心肌细胞和组合物以及用于生产它们的方法

背景技术：

1、由人诱导型多能干细胞(ipsc)生产心肌细胞的当前分化方案能够产生如通过心肌肌钙蛋白t的表达确定的高纯心肌细胞群体。然而，这些心肌细胞仍然不成熟，更接近类似于胎儿状态，与成人心肌细胞相比，最大收缩力较低、上行速度较慢并且线粒体功能不成熟。ipsc衍生心肌细胞的不成熟可能是心肌细胞细胞疗法临床转化用于心脏疾病的重大障碍，因为不成熟的心肌细胞展示出自律性或起搏器样活动，这导致当被递送至成体动物模型时可能出现危及生命的室性心律失常，以及具有组织性较差的肌节结构，从而无法产生足够的收缩力。在发育过程中，心肌细胞经历从胎儿时期的增殖状态向出生后更加成熟但静止的状态的转变。需要导致心肌细胞进入静止状态并且由此增强分化期间的心肌细胞成熟的改进方法。

技术实现思路

1、对用于产生用于细胞疗法和筛查等用途的成熟心肌细胞的方法或方案存在需求。在一些实施例中，通过使心肌细胞进入静止状态，可以增强心肌细胞的成熟。

2、本文公开了从不成熟心肌细胞生产成熟心肌细胞的方法。该方法包括使不成熟心肌细胞与至少一种心肌细胞成熟因子在培养中，例如在二维或三维培养(诸如脉冲培养或稳态培养)中接触。

3、本文还公开了诱导心肌细胞静止的方法。该方法包括使衰老心肌细胞与心肌细胞成熟因子在培养中(例如，二维或三维培养，诸如脉冲或稳态培养)中接触，从而诱导衰老心肌细胞转变为静止心肌细胞。

4、在一些实施方案中，该至少一种心肌细胞成熟因子包括p53上调剂。在一些实施方案中，该至少一种心肌细胞成熟因子包括mtor抑制剂。在一些实施方案中，该至少一种心肌细胞成熟因子包括p53上调剂和/或mtor抑制剂。在一些实施方案中，该至少一种心肌细胞成熟因子包括衰老清除剂(senolytic)、mdm2抑制剂和/或mtor抑制剂。在一些实施方案中，该至少一种心肌细胞成熟因子选自由衰老清除剂、mdm2抑制剂、mtor抑制剂以及它们的组合组成的组。在一些实施方案中，该至少一种心肌细胞成熟因子选自由nutlin-3a、槲皮素、torin1以及它们的组合组成的组。在一些实施方案中，该至少一种心肌细胞成熟因子选自由nutlin-3a、槲皮素以及它们的组合组成的组。在一些实施方案中，该至少一种心肌细胞成熟因子包括nutlin-3a和/或槲皮素。在一些实施方案中，该至少一种心肌细胞成熟因子包括nutlin-3a、槲皮素和/或torin1。在一些实施方案中，经由脉冲处理或经由连续处理使该至少一种心肌细胞成熟因子与不成熟心肌细胞接触。

5、在一些实施方案中，不成熟心肌细胞衍生自ips细胞、es细胞、t细胞或成纤维细胞。在一些实施方案中，不成熟心肌细胞类似于胎儿心肌细胞。

6、在一些实施方案中，在不成熟心肌细胞开始跳动后，使该不成熟心肌细胞与该至少一种心肌细胞成熟因子接触。在一些实施方案中，在不成熟心肌细胞开始跳动后，使该不成熟心肌细胞与该至少一种心肌细胞成熟因子接触1至3天。

7、在一些实施方案中，成熟心肌细胞如与不成熟心肌细胞相比表现出一种或多种成熟基因的表达增加。在一些实施方案中，该一种或多种成熟基因选自由以下组成的组：tnni3、tnnt2、myh6、myh7、nppb、hcn4、cacna1c、serca2a、ppargc1、kcnj2、rest、ryr和scn5a。在一些实施方案中，成熟心肌细胞如与不成熟心肌细胞相比表现出一种或多种肌节蛋白的表达增加。在一些实施方案中，该一种或多种肌节蛋白选自由以下组成的组：tnnt2、tnni3、myh6和myh7。在一些实施方案中，成熟心肌细胞如与不成熟心肌细胞相比表现出一种或多种离子通道基因的表达增加。在一些实施方案中，该一种或多种离子通道基因选自由以下组成的组：kcnj2、hcn4、scn5a、ryr2、cacna1c和serca2a。在一些实施方案中，成熟心肌细胞如与不成熟心肌细胞相比表现出rest和/或gata4的表达增加。

8、在一些实施方案中，成熟心肌细胞如与不成熟心肌细胞相比表现出博动率降低。在一些实施方案中，成熟心肌细胞表现出≤-70mv的静息膜电位、<40次/分的自发博动率和/或>200伏/秒的上行速度。在一些实施方案中，成熟心肌细胞是电、收缩性和/或代谢成熟的心肌细胞。

