一种高产赤藓糖醇的基因工程菌、构建方法及应用

(一)本发明涉及一种高产赤藓糖醇的基因工程菌、构建方法及应用。

背景技术：

0、(二)背景技术

1、赤藓糖醇是四碳糖醇，分子式为c4h10o4，在自然界中广泛存在。随着近年来人们对于健康的重视，赤藓糖醇由于其零热量、非龋齿性、食用安全，不被人体代谢吸收等优良特性，在糖替代品的研究中，其独特的性质使其成为甜味剂研究的热点之一。目前，赤藓糖醇被广泛用于食品的配料中天然甜味剂和食品添加剂，被越来越多地用于食品、化工和制药行业，市场需求也在逐年增加。

2、目前我国合成赤藓糖醇的微生物主要为解脂耶氏酵母，其遗传背景清晰。针对其不同的碳利用途径，开展基因编辑、代谢工程和合成生物学等领域的相关工作，广泛应用于多种化学品的开发，是良好的工业生产菌株。尽管已有研究开展了解脂耶氏酵母的赤藓糖醇生产菌株的代谢工程改造，但主要聚焦在葡萄糖和甘油的利用，暂无利用木糖代谢合成赤藓糖醇的报道。尽管解脂耶氏酵母自身具备木糖代谢途径，但是其通路中基因表达量极低，导致其无法利用木糖进行生长和生产。也有研究采用基因工程的手段工程化解脂耶氏酵母细胞，使其可利用木糖进行生长，但是并未与工业化生产进行关联，尤其与赤藓糖醇的生产关联。

3、在解脂耶氏酵母中，赤藓糖醇的合成较为复杂，根据碳源类型分为三条通路。

4、葡萄糖代谢通路(6c)为骨架通路：首先葡萄糖(glucose)经过己糖激酶(hk) 磷酸化成为6-磷酸葡萄糖(g-6-p)并进入细胞内，然后通过6-磷酸葡萄糖脱氢酶以及6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶催化下转变为5-磷酸核酮糖(5-p-ru)。5-磷酸核酮糖在阿拉伯糖醇脱氢酶作用下可以转变为阿拉伯糖醇副产物。5-磷酸核酮糖分别异构转变为 5-磷酸核糖(5-p-r)以及5-磷酸木酮糖(5-p-xylu)，再在转酮酶(tkl1)催化下转化为7-磷酸景天庚酮糖(sep-7-p)与3-磷酸甘油醛(3-p-ga)，再在转醛酶作用下转变为6-磷酸果糖(f-6-p)与4-磷酸赤藓糖(ery-4-p)。4-磷酸赤藓糖在磷酸酶 (erypase)作用下去磷酸化变为赤藓糖(erythrose)，再在赤藓糖还原酶还原下转变为赤藓糖醇(erythritol)。同时6-磷酸葡萄糖在磷酸葡萄糖异构酶(pgi)催化下转变为6-磷酸果糖，在磷酸化酶作用下转变为果糖，果糖在甘露醇脱氢酶催化下转变为副产物甘露醇。

5、甘油通路为次级通路(3c)：甘油进入细胞后，在甘油激酶(gk)的作用下，消耗1分子atp生产3-磷酸甘油，由3-磷酸甘油脱氢酶(gpd)脱氢形成磷酸二羟基丙酮(dhap)，随后磷酸甘油醛异构酶(tpi)将其异构化形成3-磷酸甘油醛(g3p)，再在转酮酶tkl1的作用下与6-磷酸果糖共同形成5-磷酸木酮糖和4-磷酸赤藓糖，进入磷酸戊糖途径。

6、木糖通路为低水平表达通路(5c)：木糖经转运蛋白进入细胞，在nad(p)h 依赖的木糖还原酶xr作用下还原为木糖醇，随后nad+依赖的木糖醇脱氢酶xdh 将其氧化为木酮糖，木酮糖在木酮糖磷酸激酶xk的作用下转化为5-p木酮糖，进入非氧化阶段的磷酸戊糖途径，再在转酮酶(tkl1)、转醛酶(tal)、磷酸酶(eryp)、赤藓糖还原酶(erth)催化下完成赤藓糖醇的合成。尽管解脂耶氏酵母存在木糖通路，但是受碳代谢阻遏的影响，导致xk基因表达量极低，无法利用木糖。

