超唾液酸化细胞的制作方法

本发明涉及重组蛋白生产领域。提供了具有增加的唾液酸化活性的宿主细胞。特别地，将唾液酰基转移酶基因、半乳糖基转移酶基因和唾液酸转运体基因引入宿主细胞中，导致重组表达的糖蛋白的超唾液酸化。因此，产生了具有非常大量的唾液酸的蛋白质。

背景技术：

1、中国仓鼠卵巢(cho)细胞系是用于产生治疗性蛋白的最广泛使用的哺乳动物细胞系，并且在抗体和其他治疗性蛋白形式中表现出克/升范围内的高生产率。尤其是重组非抗体治疗性蛋白的表达越来越重要。

2、文献中描述了治疗性蛋白的超唾液酸化导致药物半衰期延长。唾液酸化不足(近末端半乳糖暴露)可能导致蛋白质通过无唾液酸糖蛋白受体介导的途径被更快地清除(bork等人(2009)journal of pharmaceutical sciences[药物科学杂志]98:3499-3508)。有几个实例说明了超唾液酸化如何改善重要生物药物蛋白的整体治疗功效(morell等人(1971)jbc[生物化学杂志]246(5):1461-7；richards等人(2010)mol endocrinol[分子内分泌学]24(1):229-39；datta-mannan等人(2015)drug metab dispos[药物代谢与处置]43:1882-90)。这些包括例如天冬酰胺酶、瘦素、黄体生成素和胆碱酯酶。另外，超唾液酸化可以通过屏蔽抗原位点导致非人治疗性蛋白的免疫原性降低。

3、抗体是治疗性蛋白的一个实例，其活性受唾液酸化程度的影响。抗体的fc片段在每条重链的ch2结构域的天冬酰胺297上具有两个保守n-糖基化位点。哺乳动物细胞中产生的单克隆抗体(mab)具有各种糖形，因为附接的聚糖通过核心岩藻糖基化、平分型n-乙酰葡糖胺添加、半乳糖基化和唾液酸化在不同程度上被修饰。聚糖组成很重要，因为单个单糖残基的存在与否都可以明显影响mab对于不同fcγ受体的亲和力。

4、在fc聚糖上存在的各种单糖中，末端唾液酸特别令人感兴趣。fc聚糖的唾液酸化显著降低了mab对于经典fc受体的亲和力，从而抑制了抗体依赖性细胞毒性(adcc)，这是一种对几种抗癌抗体的功效至关重要的生物学机制。此外，最近对静脉注射免疫球蛋白(ivig)的抗炎特性的研究表明，这种生物活性可能是由于fc聚糖上α2,6-唾液酸残基的存在而赋予的(kaneko等人(2006)science[科学]313:670-3；anthony等人(2008)science[科学]320:373-6)。因此，可以通过产生含有α2,6-连接的唾液酸的重组igg治疗剂来实现增强的抗炎活性。不幸的是，cho细胞缺乏负责附接呈α2,6-构象的唾液酸的酶，并且仅产生具有α2,3-连接的唾液酸的糖蛋白，而且这些糖蛋白的百分比很低。

5、鉴于以上内容，本领域需要提供具有改善的α2,6唾液酸化活性的宿主细胞，尤其是cho细胞。

技术实现思路

1、诸位发明人发现唾液酰基转移酶、半乳糖基转移酶和唾液酸转运体一起在宿主细胞中的过表达会显著增加细胞的唾液酸化活性。尤其是在cho细胞中使用α2,6-唾液酰基转移酶、β1,4-半乳糖基转移酶和cmp-唾液酸转运体，所产生的糖蛋白中α2,6-连接的唾液酸的量显著增加。经由用包含全部三个编码序列的一种载体进行稳定转染引入这些酶的基因提供了一种稳定的宿主细胞系。通过具有在强启动子的控制下的α2,6-唾液酰基转移酶、同时β1,4-半乳糖基转移酶和cmp-唾液酸转运体由中等强度启动子控制的载体获得了尤其良好的结果。

