一株茅台慢生芽孢杆菌及其在大曲发酵中的应用

1.本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一株同时生产2,3,5,6-四甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪的茅台慢生芽孢杆菌及其在大曲发酵中的应用。


背景技术：

2.2,3,5,6-四甲基吡嗪(2,3,5,6-tetramethylpyrazine)是杂环含氮化合物，广泛存在于发酵食品中，具有烘烤、可可、咖啡的香气，常用于烘烤食品、冷饮、乳制品、卷烟等香精香料的调配；2,3,5-三甲基吡嗪(2,3,5-trimethylpyrazine)也是一种杂环含氮化合物，可用于奶油型香精的调香，也可用以调制咖啡、可可、巧克力、花生、芝麻油等香型的香精。目前，在中国白酒尤其是酱香型白酒中也检测到了大量的2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪以及其他吡嗪类物质，其中2,3,5,6-四甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪是白酒尤其是酱香型白酒中重要的香气成分，它们被认为对酱香型白酒的风味起到了重要的贡献。
3.2,3,5-三甲基吡嗪的来源为化学合成，如由1,2-丙二胺与丁二醇或甲基环氧乙烷环化缩合成；而2,3,5,6-四甲基吡嗪的来源主要有直接从植物中提取、化学合成和生物合成三种。其中，直接从植物中提取的方法效率较低，中药材川芎根茎中的四甲基吡嗪含量只有0.075％，且原料难以大规模供应；化学合成所用到的反应过程需要剧烈的反应条件，对机械设备的要求较高，且会有带来副产物的风险；生物合成主要指微生物工程技术，利用菌种筛选诱变技术和发酵工程技术等来生产四甲基吡嗪，具有绿色天然、成本低、条件温和等特点，因此通过生物合成法广泛应用于酿酒领域，特别是通过提高大曲发酵质量，并提高吡嗪类含量，来改善大曲的风味和性能，进而提高白酒的风味。
4.常用的提高大曲发酵质量的方法为强化大曲技术，该技术是运用现代微生物技术来分离和培育大曲功能菌株，在大曲制作过程中通过将功能菌人工接种与自然富集微生物相结合，能够提高功能微生物的生态占位，有利于发挥其代谢功能，从而有效提升大曲的风味和性能。
5.近年来，相关研究学者发现微生物代谢是白酒中2,3,5,6-四甲基吡嗪的一个重要来源。有多项研究使用微生物强化技术提升了酒醅中四甲基吡嗪的产量，所用到的菌种涉及枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等。中国白酒酿造过程中涉及到了大量种类的微生物，目前尚有大量微生物的功能未得到验证，不明确具体哪种微生物对于白酒酿造起重要作用。因此，筛选可以高产2,3,5,6-四甲基吡嗪，且同时可以生产2,3,5-三甲基吡嗪的新菌株，对于生产中丰富和提高白酒风味的新方式具有重要的实际意义。目前现有技术无发现本发明中的慢生芽孢杆菌的新物种的记录，也无采用本发明所述的慢生芽孢杆菌同时生产四甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪的应用。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一株新的茅台慢生芽孢杆菌，该菌株能够同时代谢产生2,3,5,6-四甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪，本发明还提供了该茅台慢生芽孢杆菌在大曲发酵中
的应用；本发明也提供了本茅台慢生芽孢杆菌的培养基和同时代谢产生2,3,5,6-四甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪的方法。
7.本发明为了实现上述目的，采用以下技术方案：
8.本发明提供了一株茅台慢生芽孢杆菌(lentibacillus maotaii)jn110522，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏日期为2022年6月29日，保藏编号为cgmcc no.25214。
9.本茅台慢生芽孢杆菌jn110522隶属慢生芽孢杆菌属(lentibacillus)，其16srrna基因序列全长为1468bp，与其具有最高同源性的菌株为lentibacillus maotaii(genbank登录号：srr17676770)，两者的序列一致性为98.03％，基因序列见seq id no：3。
10.本茅台慢生芽孢杆菌jn110522形态学特征和生理生化特征为：菌落形态为乳白色，不透明，边缘光滑；细胞形态为杆状，长宽约为0.3
×