7、上述代谢通路中，改造葡萄糖通路和甘油通路较为常见。已有较多的文献(zhangl,et al.multiple gene integration to promote erythritol production onglycerol in yarrowia lipolytica[j].biotechnology letters,2021(17)；carly f,etal.identification and characterization of eyk1,a key gene for erythritolcatabolism in yarrowia lipolytica[j]. applied microbiology&biotechnology,2017；wang n,et al.metabolic engineering of yarrowia lipolytica forthermoresistance and enhanced erythritol productivity[j]. biotechnology forbiofuels,2020,13(1).)和专利(cn 202010069250.6和 cn202011516582.0)报道了通过代谢工程改造合成赤藓糖醇。这些较成熟的赤藓糖醇生产方式都是利用葡萄糖或甘油为底物的微生物工厂发酵。以工业粗甘油为碳源的发酵生产虽然成本低，但是赤藓糖醇产量不高；以葡萄糖为碳源的发酵生产产能高，同时消耗大量淀粉质原料，面临着碳源价格高的问题。而木质纤维素类生物质作为地球上储量最大的可再生资源，其糖组分主要是葡萄糖(占比60％～70％)，其次为木糖 (占比30％～40％)，尤其是中国的小麦淀粉加工过程中，会产生大量废弃淀粉。根据其不同碳含量分为b淀粉和c淀粉，其碳含量占比如下表1所示。如果能够开发出利用葡萄糖和木糖双碳利用的底盘细胞不仅可以促进我国赤藓糖醇产业的发展，还可以充分深加工淀粉加工产业的废弃碳源。

8、表1：小麦淀粉生产中间体属性

9、 中间体 淀粉含量 蛋白质 葡聚糖 木聚糖 阿拉伯糖 其他 b淀粉(干基) 63.2％ 8.9％ 2.7％ 13％ 2.4％ 9.8％ c淀粉(干基) 48.2％ 12.9％ 1.7％ 15.6％ 2.2％ 19.3％ b+c淀粉(干基) 67.8％ 7.5％ 3.1％ 15.2％ 2.9％ 3.5％ 

10、基于上述研究背景，赤藓糖醇生产过程的碳源利用成了其产业化过程中需要攻克的难题。可以基于经典的葡萄糖代谢途径改造结合重新构建的木糖途径提高小麦加工过程产生的废弃淀粉质原料作为发酵生产的关键碳源，从而促进小麦淀粉的精深加工，达到降低成本的目的。目前尚未有整合葡萄糖和木糖共代谢的底盘细胞，所以工业上迫切需要设计并构建出能够利用废弃淀粉质原料的底盘细胞，减少资源浪费，提高生物能源的利用效率。

技术实现思路

0、(三)
技术实现要素：

1、本发明的目的是提供具有木糖代谢途径(xr-xdh途径)的可快速代谢葡萄糖和木糖生产赤藓糖醇的解脂耶氏酵母工程菌株，以及该基因工程菌在微生物发酵制备赤藓糖醇中的应用。

2、本发明采用的技术方案是：

3、高产赤藓糖醇的基因工程菌，由如下方法构建获得：

4、(1)以解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)为底盘菌，过表达编码木糖还原酶的基因(xylose reductase，xr)、编码木糖醇脱氢酶的基因(xylitol dehydrogenase， xdh)和编码木酮糖激酶的基因(xylulose kinase，xk)，得到工程菌yarrowia lipolytica xr:xdh:xk，记为ery1；

5、(2)将工程菌ery1基因组中的赤藓糖醇脱氢酶(erythritol dehydrogenase，eyd)基因敲除，得到工程菌yarrowia lipolytica xr:xdh:xkδeyd，记为ery2；

6、(3)将工程菌ery2基因组中的甘露糖醇脱氢酶基因(mannitol dehydrogenase，mdh)敲除，得到工程菌yarrowia lipolytica xr:xdh:xkδeydδmdh，记为ery3；

7、(4)将工程菌ery3基因组中的阿拉伯糖醇脱氢酶基因(arabitol dehydrogenase，ardh)敲除，得到工程菌yarrowia lipolytica xr:xdh:xkδeydδmdhδardh，记为 ery4；