2、如诸位发明人所示，在此类宿主细胞中产生的蛋白质具有显著增加的唾液酸化，尤其是α2,6-连接的唾液酸化的量。诸位发明人可以进一步证明具有对应高水平的唾液酸化的抗体具有降低的免疫原性。抗体的超唾液酸化尤其减少由树突状细胞进行的识别、摄取和呈递，并降低t细胞激活。这转化为抗药物抗体的形成减少，因为更少的t辅助细胞和进而更少的b细胞被激活。因此，治疗性抗体的增加唾液酸化可以减少不良副作用，特别是由患者针对治疗性抗体的免疫应答引起的副作用。

3、鉴于以上内容，在第一方面中，本发明涉及一种哺乳动物细胞，该哺乳动物细胞被工程化以用于增加α-2,6-唾液酰基转移酶、β-1,4-半乳糖基转移酶和cmp-唾液酸转运体的表达。在某些实施例中，该哺乳动物细胞包含

4、(i)编码α-2,6-唾液酰基转移酶的外源核酸；

5、(ii)编码β-1,4-半乳糖基转移酶的外源核酸；以及

6、(iii)编码cmp-唾液酸转运体的外源核酸。

7、在另外的实施例中，该哺乳动物细胞的编码α-2,6-唾液酰基转移酶、β-1,4-半乳糖基转移酶和cmp-唾液酸转运体的内源基因被工程化以用于增加表达。

8、在第二方面中，本发明提供了一种用于产生糖基化多肽的方法，该方法包括以下步骤：

9、(a)提供根据本发明的第一方面的哺乳动物细胞，该哺乳动物细胞进一步包含用于糖基化多肽的重组表达的表达盒；

10、(b)在允许表达所述糖基化多肽的条件下，在细胞培养物中培养该哺乳动物细胞；

11、(c)从该细胞培养物中获得所述糖基化多肽；以及

12、(d)任选地加工该糖基化多肽。

13、在第二方面的某些实施例中，培养该哺乳动物细胞期间的培养条件不包括温度变化。

14、在另外的实施例中，该方法用于产生抗体或其片段、衍生物或移植物，尤其是具有降低的免疫原性的抗体或其片段、衍生物或移植物(engraft)。

15、在第三方面中，本发明提供了一种载体核酸或一种至少两种载体核酸的组合，该载体核酸或该至少两种载体核酸的组合包含

16、(i)α-2,6-唾液酰基转移酶的编码序列；

17、(ii)β-1,4-半乳糖基转移酶的编码序列；以及

18、(iii)cmp-唾液酸转运体的编码序列。

19、在第四方面中，本发明提供了根据本发明的第三方面的载体核酸或至少两种载体核酸的组合用于转染哺乳动物细胞的用途。本发明还提供了一种用于增加α-2,6-唾液酰基转移酶、β-1,4-半乳糖基转移酶和cmp-唾液酸转运体在哺乳动物细胞中的表达的方法，该方法包括用根据本发明的第三方面的载体核酸或至少两种载体核酸的组合转染该哺乳动物细胞的步骤，和/或对该哺乳动物细胞的编码α-2,6-唾液酰基转移酶、β-1,4-半乳糖基转移酶和cmp-唾液酸转运体的内源基因进行工程化以用于增加表达的步骤。

20、在第五方面中，本发明提供了一种用于通过增加其糖基化模式中的唾液酸化量来降低抗体或其片段、衍生物或移植物的免疫原性的方法。特别地，该抗体或其片段、衍生物或移植物是治疗性抗体或其片段、衍生物或移植物。

21、从以下描述和所附权利要求，本发明的其他目的、特征、优点和方面对于本领域的技术人员而言将变得显而易见。然而，应理解，以下描述、所附权利要求和指示本技术优选实施例的具体实例仅以说明的方式给出。通过阅读以下内容，在所披露发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域的技术人员而言将变得显而易见。