1.5μm；含有芽孢；含有鞭毛；需氧特征为好氧，生长的温度范围为30-45℃，盐耐受范围为0-20g/l。
11.本发明还提供了上述茅台慢生芽孢杆菌jn110522在生产2,3,5,6-四甲基吡嗪和/或2,3,5-三甲基吡嗪中的应用，或在发酵生产富含2,3,5,6-四甲基吡嗪和/或2,3,5-三甲基吡嗪的产品中的应用。
12.本发明还提供了上述茅台慢生芽孢杆菌jn110522在大曲发酵中改善大曲风味中的应用。
13.改善大曲风味是指使高温大曲的风味更佳突出，具体指酱香、烘培香、花果香、发酵香和异嗅香。
14.进一步地，所述应用的方法为在大曲制备过程的压曲阶段接种权利要求1所述茅台慢生芽孢杆菌jn110522。
15.进一步的，所述应用中大曲制备为高温大曲制备。
16.进一步的，所述应用中茅台慢生芽孢杆菌接种菌液量以重量百分比计为1％-8％，菌液密度为1-10
×
108cfu/ml。
17.优选的，所述应用中茅台慢生芽孢杆菌接种菌液量以重量百分比计为5％，菌液密度为3
×
108cfu/ml。
18.进一步地，所述改善大曲风味为提高大曲中的2,3,5,6-四甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪的含量所获得。
19.本发明还提供了利用上述茅台慢生芽孢杆菌jn110522制备得到的大曲。
20.本发明还提供了利用上述大曲作为糖化发酵剂酿造得到的酒。
21.本发明还提供了一种利用上述茅台慢生芽孢杆菌jn110522同时产生2,3,5,6-四甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪的方法，包括如下步骤：将培养基灭菌后，接种上述茅台慢生芽孢杆菌，在有氧条件下，于35～39℃震荡培养。
22.进一步的，上述方法包括如下步骤：将上述培养基灭菌后，接种茅台慢生芽孢杆菌，在有氧条件下，于37℃恒温摇床上以150r/min的转速培养120～148小时。
23.进一步的，上述方法中培养基包含葡萄糖10-20g/l，胰蛋白胨2-8g/l，酵母粉2-7g/l，柠檬酸铁0.05-0.15g/l，氯化钠10-20g/l，氯化镁2-7g/l，氯化钾0.2-0.7g/l；培养基的ph值为7.0-8.0。
24.优选的，上述方法中培养基包含葡萄糖20g/l，胰蛋白胨5g/l，酵母粉5g/l，柠檬酸铁0.1g/l，氯化钠15g/l，氯化镁5g/l，氯化钾0.5g/l，ph值为7.5。
25.进一步的，上述方法中接种茅台慢生芽孢杆菌的菌液量以重量百分比计为1％-8％，菌液密度为1-10
×
108cfu/ml。
26.优选的，上述方法中接种茅台慢生芽孢杆菌的菌液量以重量百分比计为5％，菌液密度为3
×
108cfu/ml。
27.本发明的有益效果为：
28.本发明从大曲中筛选得到一株具有同时产生2,3,5,6-四甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪能力的新菌株，经鉴定为慢生芽孢杆菌(lentibacillus maotaii)。该菌株2,3,5,6-四甲基吡嗪产量可达到26.2
±
0.8mg/l，2,3,5-三甲基吡嗪的含量可达4.1
±
0.4mg/l。可应用于发酵同时生产2,3,5,6-四甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪；将该菌株应用于在高温大曲发酵过程的压曲阶段可大幅度提高高温大曲中2,3,5,6-四甲基吡嗪的和2,3,5-三甲基吡嗪的含量，使高温大曲的酱香风味更佳突出，可用于制备高性能的大曲，也可以将该大曲应用在白酒酿造，提高白酒风味。利用该菌发酵得到的强化曲其吡嗪类化合物总产量、2,3,5,6-四甲基吡嗪产量和2,3,5-三甲基吡嗪产量和普通茅台慢生芽孢杆菌强化大曲相比，各吡嗪类化合物产量提升了1倍，应用价值很高。
29.本茅台慢生芽孢杆菌jn110522于2022年7月茅台镇的高温大曲上分离得到，本发明提供的一株茅台慢生芽孢杆菌(lentibacillus maotaii)jn110522，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(英文名称为china general microbiological culture collection center，简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏日期为2022年6月29日，保藏编号为cgmcc no.25214。
附图说明
30.图1为本茅台慢生芽孢杆菌jn110522基于16srdna序列的系统进化树。
31.图2为本茅台慢生芽孢杆菌jn110522的扫描电镜图。
32.图3为本茅台慢生芽孢杆菌jn110522的菌落形态图。
