甘氨酰谷氨酰胺锌络合物及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于药物及生物技术领域，特别涉及一种甘氨酰谷氨酰胺锌络合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.谷氨酰胺是肠道上皮细胞和免疫细胞等快速增殖细胞的主要能量来源，是肠粘膜上皮细胞的一种条件性必需氨基酸。已有试验表明谷氨酰胺是肠道粘膜细胞增生和分化的重要能源物质，在断奶仔猪日粮中添加谷氨酰胺可明显改善小肠绒毛的生长发育，减少小肠上皮细胞的损伤。但是由于谷氨酰胺的水溶解度低，在水溶液中不稳定，对热敏感，在溶液中易化为有毒的焦谷氨酸和氨，在热和强碱中裂解为谷氨酸和氨，因此限制了它在肠内的营养和在动物生产中的应用。
3.甘氨酰谷氨酰胺是由甘氨酸和谷氨酰胺组成的二肽，它在水溶液、热中较稳定且进入动物体内（主要在肠粘膜、肾、肝和骨骼肌等细胞表面）被氨基肽酶水解释放出甘氨酸和谷氨酰胺，提高血浆谷氨酰胺浓度，从而发挥生物学作用。
4.张军民.谷氨酰胺对早期断奶仔猪肠道的保护作用及其机理研究.中国农业科学院, 2000, 6(1):1-134。
5.vazquez j a, daniel h, adibi s a. dipeptides in parenteral nutrition: from basic science to clinical applications. nutrition in clinical practice official publication of the american society for parenteral & enteral nutrition, 1993, 8(3):95-105。
6.锌元素参与蛋白质、碳水化合物及脂肪的代谢,对动物的生长发育有重要的作用,它能保护心肌细胞,促进溃疡修复,并与多种慢性病的发生和康复相关。锌是有机体内80多种酶的活性成分,能使伤口很快愈合。
7.常用来补充微量元素锌的锌源包括两类：无机锌和有机锌，无机锌包括氧化锌、硫酸锌等，无机锌最大的优势是价格便宜，无机锌吸收率低，未被动物吸收的无机锌通常会残留在动物体内或被排泄出去造成二次污染，对水体和土壤都存在很大的威胁。
8.有机锌包括络合锌、有机螯合锌、蛋白质锌盐和多矿锌复合体等几种。不同有机锌具有不同的特点。本专利开发了一种不溶性的有机锌，在肠炎治疗药物的应用中具有非常好的效果。


技术实现要素：

9.本发明的甘氨酰谷氨酰胺锌络合物为甘谷二肽与锌的络合物，具有不溶于的水的特点，改变肽在水中的溶解性和代谢过程，具有治疗胃肠道疾病疾病药物或食品中的用途；可在改善、预防或治疗动物或人体的消化系统、胃肠炎或胃肠溃疡的食品及添加剂、保健食品、饲料及饲料添加剂、药物、锌补充剂中的应用。所述技术方案如下：一方面，本发明实施例提供了一种甘氨酰谷氨酰胺锌络合物，包括化合物ⅰ及其水
合物、溶剂合物、聚合物、前体药物、立体异构体、互变异构体、多晶型物、药学上可接受的盐或动物可用盐等。其中，化合物ⅰ由zn及配体c7h
11
n3o4构成，配体c7h
11
n3o4选自：或。
10.其中，化合物ⅰ为zn(c7h
11
n3o4)。相应地，水合物为：[zn（c7h
11
n3o4）]
·
mh2o；其中，m≥0，具体可以为2。聚合物为[zn（c7h
11
n3o4）]n·
kh2o，n为正整数，k≥0。盐为zn（c7h
11
