yyadsvkgrftisrdyakntlylqmnslkpadtavyyc。

34、seq id no.21：

35、yyadsvkgrftisrdnakntvylqmntlkpedtavyyc。

36、seq id no.22：wgqgtqvtvss。

37、优选地，所述纳米抗体的重链可变区包括seq id no.23、seq id no.24、seq idno.26或seq id no.27所示的氨基酸序列。

38、seq id no.23：

39、qvqlvesggglvqpggslrlscaasgftfrnygmgwarqvpgqglewvsgifsdgstyyadsvkgrftisrdnakntvylqmnslkpedtavyycatdpgsgtttlhrpfgswgqgtqvtvss。

40、seq id no.24：

41、qvqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsrygmgwarqvpgkelewvsgifsdgstyyadsvkgrftisrdnaqntvylqmnslkpedtavyycatdpgsgtttlhrpfgswgqgtqvtvss。

42、seq id no.25：

43、qvqlvesggglvpaggslrlscaasgrtfstysmgwfrqapgkerepvaviswiggstyyadsvkgrftisrdyakntlylqmnslkpadtavyycaatksewrdpdywgqgtqvtvss。

44、seq id no.26：

45、qvqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsrygmgwarqvpgkglewvsgiysdgstyyadsvkgrftisrdnakntvylqmnslkpedtavyycatdpgsgtttlhrsfgswgqgtqvtvss。

46、seq id no.27：

47、qvqlvesggglvqpggslrlscaasgftfrrygmgwarqvsgkglewvsgiysdgstyyadsvkgrftisrdnakntvylqmntlkpedtavyycatdpgsgtttlhrpfgswgqgtqvtvss。

48、本发明中，利用噬菌体展示技术对间皮素免疫骆驼vhh文库进行筛选，得到的纳米抗体具备高亲和性高，在构建靶向间皮素的嵌合抗原受体方面具有重要的应用前景。

49、第二方面，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子包括第一方面所述的抗间皮素的纳米抗体的编码基因。

50、第三方面，本发明提供一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、铰链区、跨膜区和信号转导结构域，所述抗原结合结构域包括第一方面所述的抗间皮素的纳米抗体。

51、优选地，所述信号肽包括cd8α信号肽。

52、优选地，所述铰链区包括cd8α铰链区。

53、优选地，所述跨膜区包括cd8α跨膜区、cd28跨膜区或dap10跨膜区中的任意一种或至少两种的组合。

54、优选地，所述信号转导结构域包括免疫受体酪氨酸活化基序(cd3ζ)。

55、优选地，所述信号转导结构域还包括共刺激分子，所述共刺激分子包括4-1bb、cd28胞内区、ox40、icos或dap10胞内区中的任意一种或至少两种的组合。

56、优选地，所述嵌合抗原受体包括cd8α信号肽、第一方面所述的抗间皮素的纳米抗体、cd8α铰链区、cd8α跨膜区和免疫受体酪氨酸活化基序。

57、第四方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体包括第三方面所述的嵌合抗原受体的编码基因。

58、优选地，所述表达载体为含有第三方面所述的嵌合抗原受体的编码基因的慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种，优选为慢病毒载体。

59、第五方面，本发明提供一种重组慢病毒，所述重组慢病毒含有第四方面所述的表达载体。

60、优选地，所述重组慢病毒由转染第四方面所述的表达载体和辅助质粒的哺乳细胞制备得到。

61、第六方面，本发明提供一种嵌合抗原受体免疫细胞，所述嵌合抗原受体免疫细胞表达第三方面所述的嵌合抗原受体。

62、优选地，所述嵌合抗原受体免疫细胞包括第四方面所述的表达载体和/或底物方面所述的重组慢病毒。

63、优选地，所述嵌合抗原受体免疫细胞包括t细胞、b细胞、nk细胞、肥大细胞或巨噬细胞中的任意一种或至少两种的组合。

64、第七方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第六方面所述的嵌合抗原受体免疫细胞。

65、优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。

66、优选地，所述辅料包括载体、稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、渗透压调节剂、表面活性剂、包衣材料、着色剂、ph调节剂、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合。

67、第八方面，本发明提供第一方面所述的抗间皮素的纳米抗体、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的嵌合抗原受体、第四方面所述的表达载体、第五方面所述的重组慢病毒、第六方面所述的嵌合抗原受体免疫细胞或第七方面所述的药物组合物在制备肿瘤治疗药物中的应用。

68、优选地，所述肿瘤包括表达间皮素的肿瘤。

69、与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

70、(1)本发明以间皮素重组蛋白免疫未经免疫的羊驼，构建噬菌体展示纳米抗体库，根据该噬菌体展示纳米抗体库对抗间皮素抗体进行筛选，所得纳米抗体可特异性的结合间皮素抗原，且亲和力较好，通过抗体亲和力的测定可知，其kd(m)分别为2.83×10-8、1.01×10-8、1.41×10-8、6.34×10-8和5.82×10-8；

71、(2)本发明提供的抗间皮素的纳米抗体具有较好的亲和力，将其作为抗原结合结构域构建嵌合抗原受体，并利用该嵌合抗原受体制备t细胞，所述car-t细胞对间皮素阳性的肿瘤细胞具有杀伤活性，且与间皮素阳性细胞共培养后，高效分泌细胞因子ifn-γ和tnf-α，说所述纳米抗体能够有效应用于免疫治疗，对于开发肿瘤治疗药物具有重要意义。