鲜活水生动物运输用水中病毒的富集方法与流程

1.本发明涉及环境监测技术领域，特别是涉及鲜活水生动物运输用水中病毒的富集方法。


背景技术：

2.水产品是人们摄取动物性蛋白质的一个重要组成部分，随着经济的迅速发展，人们对质量的要求也越来越高，对于水产品而言，重要的品质之一也就是鲜活度。所以说，想方设法减少运输过程中对水产品造成的损害，保证水产品的品质是一个非常重要的问题。另一方面，大多数人们都认为新鲜的水产品的营养价值更高、口感更好，新鲜水产品的营销被认为是一个增值的过程，因为活的水产品会以更低的加工成本获得更高的价格。而在水产养殖中，鱼虾类应激死亡问题是活体运输中的一大难题，所以减少鱼虾类的运输中应激死亡在食用和销售方面都具有重要的意义。
3.鱼类在运输过程中，会遭受各种胁迫(饥饿胁迫、氨氮胁迫、ph胁迫、震动胁迫、温度胁迫、拥挤胁迫等)，以至于产生应激反应，引起生理生化指标的变化。为了对水生动物运输用水中诺如病毒的准确检测能为鱼类暴发死亡原因的确定起关键作用，由于水标本样本量大病毒含量低，需要经病毒富集才能进行检测。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供鲜活水生动物运输用水中病毒的富集方法，以解决上述背景中提出的问题。
5.为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：
6.本发明为鲜活水生动物运输用水中病毒的富集方法，包括以下步骤：
7.step1、用大容量电动移液器分别移取3份35ml鲜活水生动物运输用水样本置于3个50ml离心管中，在4℃、2 500g条件下离心30min，将上清液分别转移到另外3个50ml离心管中备用；
8.step2、在step1中的3个50ml离心管中分别加入3.5g
±
0.1g氯化钙和0.79g
±
0.01g无水磷酸氢二钠，充分混合，直至试剂完全溶解，然后在4℃、12000g条件下离心120min，离心机降速时不应使用制动力，离心机停止后倾倒并弃除离心管中的上清液，至无上清液流出；
9.step3、在4℃、12000g条件下将step2离心后剩余的样本再次离心5min，离心机降速时不应使用制动力，离心机停止后用移液器从离心管中吸出并弃除剩余的上清液；
10.step4、吸取0.4mlpbs溶液加入到其中的一个离心管中，反复吹吸沉淀，瞬时离心，使所有液体聚集在管底，将混悬液吸出并加入到第二个离心管中；
11.step5、重复吹吸沉淀和瞬时离心的操作后，再次将混悬液吸出并加入到第三个离心管中；
12.step6、续重复吹吸沉淀和瞬时离心的操作，最终形成的混悬液即为该水样的浓缩
液，体积约为0.6ml。
13.step7、将浓缩液转移至1.5ml离心管中，于0℃～4℃条件下保存，并于24h内测定该样品水样的病毒效价，根据实际抽取的水样量计算实际水中的病毒效价。
14.优选地，step1中所述鲜活水生动物运输用水样本悬浮物含量过高，可能影响病毒效价测定时，应采用预离心弃除悬浮物后再进行后续操作。
15.优选地，step1中所述鲜活水生动物运输用水样本需要进行前处理，清除水样中的消毒剂。
16.优选地，step1中所述大容量电动移液器需要预先使用紫外线杀菌24小时以上。
17.本发明具有以下有益效果：
18.本发明，向鲜活水生动物运输用水中加入无水磷酸氢二钠和氯化钙，无水磷酸氢二钠在一定盐浓度条件下可使病毒颗粒形成多聚体，在一定离心力下将水溶液与病毒颗粒多聚体分开，收集病毒颗粒多聚体形成的沉淀，用于后续测定样品水样的病毒效价，操作简单便捷，能够准确获得结果。
19.本发明，通过预离心、二次离心和富集浓缩实现了大水样量水体中的病毒富集，能为鲜活水生动物运输时鱼类暴发死亡原因的确定起关键作用。
20.当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
21.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
22.图1为本发明的鲜活水生动物运输用水中病毒的富集方法的操作方法流程图；
具体实施方式
