一种猪伪狂犬病病毒gH与gL亚单位联合疫苗及其制备方法

一种猪伪狂犬病病毒gh与gl亚单位联合疫苗及其制备方法
技术领域
1.本发明属于兽用疫苗和兽用生物制品领域，涉及一种基因工程疫苗，具体涉及一种猪伪狂犬病病毒gh与gl亚单位联合疫苗及其制备方法。


背景技术：

2.伪狂犬病是由伪狂犬病毒(pseudorabies virus，prv)引起的多种家畜和野生动物以发热、奇痒及脑脊髓炎为特征的急性传染病。在prv的诸多感染宿主中，以猪的感染率和发病率最高，病毒可潜伏于三叉神经节或荐神经节造成潜伏感染，使病猪长期带毒，难以根除。该病曾是严重威胁全球养猪业发展的主要传染病之一，然而在欧、美等国家20世纪90年代启动根除计划后，已无prv疫情。在我国，主要使用弱毒活疫苗对prv进行防控，目前我国prv的流行已不再严重，可以进入到净化阶段，而疫病净化的后期，一般主张不再接种具有感染性的活疫苗，而应接种灭活苗或基因工程亚单位疫苗，因此开发针对prv的亚单位疫苗对于疫病的防控和净化具有重大意义。
3.prv属于疱疹病毒科(herpesviridae)疱疹病毒α-亚科成员，为双股dna病毒，基因组大小约150kb，至少含有75个开放阅读框。在prv已鉴定的11种糖蛋白中，gb、gc、gd、gh、gl和gk是病毒复制所必需的糖蛋白。gb、gd和gc抗原被认为是研发prv亚单位疫苗的首选抗原，大多数prv亚单位疫苗的研发以这三者为主，如，cn107485712a使用大肠杆菌耐热肠素(st)与不耐热肠毒素(lt)融合表达gb与gc(gb-stlt-gc)可以有效预防prv对仔猪的感染，并在攻毒后有100％的保护效果；cn114146172a制备的gb、gc和gd纳米抗体具有强大的中和作用，能给仔猪提供100％的保护。但至今尚无可供应用的基因工程亚单位疫苗，因此仍需对此继续加强研究。gh与gl抗原在病毒入侵细胞时具有重要作用，其形成的二聚体对于侵染过程中病毒与细胞的融合具有重要作用。prv在缺失gh与gl后，难以在细胞上产生有效的感染，两者也是prv重要的抗原。且目前国内尚未有使用融合gh与gl抗原形式的亚单位疫苗。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于，针对现有技术的上述不足，提供一种猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗及其制备方法，该疫苗能使动物产生高水平中和抗体，同时又能提供免疫保护。
5.为达上述目的，本发明采用的技术方案是：一种融合蛋白，其包括猪伪狂犬病毒gh蛋白和gl蛋白，编码该蛋白的gh-gl基因序列如seq id no.1所示。其中，gh-gl基因是分别以猪伪狂犬病毒gh和gl基因序列作为n端和c端序列，中间添加eaaak序列的linker，通过重叠延伸pcr扩增得到。
6.本发明同时提供一种猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗，其包括上述的融合蛋白，还包括有免疫佐剂，融合蛋白与免疫佐剂的体积比为1：1，且该疫苗蛋白浓度为30μg/ml，较佳的，免疫佐剂为isa 201vg佐剂。
7.本发明还提供上述猪伪狂犬病毒亚单位疫苗的制备方法，步骤如下：
gl的构建
27.1.1pcr扩增
28.以合成的gh和gl基因为模板，设计的gh-n-fp/gh-c-rp和gl-n-fp/gl-c-rp为扩增引物(扩增引物序列见表1)。gh扩增长度为1965bp，结果见图2；gl扩增长度为463bp，结果见图3；以上述pcr产物1:1混合后作为模板，进行重叠延伸pcr扩增，扩增片段长度为2382bp，结果见图4，使用omega的dna清洁回收试剂盒回收pcr扩增片段。
29.表1gh-gl基因的pcr扩增引物
[0030][0031]
1.2重组质粒的克隆转化
[0032]