n3o4）的磷酸盐、硝酸盐、盐酸盐、硫酸盐、氢硫酸盐、甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、脂肪酸盐、氨基酸盐、葡萄糖酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐或马来酸盐等以及盐的水合物；相应地，zn(c7h
12
n3o4)x, 其中x为cl、oac等。
[0011]
其中，化合物ⅰ选自l构型和d构型中的一种或两种，优选为l构型，在生物领域应用更加广泛。
[0012]
其中，本专利中的甘氨酰谷氨酰胺锌络合物选自化合物ⅰ的二水合物、盐酸盐或醋酸盐等，具有易于制备、成本低等优势。
[0013]
优选地，甘氨酰谷氨酰胺锌络合物选自化合物ⅰ的二水合物，其溶解度为0.0097g/100g水，其属于不溶物。化合物ⅰ的二水合物具有不溶的特点，但是其在口服时，具有非常明显的药效；相对于可溶性药物，该品可利用其不溶性开发特殊的药品、饲料或添加剂等，如开发缓释药品、水产饲料等。
[0014]
另一方面，本发明实施例提供了前述甘氨酰谷氨酰胺锌络合物的制备方法，方法包括：含锌化合物与甘氨酰谷氨酰胺在溶剂中或固相体系中，加入ph调节剂调节ph至3-12，反应完成后分离纯化得到产物。其中，含锌化合物与甘氨酰谷氨酰胺的摩尔比为3:1-1:3，反应温度为20-100℃，反应时间为2-24小时。其中，甘氨酰谷氨酰胺选自甘氨酰谷氨酰胺及其水合物、溶剂化合物。含锌化合物选自金属锌、锌氧化物、锌氢氧化物、无机锌盐（如氯化锌或硫酸锌金属锌）、有机锌盐（如醋酸锌）和锌的络合物等中的一种或多种。
[0015]
优选地，含锌化合物与甘氨酰谷氨酰胺的摩尔比为1:1-1:2。
[0016]
优选地，反应温度为30-90℃。
[0017]
优选地，反应时间为4-10小时.其中，ph调节剂选自盐酸，硝酸，硼酸，硫酸，碳酸，磷酸，二乙胺，三乙胺，氢氧化钠，氢氧化钾，氢氧化钙，氢氧化铝，氢氧化镁，氢氧化锌，氢氧化铜，氢氧化铁，氢氧化铵，碳酸钠，碳酸钠水合物，碳酸氢钠，碳酸钾，碳酸氢钾，c1-c6的有机羧酸，氨基酸和含c1-c6有机羧酸钠、钾、钙、锌的盐等及其水合物、溶剂化合物、混合物。具体如实施例中的，氢氧化钠。
[0018]
其中，溶剂具体可以为甲醇、乙醇等。
[0019]
其中，纯化方法包括结晶、洗涤、成盐、解离、更改盐形式纯化操作其中的一种或多种。
[0020]
具体地，加入ph调节剂调节ph至5-7时，产物为zn(c7h
12
n3o4)cl或zn(c7h
12
n3o4)oac；加入ph调节剂调节ph至7-12时，产物为zn(c7h
12
n3o4)oh或zn(c7h
12
n3o4)
·
2h2o。
[0021]
又一方面，本发明实施例提供了前述甘氨酰谷氨酰胺锌络合物及其组合物在食品添加剂、保健食品、饲料、饲料添加剂、锌补充剂和药物制备等中的应用。
[0022]
具体地，甘氨酰谷氨酰胺锌络合物及其组合物在治疗或预防炎症药物中的应用。从后续试验可以看出甘氨酰谷氨酰胺锌络合物在小鼠肠道炎上的效果显著。
[0023]
更具体地，甘氨酰谷氨酰胺锌络合物及其组合物在制备改善胃肠道健康产品中的应用。
[0024]
进一步地，药物为注射剂、口服给药、舌下给药、喷雾给药、肛门给药或外用药等。
[0025]
本发明的所述药物组合物包括治疗有效剂量的上述化合物,其立体异构体、水合物、溶剂化物、聚合物、药学上可接受的盐或前药以及药学上可接受的药用载体、稀释剂或赋形剂混合制备成药物制剂，以适合于经口或胃肠外给药。给药方法包括,但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内和经口途径。所述制剂可以通过任何途径施用，例如通过输注或推注，通过经上皮或皮肤粘膜(例如口腔粘膜或直肠等)吸收的途径施用。给药可以是全身的或局部的。经口施用制剂的实例包括固体或液体剂型，包括片剂、丸剂、粒剂、粉剂、胶囊剂、糖浆、乳剂、混悬剂等。所述制剂可通过本领域已知的方法制备，且包含药物制剂领域常规使用的载体、稀释剂或赋形剂。