23.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
24.实施例一
25.请参阅图1所示：本发明为鲜活水生动物运输用水中病毒的富集方法，包括以下步骤：
26.step1、用大容量电动移液器分别移取3份35ml鲜活水生动物运输用水样本置于3个50ml离心管中，在4℃、2 500g条件下离心30min，将上清液分别转移到另外3个50ml离心管中备用；
27.step2、在step1中的3个50ml离心管中分别加入3.5gg氯化钙和0.79g g无水磷酸氢二钠，充分混合，直至试剂完全溶解，然后在4℃、12000g条件下离心120min，离心机降速时不应使用制动力，离心机停止后倾倒并弃除离心管中的上清液，至无上清液流出；
28.step3、在4℃、12000g条件下将step2离心后剩余的样本再次离心5min，离心机降
速时不应使用制动力，离心机停止后用移液器从离心管中吸出并弃除剩余的上清液；
29.step4、吸取0.4mlpbs溶液加入到其中的一个离心管中，反复吹吸沉淀，瞬时离心，使所有液体聚集在管底，将混悬液吸出并加入到第二个离心管中；
30.step5、重复吹吸沉淀和瞬时离心的操作后，再次将混悬液吸出并加入到第三个离心管中；
31.step6、续重复吹吸沉淀和瞬时离心的操作，最终形成的混悬液即为该水样的浓缩液，体积约为0.6ml。
32.step7、将浓缩液转移至1.5ml离心管中，于2℃条件下保存，并于24h内测定该样品水样的病毒效价，根据实际抽取的水样量计算实际水中的病毒效价。
33.进一步地，step1中所述鲜活水生动物运输用水样本悬浮物含量过高，可能影响病毒效价测定时，应采用预离心弃除悬浮物后再进行后续操作。
34.进一步地，step1中所述鲜活水生动物运输用水样本需要进行前处理，清除水样中的消毒剂。
35.进一步地，step1中所述大容量电动移液器需要预先使用紫外线杀菌24小时以上。
36.实施例二
37.本发明为鲜活水生动物运输用水中病毒的富集方法，包括以下步骤：
38.step1、用大容量电动移液器分别移取3份35ml鲜活水生动物运输用水样本置于3个50ml离心管中，在4℃、2 500g条件下离心30min，将上清液分别转移到另外3个50ml离心管中备用；
39.step2、在step1中的3个50ml离心管中分别加入3.6g氯化钙和0.78g无水磷酸氢二钠，充分混合，直至试剂完全溶解，然后在4℃、12000g条件下离心120min，离心机降速时不应使用制动力，离心机停止后倾倒并弃除离心管中的上清液，至无上清液流出；
40.step3、在4℃、12000g条件下将step2离心后剩余的样本再次离心5min，离心机降速时不应使用制动力，离心机停止后用移液器从离心管中吸出并弃除剩余的上清液；
41.step4、吸取0.4mlpbs溶液加入到其中的一个离心管中，反复吹吸沉淀，瞬时离心，使所有液体聚集在管底，将混悬液吸出并加入到第二个离心管中；
42.step5、重复吹吸沉淀和瞬时离心的操作后，再次将混悬液吸出并加入到第三个离心管中；
43.step6、续重复吹吸沉淀和瞬时离心的操作，最终形成的混悬液即为该水样的浓缩液，体积约为0.6ml。
44.step7、将浓缩液转移至1.5ml离心管中，于2℃条件下保存，并于24h内测定该样品水样的病毒效价，根据实际抽取的水样量计算实际水中的病毒效价。
45.优选地，step1中所述鲜活水生动物运输用水样本悬浮物含量过高，可能影响病毒效价测定时，应采用预离心弃除悬浮物后再进行后续操作。
46.优选地，step1中所述鲜活水生动物运输用水样本需要进行前处理，清除水样中的消毒剂。
47.优选地，step1中所述大容量电动移液器需要预先使用紫外线杀菌24小时以上。
48.在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施
例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
49.以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。