22、定义

23、如本文所用，以下表述通常意在优选地具有如下文所述的含义，除非在使用它们的上下文中另有指示。

24、除了其字面含义之外，如本文所用的表述“包含(comprise)”还包括并且具体是指表述“基本上由……组成”和“由……组成”。因此，表述“包含”是指其中“包含”具体列出的元素的主题不包含另外元素的实施例，以及其中“包含”具体列出的元素的主题可能和/或确实涵盖另外元素的实施例。同样，表述“具有”应理解为表述“包含”，还包括并且具体是指表述“基本上由……组成”和“由……组成”。在可能的情况下，术语“基本上由……组成”特别地是指其中除了主题基本上由其组成的具体列出的元素外主题还包含20％或更少、特别是15％或更少、10％或更少、或尤其是5％或更少的另外元素的实施例。

25、术语“核酸”包括单链和双链核酸、核糖核酸以及脱氧核糖核酸。其可能包含天然存在的以及合成的核苷酸，并且可以经过天然修饰或以合成方法修饰(例如，通过甲基化、5'-和/或3'-封端)。在特别的实施例中，核酸是指双链脱氧核糖核酸。

26、术语“表达盒”特别地是指能够启动和调节其中引入的编码核酸序列的表达的核酸构建体。表达盒可以包含启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mrna翻译的其他控制元件。表达盒的确切结构可能根据物种或细胞类型而变化，但通常包含分别涉及转录和翻译起始的5'-未转录以及5'-和3'-未翻译序列，诸如tata盒、封端序列、caat序列等。更特别地，5'-未转录表达控制序列包含启动子区，该启动子区包含用于可操作地连接的核酸的转录控制的启动子序列。表达盒还可以包含增强子序列或上游激活因子序列。

27、根据本发明，术语“启动子”是指位于有待表达的核酸序列上游(5')的核酸序列，并通过提供rna-聚合酶的识别和结合位点来控制序列的表达。“启动子”可以包含参与基因转录调节的另外因子的另外识别和结合位点。启动子可以控制原核或真核基因的转录。此外，启动子可以是“诱导型的”，即响应于诱导剂而启动转录，或者如果转录不受诱导剂控制，可以是“组成型的”。如果不存在诱导剂，则在诱导型启动子控制下的基因不表达或仅以很小程度表达。在存在诱导剂的情况下，基因开启或转录水平增加。这通常由特异性转录因子的结合来介导。

28、本文中，术语“载体”以其最一般的含义使用，并且包含核酸的任何中间媒介物，该媒介物能够将所述核酸例如引入到原核和/或真核细胞中，并且在适当时整合到基因组中。此类载体优选地在细胞中复制和/或表达。载体包含质粒、噬菌粒、噬菌体或病毒基因组。如本文所用，术语“质粒”通常涉及染色体外遗传物质的构建体，通常为环状dna双链体，其可以不依赖染色体dna进行复制。根据本发明的载体可以以环状或线性化形式存在。

29、术语“5'”和“3'”惯例用于描述与遗传元件位置和/或事件方向(5'至3')相关的核酸序列特征，例如像在5’至3’方向上通过rna聚合酶进行转录或通过核糖体进行翻译。同义词为上游(5’)和下游(3’)。按照惯例，dna序列、基因图谱、载体卡和rna序列从左向右以5’至3’绘制，或用箭头指示5’至3’方向，其中箭头指向3’方向。因此，当遵循此惯例时，5’(上游)指示朝向左手侧定位的遗传元件，并且3’(下游)指示朝向右手侧定位的遗传元件。

30、“多肽”是指包含通过一个或多个肽键连接在一起的氨基酸聚合物的分子。多肽包括任何长度的多肽，包括蛋白质(例如，具有超过50个氨基酸)和肽(例如，具有2-49个氨基酸)。多肽包括具有任何活性或生物活性的蛋白质和/或肽。多肽可以是药学上或治疗上的活性化合物，或用于测定等的研究工具。合适实例概述如下。

31、如果靶氨基酸序列与参考氨基酸序列在其整个长度上具有至少75％，更优选地至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性或同一性，则靶氨基酸序列“衍生”自或“对应”于参考氨基酸序列。在特定的实施例中，“衍生”自或“对应”于参考氨基酸序列的靶氨基酸序列在其整个长度上与参考氨基酸序列是100％同源的，或特别地是100％相同的。类似地，如果靶核苷酸序列与参考核苷酸序列在其整个长度上具有至少75％，更优选地至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性，则靶核苷酸序列“衍生”自或“对应”于参考核苷酸序列。在特定的实施例中，“衍生”自或“对应”于参考核苷酸序列的靶核苷酸序列在其整个长度上与参考氨基酸序列具有100％同一性。优选地根据本发明在参考序列的整个长度上确定氨基酸序列或核苷酸序列的“同源性”或“同一性”。