具体实施方式
33.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
34.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购；以下实施例中慢生芽孢杆菌于2022年6月茅台镇的高温大曲上分离得到。本发明提供的茅台慢生芽孢杆菌(lentibacillus maotaii)jn110522，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(英文名称为china general microbiological culture collection center，简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏日期为2022年6月29日，保藏编号为cgmcc no.25214。
35.实施例1：慢生芽孢杆菌jn110522的筛选
36.1.实验方法
37.(1)慢生芽孢杆菌的分离和培养
38.于茅台镇在高温大曲中取10g样品装入混有玻璃珠和90ml无菌水的500ml三角瓶中，在30℃摇床上以115r/min振荡30min，然后取菌悬液1ml用无菌生理盐水10倍梯度稀释，以10-3
～10-6
梯度稀释样涂布分离培养基平板，培养基组成如下文a所示，30℃培养7d，根据实际需要在此温度下培养7-10d后均可进行后续步骤；将平板上丰厚的菌落经分离纯化后接入斜面培养基，培养基组成如下文a所示，30℃培养7d，4℃保藏；同时将分离/斜面培养基中单菌落接入液体培养基中，培养基组成如下文b所示，30℃培养7d，得到发酵液。
39.a.分离和斜面培养基的组成均为：蛋白胨5.0g/l，酵母粉1.0g/l，柠檬酸铁0.1g/l，氯化钠19.45g/l，氯化镁5.98g/l，硫酸钠3.24g/l，氯化钙1.8g/l，氯化钾0.55g/l，碳酸钠0.16g/l，磷酸氢二钠0.008g/l，琼脂17g/l。
40.b.液体培养基：蛋白胨5.0g/l，酵母粉1.0g/l，柠檬酸铁0.1g/l，氯化钠19.45g/l，氯化镁5.98g/l，硫酸钠3.24g/l，氯化钙1.8g/l，氯化钾0.55g/l，碳酸钠0.16g/l，磷酸氢二钠0.008g/l。
41.(2)气相质谱联用法筛选发酵液中同时产生2,3,5,6-四甲基吡嗪和2，3，5-三甲基吡嗪的菌株。
42.根据下述气相色谱和质谱的分析条件进行相应设置，然后根据下述方法进行gc-ms测定发酵液中2,3,5,6-四甲基吡嗪和2，3，5-三甲基吡嗪的含量，先对发酵液预处理，再进行gc-ms分析，具体为：
43.1)预处理
44.预处理：吸取6ml发酵液于20ml顶空固相微萃取瓶中，加入2.5g nacl，振荡均匀，加入10μl叔戊醇(8.05g/l)作为内标盖好瓶盖，记录下标号。
45.2)gc-ms分析
46.采用美国agilent公司气相色谱质谱联用仪(型号us1845q002)进行进样；联用仪的萃取头为50/30μmdvb/car on pdms萃取头，气相色谱分析条件如本实施例中
①
所示，质谱的分析条件为本实施例中
②
所示。进样方式为自动进样，吸附时间40min，以500r/min的转速搅拌，解析温度为250℃，解析时间为5min。测定2,3,5,6-四甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪的含量，筛选得到同时含有2,3,5,6-四甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪的发酵液，则该发酵液对应的菌株即为同时代谢产生2,3,5,6-四甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪的菌株。
47.①
气相色谱分析条件为：色谱柱：db-wax毛细管色谱柱，柱长30m，内径0.32mm，液膜厚度0.25μm；载气：氦气he；流速：1.0ml/min，分流比为2：1；柱温：进样口温度保持在250℃，起始气相色谱柱温维持在40℃下3min，以5℃/min升温至120℃，再以10℃/min升温至250℃，保持5min。
48.②
质谱分析条件为：离子源温度250℃；接口温度280℃；电离方式：ei+；电子能量：70ev；扫描质量范围：33～350amu。
49.2.实验结果
50.按照上述gc-ms条件对样品进行分析，得发酵液中的总离子流图，各色谱峰经碎片解析以及查阅nist2.0质谱库进行定性分析，确定产物的化学结构，得到同时产生2,3,5,6-四甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪的菌株，视为筛选成功，将该菌记录为jn110522。