1)使用hindⅲ和ecorⅰ限制性内切酶对pks001质粒和回收后的gh-gl基因扩增片段分别进行酶切，37℃酶切3h，酶切体系见下表2，使用omega的dna清洁回收试剂盒，清洁回收酶切后的pks001载体片段和gh-gl基因片段。
[0033]
表2pks001质粒与gh-gl基因酶切体系
[0034][0035]
2)使用dna t4连接酶进行pks001酶切载体和gh-gl基因片段连接，连接体系见下表3。
[0036]
表3gh-gl基因片段与pks001酶切载体的连接体系
[0037][0038]
3)取gh-gl基因片段与pks001载体的连接产物10μl，轻轻加入放置在冰盒上的100μl top10感受态中，轻轻吹打混匀，将该混合物置于冰上30min，42℃水浴中90秒进行热激，然后迅速放回冰浴中，静置3-5min。
[0039]
4)加入500μl不含抗生素的lb培养液，轻轻混匀，37℃、180rpm下震荡培养45min。
[0040]
5)将菌液以5000rpm离心5min以沉淀菌体，留离心管底部约50-100μl的培养液，重悬菌体，然后全部均匀涂布到含氨苄抗生素的lb平板上，37℃培养箱中培养过夜。
[0041]
1.3阳性转化子的pcr鉴定及测序
[0042]
挑取pks001-gh-gl转化平板上的克隆菌落作为模板，以gh-n-fp/gl-c-rp为鉴定引物，进行pcr扩增，将pcr扩增产物进行核酸电泳，分析条带大小，与预期相符合(结合参见图5)，表明pks001-gh-gl克隆菌被成功克隆。
[0043]
1.4重组质粒的提取
[0044]
使用lb培养基，接种pks001-gh-gl重组克隆菌200ml，37℃，180rpm，培养12h后，7000rpm离心4min，收集细菌，使用北京天根生物无内毒素质粒大提试剂盒(dp117)进行质粒的提取。
[0045]
2.融合蛋白gh-gl的表达
[0046]
材料及设备：cho-k1q细胞株、cho cd04培养基、quamono
tm
plus cho培养基、quamono
tm
cho cloning培养基、btx-ecm830电转仪、标准4mm电转杯、细胞培养摇床(37℃，5％co2)、96孔细胞培养板(康宁)、24孔细胞板(康宁)、细胞培养摇瓶(康宁)、细胞计数板、pks001-gh-gl质粒、转染试剂pei max 40k。
[0047]
2.1细胞的复苏及传代
[0048]
从液氮罐中取出cho-k1q细胞，在37℃水中快速解冻。将细胞液转移至15ml离心管中，加入10ml预热的cd04(加入5mm的谷氨酰胺)培养基，1000rpm离心3min，丢弃上清液，使用5ml cd04(加入5mm的谷氨酰胺)培养基重悬，并用细胞计数板进行细胞计数。将冷冻管的全部细胞液转移到装有15ml预热的cd04(加入5mm的谷氨酰胺)培养基的125ml摇瓶中，稀释至所需细胞密度，将摇瓶在含有5％co2，37℃，摇床125rp m进行培养。细胞复苏后培养2～3d处于对数生长中期时传代。在进行其下游的转染表达实验前，对复苏的cho-k1q细胞进行三次传代培养，逐步调整细胞生长活力。
[0049]
2.2细胞转染
[0050]
1)使用cd04(加入5mm的谷氨酰胺)复苏cho-k1q至500ml细胞摇瓶内，待ch o-k1q细胞密度增殖至4
×
106cells/ml。
[0051]
2)取50μg pks001-gh-gl质粒到4mm电转杯中，然后加入4
×
106cells/ml的cho-k1q细胞。
[0052]
3)使用4mm电转杯进行电转实验，电转参数：电压280v、脉冲次数3次、脉冲时长10ms、脉冲间隔时5s。
[0053]
4)电转后将细胞转移至t25细胞培养瓶中，添加5ml cd04(加入5mm的谷氨酰胺)，静置于恒温箱中。
[0054]
2.3msx加压筛选
[0055]
1)静置培养以上转染细胞24h后，将t25细胞培养瓶之中的细胞转移至50ml离心管，180g/min，5min离心收集细胞，弃掉上清，使用cd04培养基(含有25μm，msx)重选细胞，按照1～2