[0026]
术语和定义除非另有说明，用于本发明申请，包括本技术说明书和权利要求书中记载的术语和定义如下。
[0027]
术语“化合物i”是指金属：配体比为1∶1的甘氨酰谷氨酰胺的锌络合物。
[0028]
术语“制备改善胃肠道健康产品的应用”是指可在改善、预防或治疗动物或人体的消化系统、胃肠炎或胃肠溃疡、胃肠道微生物的食品及添加剂、保健食品、饲料、药物、锌补充剂中的应用。
[0029]
术语“药学上可接受的”，是针对那些化合物、材料、组合物和/或剂型而言，它们在可靠的医学判断的范围之内，适用于与人类和动物的组织接触使用，而没有过多的毒性、刺激性、过敏性反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。
[0030]
术语“药学上可接受的盐”是指药学上可接受的无毒酸或碱的盐，包括无机酸和碱、有机酸和碱的盐。
[0031]
术语“药物组合物”表示一种或多种文本所述化合物或其生理学/药学上可接受的盐或前体药物与其它化学组分的混合物，其它组分例如生理学/药学上可接受的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进化合物对生物体的给药。
[0032]
术语“辅料”是指可药用惰性成分。术语“赋形剂”的种类实例非限制性地包括粘合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、稳定剂、填充剂和稀释剂等。术语“溶剂化物”指本发明化合物或其盐包括以分子间非共价力结合的化学计量或非化学计量的溶剂，当溶剂为水时，则为水合物。
[0033]
术语“前药”是指可以在生理条件下或者通过溶剂解转化为具有生物活性的本发明化合物。本发明的前药通过修饰在该化合物中的功能基团来制备，该修饰可以按常规的操作或者在体内被除去，而得到母体化合物。前药包括本发明化合物中的一个羟基或者氨基连接到任何基团上所形成的化合物，当本发明化合物的前药被施予哺乳动物个体时，前药被割裂而分别形成游离的羟基、游离的氨基。
[0034]
术语“立体异构体”是指由分子中原子在空间上排列方式不同所产生的异构体，包括顺反异构体、对映异构体、非对应异构体和构象异构体。
[0035]
依据原料和方法的选择，本发明化合物可以以可能的异构体中的一个或它们的混合物的形式存在，例如作为纯旋光异构体，或作为异构体混合物，如作为外消旋和非对映异构体混合物，这取决于不对称碳原子的数量。当描述具有光学活性的化合物时，使用前缀d和l或r和s来表示就分子中的手性中心(或多个手性中心)而言分子的绝对构型。前缀d和l或(+)和(
–
)是用于指定化合物所致平面偏振光旋转的符号，其中(
–
)或l表示化合物是左旋的。前缀为(+)或d的化合物是右旋的。就给定的化学结构而言，除了这些立体异构体互为镜像外，这些立体异构体是相同的。具体的立体异构体也可称为对映异构体，并且所述异构体的混合物通常称作对映异构体的混合物。对映异构体的50:50混合物称为外消旋混合物或外消旋体，当在化学反应或方法中没有立体选择性或立体特异性时，可出现所述外消旋混合物或外消旋体。烯烃、c＝n双键等的许多几何异构体也可以存在于本文所述的化合物中，且所有这种稳定的异构体在本发明中均被考虑。