32、术语“抗体”特别地是指包含由二硫键连接的至少两条重链和两条轻链的蛋白质。每条重链由重链可变区(vh)和重链恒定区(ch)构成。每条轻链由轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)构成。重链恒定区包含三个或(在igm或ige型抗体的情况下)四个重链恒定结构域(ch1、ch2、ch3和ch4)，其中第一恒定结构域ch1与可变区相邻，并且可以通过铰链区与第二恒定结构域ch2连接。轻链恒定区仅由一个恒定结构域组成。可变区可以进一步细分为称为互补决定区(cdr)的高变区，其间穿插有称为框架区(fr)的更保守区域，其中每个可变区包含三个cdr和四个fr。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。重链恒定区可以是任何类型，诸如γ、δ、α、μ或ε型重链。优选地，抗体的重链是γ链。此外，轻链恒定区还可以是任何类型，诸如κ或λ型轻链。优选地，抗体的轻链是κ链。术语“γ(δ、α、μ或ε)型重链”和“κ(λ)型轻链”分别是指抗体重链或抗体轻链，它们具有衍生自天然存在的重链或轻链恒定区氨基酸序列的恒定区氨基酸序列，尤其是人重链或轻链恒定区氨基酸序列。抗体可以是例如人源化、人或嵌合抗体。

33、如本文所用，术语“抗体”还包括所述抗体的片段、衍生物和移植物。抗体的“片段或衍生物”特别地是衍生自所述抗体且能够结合与该抗体相同的抗原(特别是结合与该抗体相同的表位)的蛋白质或糖蛋白。在另外的实施例中，抗体的“片段、衍生物或移植物”尤其是指包含抗体的一个或多个fc区并且可能包含或可能不包含抗原结合区的多肽或蛋白质。因此，本文中抗体的片段、衍生物或移植物通常是指功能性片段、衍生物或移植物，其中抗体的功能是结合抗原和/或与fc受体相互作用。抗体的“移植物”尤其是指其中异源多肽被引入其中或(部分)替换该抗体的cdr序列的所述抗体。示例性抗体移植物在us 2017/0158747a1中进行了描述。在特别的实施例中，抗体或其片段、衍生物或移植物包含具有n-糖基化位点的ch2结构域，该n-糖基化位点包括在根据kabat编号的抗体重链的氨基酸位置297处的天冬酰胺残基。

34、术语“糖基化多肽”是指携带附接到其多肽骨架上的碳水化合物链的多肽。碳水化合物链特别地通过细胞糖基化机制附接到多肽上。碳水化合物链尤其附接到多肽的糖基化位点上。术语“糖基化位点”特别地是指可以被天然糖基化酶(特别是糖基转移酶，优选地天然存在的哺乳动物糖基转移酶)特异性识别和糖基化的氨基酸序列。糖基化多肽尤其是指携带n-和/或o-糖基化的多肽。n-糖基化是指碳水化合物链附接到具有氨基酸序列asn-xaa-ser/thr/cys的n-糖基化位点处的天冬酰胺残基上，其中xaa是任何氨基酸残基。优选地，xaa不是pro。o-糖基化是指碳水化合物链附接到丝氨酸、酪氨酸、羟基-赖氨酸或羟基-脯氨酸残基上。在特别的实施例中，术语“糖基化多肽”是指携带附接到n-糖基化位点上的碳水化合物链的多肽。

35、在某些实施例中，如本文所用，术语“多肽”是指相同种类的多肽的群体。特别地，多肽群体的所有多肽都表现出用于定义多肽的特征。在某些实施例中，多肽群体中的所有多肽具有相同的氨基酸序列。参考特定种类的多肽，诸如抗体，特别地是指此抗体的群体。