8、(5)以工程菌ery4为底盘菌，过表达磷酸戊糖途径非氧化模块基因转酮酶 tkl1、转醛酶tal和赤藓糖还原酶er，得到工程菌yarrowia lipolytica xr:xdh:xkδeydδmdhδardh:tkl1:tal:er，记为ery5；

9、(6)以工程菌ery5为底盘菌，过表达hk基因、stp1基因和stp2基因，得到工程菌yarrowia lipolytica xr:xdh:xkδeydδmdh δardh:tkl1:tal:er:hk:stp1:stp2，记为ery6，即所述高产赤藓糖醇的基因工程菌。

10、本发明以代谢工程、基因工程的手段，将解脂耶氏酵母进行改良，使得重组解脂耶氏酵母能够更好的利用葡萄糖木糖混合培养基高效地合成赤藓糖醇，通过(1)强化解脂耶氏酵母赤藓糖醇合成途径的木糖代谢模块，增强其对木糖的利用能力；(2) 减弱副产物的碳分流作用和赤藓糖醇降解对产量的影响；(3)增强磷酸戊糖途径的非氧化还原模块，提升赤藓糖醇转化效率；(4)强化糖摄取模块，即得到可代谢葡萄糖和木糖混合糖的解脂耶氏酵母赤藓糖醇基因工程菌株，该菌株以葡萄糖、木糖混合碳源高效合成赤藓糖醇，且不再合成副产物(如甘露醇、阿拉伯糖醇等)。

11、本发明还涉及构建所述基因工程菌的方法，所述方法包括：

12、(1)以解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)为底盘菌，应用26s rdna多位点整合质粒将木糖代谢基因xr、xdh、xk进行三基因串联多拷贝表达，选用启动子分别为ptef1、pgpd2、php4d，得到工程菌yarrowia lipolytica xr:xdh:xk，记为ery1；

13、(2)应用同源重组技术将工程菌ery1基因组中的赤藓糖醇脱氢酶(erythritoldehydrogenase，eyd)基因敲除，得到工程菌yarrowia lipolytica xr:xdh:xkδeyd::ura3d，同时，采用五氟乳清酸(5-foa)和尿嘧啶核苷(uridine， u)的反向筛选功能，利用敲除框内自重组技术去除筛选标记ura3d，得到工程菌 yarrowia lipolytica xr:xdh:xkδeyd，记为ery2；

14、(3)应用同源重组技术将工程菌ery2基因组中的甘露糖醇脱氢酶基因 (mannitoldehydrogenase，mdh)敲除，得到工程菌yarrowia lipolytica xr:xdh:xkδeydδmdh::ura3d，同时，采用五氟乳清酸和尿嘧啶核苷的反向筛选功能，利用敲除框内自重组技术去除筛选标记ura3d，得到工程菌yarrowia lipolytica xr:xdh:xkδeydδmdh，记为ery3；

15、(4)应用同源重组技术将工程菌ery3基因组中的阿拉伯糖醇脱氢酶基因(arabitol dehydrogenase，ardh)敲除，得到yarrowia lipolytica xr:xdh:xkδeydδmdhδardh::ura3d，同时，采用五氟乳清酸和尿嘧啶核苷的反向筛选功能，利用敲除框内自重组技术去除筛选标记ura3d，得到工程菌yarrowia lipolytica xr:xdh:xkδeydδmdhδardh，记为ery4；

16、(5)以工程菌ery4为底盘菌，应用zeta序列多位点整合质粒将转酮酶基因(transketolase，tkl1)、转醛酶基因(transaldolase，tal)和赤藓糖还原酶基因(erythrose reductase，er)进行三基因多拷贝表达，选用启动子分别为ptef1、pgpd2、 php4d，得到工程菌yarrowia lipolytica xr:xdh:xkδeydδmdhδardh:tkl1:tal:er，记为ery5；

17、(6)以工程菌ery5为底盘菌，应用26s rdna序列多位点整合质粒将己糖激酶基因(hexokinase，hk)、糖转运蛋白1基因(sugar transporter 1，stp1)和糖转运蛋白2基因(sugar transporter 2，stp2)过表达，选用启动子分别为ptef1、pgpd2、 php4d，得到工程菌yarrowia lipolytica xr:xdh:xkδeydδmdhδardh:tkl1:tal:er:hk:stp1:stp2，记为ery6即所述高产赤藓糖醇的基因工程菌。