[0036]
当将本发明式中与手性碳的键描写直成线时，应当理解为，手性碳的(r)和(s)两种构型和由此产生的其对映体纯的化合物和混合物两者包括在该通式范围内。本文中消旋体或者对映体纯的化合物的图示法来自maehr，j .chem .ed .1985，62:114-120。除非另有说明，用楔形键和虚线键表示一个立体中心的绝对构型。
[0037]
术语“互变异构体”是指因分子中某一原子在两个位置迅速移动而产生的官能团异构体。本发明化合物可表现出互变异构现象。互变异构的化合物可以存在两种或多种可相互转化的种类。质子移变互变异构体来自两个原子之间共价键合的氢原子的迁移。互变异构体一般以平衡形式存在，尝试分离单一互变异构体时通常产生一种混合物，其理化性质与化合物的混合物是一致的。平衡的位置取决于分子内的化学特性。例如，在很多脂族醛和酮如乙醛中，酮型占优势；而在酚中，烯醇型占优势。本发明包含化合物的所有互变异构形式。
[0038]
本发明的化合物可以在一个或多个构成该化合物的原子上包含非天然比例的原子同位素。例如，可用放射性同位素标记化合物，比如氘(2h)、氚(3h)、碘-125(125i)或c-14(14c)。本发明的化合物的所有同位素组成的变换，无论放射性与否，都包括在本发明的范围之内。
[0039]
针对药物或药理学活性剂而言，术语“有效量”或“治疗有效量”是指无毒的但能达到预期效果的药物或药剂的足够用量。对于本发明中的口服剂型，组合物中一种活性物质的“有效量”是指与该组合物中另一种活性物质联用时为了达到预期效果所需要的用量。有效量的确定因人而异，取决于受体的年龄和一般情况，也取决于具体的活性物质，个案中合适的有效量可以由本领域技术人员根据常规试验确定。
[0040]
术语“活性成分”、“治疗剂”，“活性物质”或“活性剂”是指一种化学实体，它可以有效地治疗目标紊乱、疾病或病症。
[0041]
术语“溶剂合物”用于描述包含本发明化合物和一个或更多个可药用溶剂(例如，乙醇)分子的分子复合物。当具体溶剂是水时，使用术语“水合物”。
[0042]
术语“饲料添加剂”是指在饲料生产加工、使用过程中添加的少量或微量物质，在饲料中用量很少但作用显著。饲料添加剂是现代饲料工业必然使用的原料，对强化基础饲料营养价值，提高动物生产性能，保证动物健康，节省饲料成本，改善畜产品品质等方面有明显的效果；包括单一饲料添加剂，以及多个饲料添加剂组成的混合饲料添加剂。
[0043]
术语“饲料”是所有人饲养的动物的食物的总称，比较狭义地一般饲料主要指的是农业或牧业饲养的动物的食物。饲料包括大豆、豆粕、玉米、鱼粉、氨基酸、杂粕、乳清粉、油脂、肉骨粉、谷物、饲料添加剂等十余个品种的饲料原料。
附图说明
[0044]
图1是甘氨酰谷氨酰胺的红外光谱图；图2是本发明中甘氨酰谷氨酰胺锌络合物的红外光谱图图3是对照组的结肠组织的病理切片图及其放大图；图4是模型组的结肠组织的病理切片图及其放大图；图5是高剂量甘谷锌组的结肠组织的病理切片图及其放大图；图6是低剂量甘谷锌组的结肠组织的病理切片图及其放大图；图7是各组的体重比增加统计图；图8是各组的结肠长增加统计图。
[0045]
图7和图8中：a为对照组；b为模型组；c为 0.0055mol/kg甘谷锌；d为 0.0165mol/kg甘谷锌；e为0.0165mol/kg甘谷+0.0165mol/kg氧化锌。
具体实施方式
[0046]
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
[0047]