×
104cells/孔，200μl/孔体积，进行96孔板铺板。
[0056]
2)待细胞长至每孔的1/4时，使用elisa方法检测表达量，挑选适量高表达孔的细胞，转移富集到新的96孔板上继续培养，挑选高表达细胞池，进行逐步放大培养。
[0057]
2.4单克隆挑选及增值
[0058]
1)使用cd04培养基(含有25μm，msx)对筛选的最优表达细胞池进行传代和培养，培养细胞池密度至2～3
×
106cells/ml，且细胞的活率大于95％。
[0059]
2)将适量的细胞培养物置于24孔板中，使用cd04培养基，将细胞密度进行倍比稀释至200cells/ml。
[0060]
3)使用quamono
tm cho cloning培养基(按照cho cloning medium a:cho cloni ng medium b＝100：1比例进行配制)，倍比稀释至4cells/ml，视铺板效率决定细胞悬液总体积，用移液器吸取上述细胞液，按照120μl/孔，0.5个细胞/孔的标准进行铺板，每个克隆铺板不少于20块；
[0061]
4)使用96孔扫描显微镜，对所有的克隆孔，进行逐一扫描拍照，筛选单克隆孔并进行标记。
[0062]
5)置入恒温培养箱静置培养，第0d、第1d、第2d、第3d、第7d对单克隆细胞孔，进行扫描观察，拍照记录细胞生长情况。
[0063]
6)第7d时，按照100μl/孔标准，添加cho cloning medium c(2周后，单克隆细胞的汇合度可以达到1/2-1/3)。
[0064]
7)一般为铺板后的14-15d后，待细胞长至每孔的1/4时，挑选细胞生长状态良好、生长旺盛的细胞孔，转移到新的96孔板。
[0065]
8)3d后，使用elisa方法检测表达上清，根据检测结果，挑选适量高表达的细胞池，进行悬浮培养放大，冻存后作为构建的稳定转染细胞种子，其中单克隆4c4株、6e7株、7a2株和8c2株表达水平较高，且7a2株的表达量最高。
[0066]
3.使用摇瓶进行稳定细胞株fed-batch发酵表达
[0067]
使用125ml的细胞摇瓶接种构建的cho-k1q稳定细胞株7a2，逐渐放大至500ml的摇瓶中进行培养，培养基选择cd04培养基。使用cho feed02 supplement补料进行补加营养，进行发酵培养，同时按照6g/l的标准补充葡萄糖。第0d开始取样，绘制细胞生长曲线，第3d开始留样，进行后续统一产量检测，第14d时，细胞活率低于60％时收获。
[0068]
4.表达上清中gh-gl蛋白的western-boling鉴定
[0069]
1)细胞株7a2悬浮发酵第4d，收集了1ml上清液，同时收集未转染的cho-k1q细胞的上清液作为对照。
[0070]
2)取上清样品，各加入10μl的loading buffer和30μl的转染上清，煮沸5min，在提前制备12％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)凝胶内上样，彩虹蛋白mar k加入5μl，转染上清样品每孔加入10μl，120v电泳80min。
[0071]
3)将millipore pvdf(0.45μm)膜进行用甲醇浸泡1min预处理，后放置到转膜液浸泡2min。转膜放置顺序：夹子黑色面+聚乙烯板+滤纸+凝胶+pvdf膜+滤纸+聚乙烯板+夹子白色面。280ma恒流，低温情况下转膜45min。
[0072]
4)用含有5％脱脂奶粉和5％牛血清白蛋白(bsa)的pbs(ph7.4，0.1％tween 20)作为封闭液，4℃封闭过夜。
[0073]
5)使用封闭液稀释his-tag单克隆抗体(mab)至终浓度0.2μg/ml，将pvdf膜置于使用封闭液稀释好的一抗中，在37℃摇床上孵育2h，转速80rpm。
[0074]
6)使用pbs(ph7.4，0.1％tween 20)在侧摆摇床上洗涤pvdf膜，洗涤3次，转速60rpm，每次洗涤10min。
[0075]