18、具体的，所述启动子ptef1序列如seq id no.1所示，启动子pgpd2序列如seq id no.2所示，启动子php4d序列如seq id no.3所示。

19、具体的，所述xr、xdh、xk、tkl1、tal、er、hk、stp1和stp2基因序列的ncbi登录号分别为：xp_502540.1，xp_503864.1、xp_505266.1、xp_503628.1、 xp_505460.1、xp_505585.1、xp_501216.1、xp_002548209.1和xp_002545887.1。

20、本发明还涉及所述基因工程菌在微生物发酵制备赤藓糖醇中的应用。

21、具体的，所述应用为：将所述基因工程菌菌株接种于以葡萄糖和/或木糖为碳源的发酵培养基中，于25～32℃、180～300rpm条件下进行发酵培养96～200h，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到所述赤藓糖醇。所述基因工程菌株发酵前，通常先接种至ypd培养基中，于温度28℃～30℃、转速180～250rpm的摇床上过夜培养，然后以体积浓度10％接种量，接种至发酵培养基中培养。

22、进一步，所述应用为：将所述基因工程菌株划线至ypd固体培养基，30℃静置培养2天，挑取单菌落接种至50ml液体ypd培养基，28～30℃、180rpm～250rpm 条件下培养24小时，随后转接30ml至300mlypd培养基中，28～30℃、180rpm～250 rpm条件下发酵24小时全部转接至5l发酵罐内，发酵液总体积为3l。采用恒化培养的方式，控制发酵条件为：转速450～600rpm，ph＝6.0，发酵通气速率0.5～1vvm，发酵200小时，发酵结束后分离纯化获得赤藓糖醇。

23、优选的，所述发酵培养基组成如下：葡萄糖100～300g/l，木糖50～200g/l，酵母粉1～10g/l，蛋白胨1～10g/l，柠檬酸三铵0.5～2.0g/l，七水硫酸镁 0.05～0.2g/l，七水硫酸锌0.05～0.2g/l，四水氯化锰0.01～0.05g/l，溶剂为水，ph自然。

24、本发明改造了解脂耶氏酵母的赤藓糖醇生物合成网络，通过强启动子ptef1、 pgpd2、php4d分别强表达xr、xdh、xk基因，重塑了以木糖为碳源的赤藓糖醇生物合成途径，所述ptef1、pgpd2、php4d启动子分别对应seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3。通过敲除赤藓糖醇降解途径基因eyd、碳分流途径基因甘露糖醇脱氢酶mdh和阿拉伯糖醇脱氢酶ardh，增加了赤藓糖醇的积累；通过过表达tkl1基因、tal基因、er基因，强化了赤藓糖醇生物合成过程中磷酸戊糖途径非氧化模块的前体转化能力，增加了其积累；进一步地，过表达hk基因、stp1基因、stp2基因，增强糖摄取能力，进一步提升赤藓糖醇产量。

25、综上，为了进一步优化由葡萄糖和木糖混合碳源合成赤藓糖醇的途径，本发明选择野生型解脂耶氏酵母菌株作为出发菌株，通过代谢工程、基因工程的手段，在解脂耶氏酵母中引入新途径、敲除与副产物合成的相关基因，表达与赤藓糖醇合成的相关基因，构建能由葡萄糖和木糖混合碳源更高效发酵合成赤藓糖醇的重组解脂耶氏酵母菌株的方法，得到一株合成赤藓糖醇产量与得率显著提升的菌株yarrowia lipolytica ery6。

26、本发明的有益效果主要体现在：本发明在解脂耶氏酵母中采用多拷贝表达的方式重塑了木糖代谢途径，强化赤藓糖醇生物生成途径中tkl1、tal、er的表达，通过敲除mdh和ardh来减少副产物甘露糖醇和阿拉伯糖醇的生成，通过敲除eyd减少赤藓糖醇转化为其他物质削弱赤藓糖醇的积累，通过强化糖摄取途径基因hk、stp1 和stp2的表达，最后得到可利用葡萄糖和木糖混合碳源的赤藓糖醇高产菌，产量从 50.17g/l提高到195.56g/l。