36、术语“唾液酸”特别地是指神经氨酸的任何n-或o-取代衍生物。它可以是指5-n-乙酰神经氨酸和5-n-羟乙酰神经氨酸，但优选地仅是指5-n-乙酰神经氨酸。唾液酸，特别是5-n-乙酰神经氨酸，优选地经由α2,3-键或α2,6-键附接到碳水化合物链上。

37、术语“n-糖基化”是指所有聚糖附接到蛋白质的多肽链的天冬酰胺残基上。这些天冬酰胺残基通常是具有氨基酸序列asn–xaa–ser/thr的n-糖基化位点的一部分，其中xaa可以是除脯氨酸以外的任何氨基酸。同样，“n-聚糖”是附接到多肽链的天冬酰胺残基上的聚糖。术语“聚糖”、“聚糖结构”、“碳水化合物”、“碳水化合物链”和“碳水化合物结构”通常在本文中以同义使用。n-糖通常具有由两个n-乙酰葡糖胺(glcnac)残基和三个甘露糖残基组成的共同核心结构，其结构为manα1,6-(manα1,3-)manβ1,4-glcnacβ1,4-glcnacβ1-asn，其中asn是多肽链的天冬酰胺残基。n-聚糖被分为三种不同的类型，即复合型聚糖、杂交型聚糖和高甘露糖型聚糖。

38、根据本发明，多肽的“唾液酸化量”是指包含至少一个唾液酸残基并且附接到多肽群体中的多肽分子上的聚糖的量。考虑携带唾液酸残基并附接到组合物中感兴趣的多肽上的所有聚糖的数量。在特别的实施例中，唾液酸化量是指唾液酸化的相对量。唾液酸化的相对量是指基于附接到多肽群体中的多肽分子上的所有聚糖的总数，附接到多肽群体中被唾液酸化的多肽分子上的聚糖的百分比或百分比范围。

39、本文提及的细胞特别地是宿主细胞。根据本发明，术语“宿主细胞”涉及可以用外源核酸转化或转染的任何细胞。特别优选哺乳动物细胞，诸如人、小鼠、仓鼠、猪、山羊、或灵长类动物的细胞。细胞可以衍生自多种组织类型，并包含原代细胞和细胞系。核酸可以以单个拷贝或两个或更多个拷贝的形式存在于宿主细胞中，并且在一个实施例中在宿主细胞中表达。在某些实施例中，如本文所用，术语“细胞”是指相同种类的细胞的群体。特别地，细胞群体的所有细胞都表现出用于定义细胞的特征，例如，它们被工程化以用于增加某个基因的表达和/或它们产生感兴趣的多肽。

40、如本文所用，“工程化”细胞是指有意进行改变以获得不同特性的细胞。细胞的工程化特别地导致细胞中一个或多个基因的表达改变。尤其对细胞的基因组进行改变，例如通过将另外的遗传信息作为额外的质粒或作为细胞中已经存在的染色体的一部分引入细胞中，和/或通过删除细胞中的部分遗传信息。此外，基因的表达改变也可以通过控制基因的转录和/或翻译来实现，例如通过改变染色体结构、dna甲基化、密码子使用、启动子、转录激活因子和/或阻遏因子或通过引入干扰核酸诸如sirna。在特别的实施例中，工程化是指基因工程化。

41、术语“药物组合物”或“药物配制品”特别地是指适于施用于人或动物的组合物，即，含有药学上可接受的组分的组合物。优选地，药物组合物包含活性化合物或者其盐或药物前体，以及载剂、稀释剂或药物赋形剂，诸如缓冲液、防腐剂和张力调节剂。

42、本文给出的数字优选地理解为近似数字。特别地，数字优选地可以高和/或低多达10％，特别地高和/或低多达9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。

43、本文所述的数字范围包括定义范围的数字。本文提供的标题不是对本发明的各个方面或实施例的限制，这些方面或实施例可以通过参考整个说明书来阅读。根据一个实施例，本文在方法的情况下描述为包含某些步骤的主题或在组合物的情况下描述为包含某些成分的主题是指由相应步骤或成分组成的主题。优选地选择并组合本文所述的优选方面和实施例，并且由优选实施例的相应组合产生的特定主题也属于本披露内容。