实施例1：甘氨酰谷氨酰胺锌络合物的二水合物的制备1l单口瓶中依次加入甘谷66.3克（0.3mol），氧化锌16.2克（0.2mol），加入280克水，搅拌形成悬浮物，使用15wt%氢氧化钠的水溶液调节ph至7.5，加热至70℃保温反应6小时，冷至30℃，过滤，加水洗涤滤饼，70℃干燥，得甘氨酰谷氨酰胺锌络合物45.6克，收率75%。
[0048]
实施例2：甘氨酰谷氨酰胺锌络合物的二水合物的制备烧杯中加入氢氧化钠16克（0.4mol）和甘谷48.6克（0.22mol），加入甲醇300克，搅拌溶解成均一透明溶液。1l单口瓶中依次加入醋酸锌36.6克（0.2mol），加入甲醇500克，另加入水250克搅拌溶解，升温至60℃，将前面配制好的甘谷钠盐的甲醇液滴加进锌盐的醇水溶液中，滴加完成后继续保温反应2小时，降温至20-30℃，过滤，甲醇洗涤滤饼，将滤饼加入500克水常温打浆1小时，过滤，加水洗涤滤饼，70℃干燥，得甘氨酰谷氨酰胺锌络合物45.6克，收率94.9%。
[0049]
实施例3：甘氨酰谷氨酰胺锌络合物的二水合物的制备烧杯中加入氢氧化钠16克（0.4mol）和甘谷44.2克（0.2mol），加入甲醇300克，搅拌溶解成均一透明溶液。1l单口瓶中依次加入醋酸锌38.4克（0.21mol），加入甲醇500克，另加入水250克搅拌溶解，升温至60℃，将前面配制好的甘谷钠盐的甲醇液滴加进锌盐的醇水溶液中，滴加完成后继续保温反应2小时，降温至20-30℃，过滤，甲醇洗涤滤饼，将滤饼加入500克水常温打浆1小时，过滤，加水洗涤滤饼，70℃干燥，得甘氨酰谷氨酰胺锌络合物45.6克，收率97.0%。
[0050]
实施例4：甘氨酰谷氨酰胺锌络合物的醋酸盐的制备
1l单口瓶中依次加入甘谷44.2克（0.2mol），醋酸锌87.8克（0.48mol）加入乙醇400克，另加入水120克，升温至60℃使物料溶解成均一透明溶液，使用15wt%氢氧化钠溶液调ph=6.0，继续保温反应4小时，降温至10℃，过滤，使用1：5（v/v）的水与乙醇的混合液将滤饼常温打浆1小时，过滤，70℃干燥，得甘氨酰谷氨酰胺锌络合物的醋酸盐57.1克，收率87.0%。
[0051]
实施例5：甘氨酰谷氨酰胺锌络合物的盐酸盐的制备1l单口瓶中依次加入甘谷44.2克（0.2mol），无水氯化锌32.6克（0.24mol）加入乙醇400克，另加入水120克，升温至60℃使物料溶解成均一透明溶液，使用15wt%氢氧化钠溶液调ph=5.5，继续保温反应6小时，降温至10℃，过滤，使用3：7（v/v）的水与乙醇的混合液将滤饼常温打浆1小时，过滤，70℃干燥，得甘氨酰谷氨酰胺锌络合物的盐酸盐51.6克，收率85.0%。
[0052]
实施例1-5中各产物的元素分析结果如表1所示：表1参见图1为甘氨酰谷氨酰胺的红外光谱，图2为络合物（具体为甘氨酰谷氨酰胺锌络合物的二水合物）的红外光谱，络合物分子中羧基羟基氢在3334.28的伸缩振动特征吸收消失，说明络合物分子中该羧酸解离成羧基，可能与附近的zn
2+
形成离子键, 甘氨酰谷氨酰胺锌络合物与甘谷相比，其1685.34的酰胺键的伸缩振动的特征峰消失，说明其与锌离子形成配位键。1、甘氨酰谷氨酰胺锌络合物中，-cooh，νo-h ，2500-3000cm-1
的强和宽的特征峰，甘氨酰谷氨酰胺锌络合物中无此特征峰，说明无-cooh，-coo参与络合。2、仲酰胺，1277强吸收酰仲胺特征峰消失，甘谷鋅出现了c-n吸收带（酰胺iii带）619的c-n 酰叔胺特征峰，说明酰仲胺中的n参与络合，形成酰叔胺。
[0053]
