抗S100A4人源化抗体、用途和方法与流程

本发明涉及分离的抗s100a4人源化抗体分子及其医学用途，并且更特别地涉及分离的抗s100a4人源化抗体分子，其能够抑制s100a4例如在促进慢性炎症、纤维化、肿瘤进展和/或在诱导肿瘤转移方面的生物活性，以及所述分离的抗s100a4人源化抗体分子在治疗纤维化疾病、炎性病症和癌症(特别是转移性癌症)中的用途。

背景技术：

1、纤维化被定义为细胞外基质蛋白的过度沉积。纤维化疾病的早期阶段几乎总是以炎症反应为特征，所述炎症反应的功能是吸引、分化和激活成纤维细胞，所述成纤维细胞进而产生胶原蛋白和其他细胞外基质蛋白。如果这些过程变为慢性，炎症和/或纤维化反应会逐渐破坏生理组织功能，并且可能导致器官受损或衰竭。与慢性炎症和纤维化有关的机制是具有不同临床表现的广泛疾病的潜在驱动因素，除了纯粹的纤维化和炎性病症外，所述广泛疾病还包括动脉粥样硬化、癌症和神经系统变性疾病。在癌症中，患病的组织微环境为恶性细胞的增殖和扩散提供必要的支持机制。炎症和纤维化途径的激活在转移前的小生境的发展中起着重要作用，所述小生境为原发性肿瘤细胞扩散到远处的器官提供必要的条件。

2、s100a4已被鉴定为是参与放大和维持炎症和纤维化途径不适当激活的过程的关键蛋白。s100a4属于具有不同细胞外和细胞内功能的小ca结合蛋白的s100家族(donato，2003)。在生理条件下，s100a4主要位于细胞内，但在细胞应激或损伤时释放到细胞外环境(fei等人，2017)。细胞外s100a4形成与模式识别受体(prr)接合的高阶寡聚物，继而激活多种炎症和纤维化反应(ambartsumian等人，2019；fei等人，2017)。通过与prr的相互作用，s100a4触发从免疫细胞释放炎性介质，刺激从成纤维细胞释放细胞外基质蛋白，并且参与上皮细胞向间充质细胞转化(kalluri&zeisberg，2006；tomcik等人，2015；neidhart等人，2019)。s100a4的过表达是慢性炎症和纤维化的标志。大量研究发现，与健康对照组相比，s100a4在不同的人疾病中水平升高，包括系统性硬化病、间质性肺纤维化、类风湿性关节炎、银屑病和皮肌炎(tomcik等人，2015；zibert等人，2008；等人，2007；cerezo等人，2011；akiyama等人，2020)。

3、采用基于细胞的测定或体内疾病模型的一些研究表明，s100a4因果地参与炎症和纤维化的发病机制(ambartsumian等人，2019)。在成纤维细胞中敲减s100a4防止tgfβ诱导的成纤维细胞激活(tomcik等人，2015)。s100a4的敲减抑制一些动物模型中的纤维化、炎症和癌症扩散，所述动物模型包括博来霉素诱导的皮肤或肺纤维化、紧致皮肤1皮肤纤维化和一些癌症模型(ambartsumian等人，2019；tomcik等人，2015)。

4、大量研究将s100a4活性与肿瘤进展和转移形成联系起来。已经使用癌细胞系、转基因和敲除小鼠模型的体外研究以及对于s100a4活性对癌症患者中转移的预后意义的评估来积累该证据(boye等人，2010；helfman等人，2005；mishra等人，2011)。

5、s100a4活性与刺激癌细胞运动和侵袭、正常和异常增殖、凋亡和分化相关。s100a4参与导致细胞膜和细胞外基质重塑的信号传导途径；细胞骨架动力学的调节、侵袭力的获得和血管生成的诱导(sherbet，2009)。

6、已显示s100a4在某些肿瘤细胞中表达，但更通常地，s100a4是从导致s100a4在肿瘤微环境中积累的某些癌症相关基质细胞中激活和分泌的。此外，已显示转移性微环境含有比原发性肿瘤微环境更多数量的s100a4阳性基质细胞(cabezon等人，2007；grum-schwensen等人，2005；2010；maelandsmo等人，2009；schmidt-hansen等人，2004a)。

7、此外，s100a4已显示在头颈癌和胶质母细胞瘤中维持癌症起始细胞的干性特性和致瘤性(lo等人，2011；chow等人，2017)。因此，能够抑制s100a4生物活性的药物的开发可代表用以调节在一系列人疾病中激活的多种炎症和纤维化途径的有前景的治疗选择。因此，对治疗性抗s100a4抗体，特别是人源化抗s100a4抗体的需求未得到满足，所述抗体特异性靶向s100a4的细胞外致病部分。

8、人源化抗体是来自非人物种的抗体，其蛋白质序列已被修饰以增加其与人类天然产生的抗体变体的相似性。“人源化”的过程通常应用于为向人施用而开发的单克隆抗体(例如，开发为抗癌药物的抗体)。当开发特异性抗体的过程涉及非人免疫系统(如小鼠中的免疫系统)的生成时，人源化可以是必要的。在非人免疫系统中产生的抗体的蛋白质序列与天然存在于人中的同源抗体有部分不同，并且因此当施用于人患者时具有潜在的免疫原性，这可以去除任何治疗益处并且可能在患者中引起不良影响。