51.实施例2：慢生芽孢杆菌jn110522的分子鉴定
52.1.实验方法
53.对实施例1纯化筛选得到的菌株jn110522，取指数生长期新鲜菌液，离心收集菌体，采用细菌基因组抽提试剂盒提取基因组dna。采用本实施例中下述细菌通用引物p0和p6在
①
反应体系和
②
反应程序
③
下扩增pcr，pcr产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳分离检验，电压约11v/cm，电泳时间20min。得到扩增产物的纯化，扩增产物的纯化按上海生工生物技术公司的胶回收pcr产物纯化试剂盒说明进行，16s rrna基因全长序列测序由上海生工生物技术公司完成。
54.①
通用引物：
55.p0:5
’‑
gag agt ttg atc ctg gct cag-3’，序列见seq id no：1
56.p6:5
’‑
cta cgg cta cct tgt tac ga-3’，序列见seq id no：2
57.②
反应体系(50μl)
58.10
×
buffer(mg2
+
)5.0μl
59.dntps(2.5mm)4.0μl
60.p0(12.5μm)2.0μl
61.p6(12.5μm)2.0μl
62.extaq dna聚合酶(5u/ul)1.0μl
63.template dna 2.0μl
64.ddh2o 34μl
65.③
反应程序(按照如下顺序，从预变形至终延伸完成后，得到pcr产物)
[0066][0067]
2.实验结果
[0068]
菌株jn110522的16s rrna 基因序列全长为1468bp，序列见seq id no：3，在genbank中进行blast比对确定其种属，基于16s rrna基因序列的系统进化树如图1所示，与其具有最高同源性的菌株为lentibacillus maotaii(genbank登录号：srr17676770)；进一步分析两者的序列一致性，两者的序列一致性为98.03％，相差17个碱基。
[0069]
该菌株鉴定为茅台慢生芽孢杆菌(lentibacillus maotaii)jn110522，并于2022年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.25214。
[0070]
实施例3：茅台慢生芽孢杆菌的生理生化特性
[0071]
1.实验方法
[0072]
将茅台慢生芽孢杆菌接种于分离培养基，30℃培养4d后，通过透射电子显微镜和扫描电子显微镜观察该菌株的细胞形态，包括形态大小、芽孢和鞭毛的有无；将茅台慢生芽孢杆菌jn110522接种于液态培养基，通过测定培养液的600nm时的光密度值(od
600
)，检测该菌株的需氧特征、适宜生长的温度范围以及其对盐的耐受范围等生化特性，上述方法参照
主要参照《常见细菌系统鉴定手册》进行(东秀珠,蔡妙英.2001.常见细菌系统鉴定手册.北京：科学出版社)。
[0073]
2.实验结果
[0074]
茅台慢生芽孢杆菌jn110522的细胞形态及生理生化特性如图2-图3和表1所示，可知本茅台慢生芽孢杆菌形态学特征和生理生化特征为：菌落形态为乳白色，不透明，边缘光滑(图3)；细胞形态为杆状，长宽约为0.3
×
1.5μm(图2)；含有芽孢；含有鞭毛；需氧特征为好氧，生长的温度范围为30-45℃，盐耐受范围为0-20g/l。
[0075]
表1茅台慢生芽孢杆菌jn110522的形态学特征和生理生化特性
[0076]
菌种jn110522实验项目特性菌落形态乳白色，不透明，边缘光滑细胞形态(大小，μm)杆状(0.3
×
1.5)芽孢有鞭毛有需氧特性好氧生长温度范围(℃)30-45盐耐受范围(g/l)0-20
[0077]
实施例4同时产生高含量2,3,5,6-四甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪的方法
[0078]
1.实验方法
[0079]
(1)茅台慢生芽孢杆菌jn110522发酵
[0080]
在500毫升的锥形瓶中加入100ml液体培养液，培养基中各组分的含量如下葡萄糖20g/l，胰蛋白胨5g/l，酵母粉5g/l，柠檬酸铁0.1g/l，氯化钠15g/l，氯化镁5g/l，氯化钾0.5g/l，ph值为7.5，将培养基灭菌后，接种上述茅台慢生芽孢杆菌jn110522，菌液的接种量为5％，菌液浓度为3
×
108，于37℃恒温摇床上以150r/min的转速培养130个h，作为实验组。
[0081]
对照组区别为不接菌的液体培养基，等量接种到与上述相同培养基中，培养条件保持一致。
[0082]
(2)发酵液中2,3,5,6-四甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪含量的测定