实施例6：溶解性试验背景：甘谷水中的溶解度：154mg/ml，易溶于水；硫酸锌水中的溶解度：538mg/ml，易溶于水；蛋氨酸锌，易溶于水。样品：甘氨酰谷氨酰胺锌络合物的二水合物（批号：js001-tm-220817c11）。方法参考《中国药典》2020版。
[0054]
实验方法：1、取甘氨酰谷氨酰胺锌络合物二水合物样品适量，分别置于烧杯中加适量水超声溶解，使溶液达到饱和溶液状态，常温放置1小时。
[0055]
2、吸取甘氨酰谷氨酰胺锌络合物二水合物饱和溶液上清液，取滤液1ml置于100ml量瓶，加水稀释至刻度，摇匀。再取上述溶液2ml，置于10ml量瓶，加水稀释至刻度，摇匀，取溶液适量于进样小瓶待测。
[0056]
3、用外标法计算待测溶液中甘谷的浓度，再换算成甘氨酰谷氨酰胺锌络合物的浓度。
[0057]
结果：甘氨酰谷氨酰胺锌络合物二水合物水中的溶解度：0.097mg/ml，几乎不溶或不溶于水。
[0058]
结论：甘氨酰谷氨酰胺锌络合物，此化合物几乎不溶或不溶于水，与甘氨酰谷氨酰胺、无机锌源硫酸锌，有机锌源蛋氨酸锌具有极大不同的溶解度，后者易溶于水；可以借助在水中不同的溶解度的特性，具有不同的应用前景。
[0059]
实施例7：甘氨酰谷氨酰胺锌络合物的胃肠道炎症有效性实验，本实施例中试验用的甘谷锌为甘氨酰谷氨酰胺锌络合物的二水合物，甘谷为甘氨酰谷氨酰胺。
[0060]
(1)试验方法：我们选取2.5%dss（分子量：5000）对小鼠进行持续性灌水进行化学刺激，对照组相应得使用灭菌水，同时对各组进行药物灌胃，模型组灌相应的生理盐水，我们将老鼠分为5个组，每组8-10只，12d后，统计死亡率，每组测定体重，进行dai测定，采取结肠样品，测定结肠长度并进行石蜡切片，he染色，病理分析。
[0061]
(2)试验材料：2.5%dss（货号d808268)：称取2.5gdss粉末到100ml灭菌水中，混匀。
[0062]
品系：昆明公鼠，选取5w左右得小鼠，27
±
2g，购于维通利华spf级。
[0063]
(3)试验分组：a组为对照组（n=6）；b组为模型组（n=8）；c 组的药物用量为0.0055mol/kg甘谷锌（n=8），为低剂量甘谷锌组；d 组的药物用量为0.0165mol/kg甘谷锌（n=8），为高剂量甘谷锌组；e组的药物用量为0.0165mol/kg甘谷+0.0165mol/kg氧化锌（n=8），为甘谷+氧化锌组。其中，甘谷、氧化锌和甘谷锌均不溶于水。
[0064]
(4)结果测定：隔天称重老鼠，平均体重增加百分比，每组随机挑选5只结肠样本采集，进行结肠病理切片。试验结果进行统计学分析和病理分析：体重增加比和结肠长度结果统计结果如图7和8所示：从图7可以看出：和对照组相比，用2.5%dss进行造模后，模型组与之差异极显著（p《0.001），体重降低很显著；而和模型组相比，2.5%dss造模后，同时给与供试品，从结果得出，低剂量甘谷锌组、高剂量甘谷锌组和甘谷+氧化锌组，三组体重降低与模型组相比降低较少，与模型组差异极为显著（p《0.001）；且高剂量甘谷锌组明显优于相同摩尔用量的甘谷+氧化锌组，低剂量甘谷锌组优于高剂量甘谷+氧化锌组。
[0065]
从图8可以看出：2.5%dss模型后，与对照组相比，长度减少极为显著（p《0.001）；而
与模型组相比，供试组结肠长度较之有一定增加，甘谷锌组（包括c和d）、甘谷+氧化锌组与模型组相比差异极为显著（p《0.001）；且高剂量甘谷锌组明显优于相同摩尔用量的甘谷+氧化锌组，低剂量甘谷锌组水平与高剂量甘谷+氧化锌组相当。
[0066]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。