9、本文还公开了通过本文公开的方法中的任何方法生产的非天然存在的心肌细胞。

10、在一些实施方案中，非天然存在的心肌细胞如与不成熟心肌细胞相比表现出一种或多种成熟基因的表达增加。在一些实施方案中，该一种或多种成熟基因选自由以下组成的组：tnni3、tnnt2、myh6、myh7、nppb、hcn4、cacna1c、serca2a、ppargc1、kcnj2、rest、ryr和scn5a。在一些实施方案中，非天然存在的心肌细胞如与不成熟心肌细胞相比表现出一种或多种肌节蛋白的表达增加。在一些实施方案中，该一种或多种肌节蛋白选自由以下组成的组：tnnt2、tnni3、myh6和myh7。在一些实施方案中，非天然存在的心肌细胞如与不成熟心肌细胞相比表现出一种或多种离子通道基因的表达增加。在一些实施方案中，该一种或多种离子通道基因选自由以下组成的组：kcnj2、hcn4、scn5a、ryr2、cacna1c和serca2a。在一些实施方案中，非天然存在的心肌细胞表现出tnnt2、tnni3、kcnj2和p53中的一者或多者的表达增加。

11、在一些实施方案中，非天然存在的心肌细胞如与不成熟心肌细胞相比表现出博动率降低。在一些实施方案中，非天然存在的心肌细胞表现出≤-70mv的静息膜电位、<40次/分的自发博动率和/或>200伏/秒的上行速度。在一些实施方案中，非天然存在的心肌细胞是电、收缩性和/或代谢成熟心肌细胞。

12、本文公开了治疗方法，其包括向有此需要的受试者施用包含本文所述的非天然存在的心肌细胞的组合物。本文还公开了治疗方法，其包括向有此需要的受试者施用使用一种或多种本文所述的非天然存在的心肌细胞的经分离群体生产的药物组合物。本文还公开了组合物在制造用于治疗心脏疾患的药物中的用途，其中该治疗包括向有需要的受试者施用该药物，其中该组合物包含至少一种本文所述的非天然存在的心肌细胞。

13、在一些实施方案中，受试者患有室性心律失常、心脏收缩功能降低、慢性心力衰竭、先天性心脏疾病或其他心脏疾病或者处于患上这些疾病的风险中。

14、本文还公开了从不成熟心肌细胞生产成熟心肌细胞的方法。这些方法包括使不成熟心肌细胞与至少一种选自由nutlin-3a、槲皮素、torin1以及它们的组合组成的组的心肌细胞成熟因子接触。

15、在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子选自由nutlin-3a、槲皮素以及它们的组合组成的组。在一些实施方案中，成熟心肌细胞是在三维培养中生产的。在一些实施方案中，成熟心肌细胞是在二维培养中生产的。在一些实施方案中，经由脉冲处理使不成熟心肌细胞与该至少一种心肌细胞成熟因子接触。在一些实施方案中，经由连续处理使不成熟心肌细胞与该至少一种心肌细胞成熟因子接触。

16、除非另外指示，否则本发明的实施将通常采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组核酸(例如dna)技术、免疫学以及rna干扰(rnai)的在本领域的技能的范围内的常规技术。这些技术中的某些的非限制性描述见于以下出版物中：ausubel,f.等人(编),current protocols in molecular biology,current protocolsin immunology,current protocols in protein science,以及current protocols incell biology,全都由john wiley&sons,n.y.出版,版本截至2008年12月；sambrook,russell和sambrook,molecular cloning:a laboratory manual,第3版,cold springharbor laboratory press,cold spring harbor,2001；harlow,e.和lane,d.,antibodies–a laboratory manual,cold spring harbor laboratory press,coldspring harbor,1988；freshney,r.i.,“culture of animal cells,a manual of basictechnique”,第5版,john wiley&sons,hoboken,nj,2005。关于治疗剂和人疾病的非限制性信息见于goodman and gilman’s the pharmacological basis of therapeutics,第11版,mcgraw hill,2005，katzung,b.(编)basic and clinical pharmacology,mcgraw-hill/appleton&lange；第10版(2006)或第11版(2009年7月)中。关于基因和遗传病症的非限制性信息见于mckusick,v.a.:mendelian inheritance in man.a catalog of humangenes and genetic disorders.baltimore:johns hopkins university press,1998(第12版)或更新近在线数据库：online mendelian inheritance in man,omimtm.mckusick-nathans institute of genetic medicine,johns hopkins university(baltimore,md)和national center for biotechnology information,national library of medicine(bethesda,md),截至2010年5月1日，万维网url：ncbi.nlm.nih.gov/omim/中，以及作为动物物种(除人和小鼠以外)中的基因、遗传病症和性状的数据库的在omia.angis.org.au/contact.shtml处的online mendelian inheritance in animals(omia)中。本文提及的所有专利、专利申请和其他出版物(例如科学文章、书籍、网站和数据库)都通过引用以它们的整体并入本文。在说明书与任何并入参考文献之间起冲突的情况下，应以说明书(包括其任何修正，该修正可基于并入的参考文献)为准。除非另外指示，否则在本文中使用术语的标准本领域接受含义。在本文中使用各种术语的标准缩写。