技术实现思路

1、本发明提供了具有改进的安全性特征的人源化抗s100a4抗体。

2、诸位发明人已经发现，鼠igg1和人源化igg1抗s100a4抗体引发促炎性细胞因子tnfα的反常增加，而同时阻断s100a4刺激的il-6和il-10的增加。tnfα的增加是通过fcγriia受体簇集和激活引发的。此作用出人意料地依赖于抗s100a4抗体和s100a4蛋白两者，因为不存在s100a4时的抗s100a4抗体和与同种型对照抗体(人igg1或人igg4)组合的s100a4均不会导致fcγriia受体簇集。

3、诸位发明人已经发现，人源化抗s100a4抗体从igg1支架至igg4支架的亚类转换减弱了这种先前未报告的s100a4依赖性fcγriia受体簇集和激活，从而防止了不希望的促炎性细胞因子释放并且改善了所述抗体的安全性特征。与由鼠igg1抗s100a4抗体引发的fcγriia受体簇集和激活相比，人源化igg4抗体引发的fcγriia受体簇集和激活也显著降低。

4、在一个方面，提供了分离的抗体，所述分离的抗体包含：

5、a)重链可变(vh)区，所述重链可变区包含：

6、i.重链互补决定区1(cdr-h1)，所述重链互补决定区1包含seq id no:1或seq idno:4的氨基酸序列或由其组成；

7、ii.重链互补决定区2(cdr-h2)，所述重链互补决定区2包含seq id no:2或seq idno:5的氨基酸序列或由其组成；和

8、iii.重链互补决定区3(cdr-h3)，所述重链互补决定区3包含seq id no:3或seqid no:6的氨基酸序列或由其组成；

9、以及

10、b)轻链可变(vl)区，所述轻链可变区包含：

11、i.cdr-l1，所述cdr-l1包含seq id no:7或seq id no:10的氨基酸序列或由其组成；

12、ii.cdr-l2，所述cdr-l2包含seq id no:8或seq id no:11的氨基酸序列或由其组成；和

13、iii.cdr-l3，所述cdr-l3包含seq id no:9或seq id no:12的氨基酸序列或由其组成；

14、其中，所述vh区包含选自seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq idno:16、seq id no:17和seq id no:13至17中任一个的变体的氨基酸序列或由其组成，其中不是如seq id no:1至6所定义的cdr序列的部分的任一个氨基酸已改变为另一个氨基酸，条件是不多于5个氨基酸已如此改变，例如其中每个氨基酸序列中有5、4、3、2或1个氨基酸已如此改变，

15、和/或其中，所述vl区包含选自seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seqid no:21、seq id no:22和seq id no:18至22中任一个的变体的氨基酸序列或由其组成，其中不是如seq id no:7至12所定义的cdr序列的部分的任一个氨基酸已改变为另一个氨基酸，条件是不多于5个氨基酸已如此改变，例如其中每个氨基酸序列中有5、4、3、2或1个氨基酸已如此改变。

16、在一个方面，提供了分离的抗体，所述分离的抗体包含：

17、i.重链可变(vh)区，所述重链可变区包含选自seq id no:13、seq id no:14、seqid no:15、seq id no:16、seq id no:17和seq id no:13至17中任一个的变体的氨基酸序列或由其组成，其中任一个氨基酸已改变为另一个氨基酸，条件是不多于5个氨基酸已如此改变，例如其中每个氨基酸序列中有5、4、3、2或1个氨基酸已如此改变，

18、以及

19、ii.轻链可变(vl)区，所述轻链可变区包含选自seq id no:18、seq id no:19、seqid no:20、seq id no:21、seq id no:22和seq id no:18至22中任一个的变体的氨基酸序列或由其组成，其中任一个氨基酸已改变为另一个氨基酸，条件是不多于5个氨基酸已如此改变，例如其中每个氨基酸序列中有5、4、3、2或1个氨基酸已如此改变。

20、在一个方面，提供了编码如上文在“分离的抗s100a4抗体分子”章节中所述的抗体的分离的核酸分子。

21、在一个方面，提供了包含如本文所述的编码抗s100a4抗体分子的核酸分子的表达载体。

22、在一个方面，提供了包含如本文所述的分离的核酸分子或表达载体的分离的宿主细胞。

23、在一个方面，提供了产生抗s100a4抗体分子的方法，所述方法包括在其中表达所述抗体的条件下培养如本文所述的宿主细胞。

24、在一个方面，提供了药物组合物，所述药物组合物包含如本文所述的抗体、核酸分子、表达载体和/或宿主细胞，以及药学上可接受的稀释剂、载体和/或赋形剂。

25、在一个方面，还提供了治疗患有s100a4介导的病症的个体的方法，所述方法包括向有需要的个体施用如本文所述的抗体或宿主细胞。

26、在一个方面，提供了用于对个体的s100a4相关病症进行诊断或预后的方法，所述方法包括

27、(a)使来自所述个体的生物样品与能够结合所述样品中存在的s100a4多肽的如本文所述的抗s100a4抗体接触；并且

28、(b)确定所述抗体分子与所述s100a4多肽之间形成的复合物的存在和/或量。