[0083]
对照组和实验组发酵液中2,3,5,6-四甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪含量测定参照实施例1中的(2)部分气相质谱联用法筛选同时产生2,3,5,6-四甲基吡嗪和2，3，5-三甲基吡嗪的发酵液。
[0084]
2.实验结果
[0085]
采用气相色谱-质谱联用法测定发酵液中2,3,5,6-四甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪的含量，结果如表2所示，实验组发酵液中2,3,5,6-四甲基吡嗪产量可达到26.2
±
0.8mg/l，2,3,5-三甲基吡嗪的含量可达4.1
±
0.4mg/l，与对照组相比，本菌发酵液中吡嗪类物总量和2,3,5,6-四甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪的含量极显著提升。
[0086]
表2发酵液中吡嗪类化合物含量
[0087][0088]
实施例5：使用茅台慢生芽孢杆菌jn110522强化高温大曲的发酵过程
[0089]
1.实验方法
[0090]
(1)制备普通高温大曲和强化曲。
[0091]
普通高温大曲为按照传统高温大曲工艺发酵生产的大曲，细菌群落高丰度成员主要包括：克罗彭施泰特氏菌属、芽孢杆菌属、海洋芽孢杆菌属、枝芽孢杆菌属、糖多孢菌属、scopulibacillus属、葡萄球菌属、片球菌属。
[0092]
强化曲为：在高温大曲生产的压曲制胚阶段，添加茅台慢生芽孢杆菌jn110522。即将筛得的茅台慢生芽孢杆菌jn110522用发酵培养基活化并培养5d至3
×
108cfu/ml，将种子液扩培后直接将菌液接入生曲中，发酵制成强化曲。
[0093]
(2)以曲房中普通高温大曲作为对照组，以强化曲为强化组，其中强化组1使用上述茅台慢生芽孢杆菌jn110522发酵得到的强化曲，强化组2使用和强化组1相同浓度的普通茅台慢生芽孢杆菌(市购)发酵得到的强化曲，对获发酵后样品进行感官分析，感官分析的方法为：参考大曲香气特征的感官评价方法(沈世明,等.酱香高温大曲风味轮的初步构建及其香气特征分析.[j].酿酒科技,2022:10.)，采用5分制对样品的感官强度进行描述，数值越大表示强度越强，分值1、2、3、4、5、6对应的香气强度分别为无、弱、较弱、中、较强、强，香气分为酱香、烘焙香、花果香、发酵香和异嗅香5种。
[0094]
(3)采用实施例1中气相质谱联用法测定大曲中2,3,5,6-四甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪的含量，具体的，按照实施例1中gc-ms条件对样品进行分析，得发酵液中的总离子流图，总离子流图中各色谱峰经碎片解析以及查阅nist2.0质谱库进行定性分析，根据分析确定化合物后，采用校正的峰面积归一化法分析得出各组分吡嗪类化合物、2,3,5,6-四甲基吡嗪含量和2,3,5-三甲基吡嗪的相对含量。
[0095]
2.实验结果
[0096]
(1)普通高温大曲和添加茅台慢生芽孢杆菌发酵的强化大曲感官评价
[0097]
固态发酵曲样香气风味特征如下表3所示。由表3可知，使用茅台慢生芽孢杆菌jn110522强化发酵的大曲感官评分明显高于对照组，强化组高温大曲的酱香、烘焙香、花果香相比对照组高温大曲的香气风味明显提高，本茅台慢生芽孢杆菌jn110522发酵得到的强化曲酱香突出，酱香和烘焙香优于强化组2。
[0098]
表3普通大曲和强化大曲感官评分
[0099]
成品曲酱香烘培香花果香发酵香异嗅香对照组33341强化组165551强化组244751
[0100]
(2)普通大曲和强化大曲中吡嗪类化合物含量
[0101]
采用气相色谱-质谱联用法测定高温大曲中2,3,5,6-四甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪的含量，结果如表4所示，与对照组相比，强化组高温大曲中2,3,5,6-四甲基吡嗪含量从0.07g/100g提高至0.22g/100g，增加了2.1倍；2,3,5-三甲基吡嗪从0.01g/100g提高至0.04g/100g，提高了3倍；吡嗪类化合物总量从0.14g/100g提高至0.46g/100g，提高了2.3倍，本茅台慢生芽孢杆菌jn110522发酵得到的强化曲其吡嗪类化合物总产量、2,3,5,6-四甲基吡嗪产量和2,3,5-三甲基吡嗪产量和普通茅台慢生芽孢杆菌强化大曲相比，各吡嗪类化合物产量提升了1倍。
[0102]
表4添加茅台慢生芽孢杆菌发酵的强化大曲吡嗪化合物含量
[0103][0104]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。