7)使用封闭液稀释羊抗鼠igg h&l(hrp)二抗，至工作浓度为0.05～0.2μg/ml，将pvdf膜置于使用封闭液稀释好的二抗中，37℃摇床上缓慢摇动孵育1h，转速为80rpm。
[0076]
8)使用pbs(ph7.4，0.1％tween 20)在侧摆摇床上洗涤pvdf膜，洗涤3次，转速60rpm，每次洗涤10min。
[0077]
9)打开bio-rad化学发光分析系统，配制ecl溶液(millipore)并将曝光液均匀滴加在pvdf膜上，然后再化学发光系统中曝光观察，使用成像系统(bio-rad)收集信号，并使用image lab软件4.0.1分析结果，结合参见图6，被曝光的gh-gl蛋白条带在100～135kda之间，与预期大小相符。
[0078]
5.表达上清中gh-gl蛋白的纯化
[0079]
收集gh-gl细胞表达上清，使用ni focurose 6ff(ted)介质纯化蛋白，步骤如下：
[0080]
1)取5ml介质，用bingding buffer(20mmol/l tris-hcl，50mmol/l nacl，ph 8.0)平衡；
[0081]
2)孵育：将细胞上清与平衡好的介质混合，置于摆床，4℃条件下40r/min孵育2h；
[0082]
3)上柱：将孵育后的介质与表达上清混合物转移到重力柱，流穿上清；
[0083]
4)洗脱：依次用含50mmol/l、100mmol/l、250mmol/l、500mmol/l咪唑浓度的bingding buffer洗脱，1ml/管，最后将收集液进行sds-page检测。电泳结果显示能够纯化获得纯度较高的gh-gl重组蛋白，结果见图7。
[0084]
实施例2疫苗配制
[0085]
以纯化的gh-gl蛋白作为免疫抗原，使用bca蛋白定量试剂盒对纯化的gh-gl蛋白进行定量，蛋白定量后使用0.22μm滤膜过滤，使用无菌的pbs将蛋白稀释至60μg/ml，按照体积比1:1与isa 201vg佐剂充分混匀乳化配制gh-gl疫苗(30μg/ml)，最终进行分装，保存于4℃。
[0086]
实施例3小鼠的prv免疫保护性实验
[0087]
将购买的质量为18～22g的icr小鼠16只随机分为2组。一组小鼠进行后腿肌肉注射0.1ml的gh-gl亚单位疫苗(3μg/只)(gh-gl组)，另一组小鼠肌肉注射相同剂量的佐剂(对照组)。一免后35d加强免疫一次，共免疫2次，并于一免后52d眼球内眦静脉采血，分离血清，并进行中和实验，对照组无小鼠产生中和抗体，gh-gl组血清效价在256-2048之间，最高可达2048，具体结果见表4。
[0088]
表4gh-gl免疫鼠中和抗体效价
[0089][0090]
采血后7d，使用prv-xianga(1.5
×
104tcid50)毒株对小鼠滴鼻攻毒。攻毒后，小鼠一旦发病即会在24h内死亡。从发病到死亡一般经历4个阶段：
①
鼻部红肿、饮欲食欲增加；
②
鼻部瘙痒并挠出血、精神兴奋；
③
瘙痒面积扩大至面部、被毛凌乱；
④
精神沉郁并濒临死亡。对照组小鼠平均发病时间为53h，并全部发病死亡；gh-gl组无小鼠发病，全部存活，免疫
保护率为100％(8/8)。
[0091]
实施例4猪的prv免疫保护性实验
[0092]
购买4周龄prv阴性猪10只随机分为两组，每组各5只。免疫组采用耳后颈部肌肉注射，一免后14d加强免疫，免疫剂量为1ml(30μg/头)，共免疫两次，并于一免后28d前腔静脉采血，并进行中和效价测定。对照组猪无中和抗体产生，免疫组猪prv中和抗体均大于1∶256。免疫后35d使用prv-xianga毒株滴鼻攻毒(1.5
×
106tcid50)，观察7日，gh-gl免疫组所有猪只均未发病、采食和精神状态正常，对照组猪只均发病，均能观察到有明显呼吸症状，最终全部死亡。以上结果表明，gh-gl重组亚单位疫苗具有较好的prv免疫保护效果。
[0093]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。