抗MSLN抗体、方法及应用与流程

本发明涉及生物医药领域，具体是抗msln抗体、方法及应用。

背景技术：

1、间皮素(mesothelin，msln)是一种分子量约为40kd的细胞表面糖蛋白。研究表明，该蛋白在正常情况下表达仅限于间皮细胞、心包膜、腹膜和胸膜腔，且表达量低，在其它组织和细胞中基本不表达，然而在胰腺癌、恶性胸膜间皮瘤、卵巢癌和肺癌等多种肿瘤类型中表达显著。msln的异常表达对肿瘤细胞的侵袭、增殖和转移等特性都起到了一定的促进作用。msln在正常细胞中不表达和低表达的情况决定了其成为靶向治疗肿瘤的特异性靶点的潜在优势。临床结果表明，msln的表达与肿瘤严重程度和生存率相关。针对msln这种表达特异并且和临床症状相关联的靶点，可开发针对msln的特异性单克隆抗体应用于adc靶向药物、car t细胞药物或双抗等药物。

2、但是，目前大多数msln药物还处于临床试验阶段或者研发阶段，还没有靶向msln的抗体药物上市，因此，有必要进一步开发具有更高活性、更高亲和力和治疗效果的msln抗体，以进行相关疾病的治疗研究和应用。

技术实现思路

1、本发明提供了高活性、更高亲和力的msln抗体及应用，以及可以更佳高效获得抗体的方法，为疾病的研究提供了新方法。

2、为达此目的，本发明提供如下的技术方案：

3、本发明的第一个方面，提供了一种抗msln抗体，其特征在于，包括抗体16c12和抗体19h3；

4、其中，抗体16c12的可变区包含三个cdr的重链高变区和三个cdr的轻链高变区；

5、重链高变区cdr1的氨基酸序列为seq id no.1；

6、重链高变区cdr2的氨基酸序列为seq id no.2；

7、重链高变区cdr3的氨基酸序列为seq id no.3；

8、轻链高变区cdr1的氨基酸序列为seq id no.4；

9、轻链高变区cdr2的氨基酸序列为seq id no.5；

10、轻链高变区cdr3的氨基酸序列为seq id no.6；

11、其中，抗体19h3的可变区包含三个cdr的重链高变区和三个cdr的轻链高变区；重链高变区cdr1的氨基酸序列为seq id no.7；

12、重链高变区cdr2的氨基酸序列为seq id no.8；

13、重链高变区cdr3的氨基酸序列为seq id no.9；

14、轻链高变区cdr1的氨基酸序列为seq id no.10；

15、轻链高变区cdr2的氨基酸序列为seq id no.11；

16、轻链高变区cdr3的氨基酸序列为seq id no.12。

17、优选的，抗体16c12的可变区还包含四个fr的重链骨架区和四个fr的轻链骨架区；重链骨架区fr1的氨基酸序列为seq id no.13；

18、重链骨架区fr2的氨基酸序列为seq id no.14；

19、重链骨架区fr3的氨基酸序列为seq id no.15；

20、重链骨架区fr4的氨基酸序列为seq id no.16；

21、轻链骨架区fr1的氨基酸序列为seq id no.17；

22、轻链骨架区fr2的氨基酸序列为seq id no.18；

23、轻链骨架区fr3的氨基酸序列为seq id no.19；

24、轻链骨架区fr4的氨基酸序列为seq id no.20；

25、其中，抗体19h3的可变区还包含四个fr的重链骨架区和四个fr的轻链骨架区；

26、重链骨架区fr1的氨基酸序列为seq id no.21；

27、重链骨架区fr2的氨基酸序列为seq id no.22；

28、重链骨架区fr3的氨基酸序列为seq id no.23；

29、重链骨架区fr4的氨基酸序列为seq id no.24；

30、轻链骨架区fr1的氨基酸序列为seq id no.25；

31、轻链骨架区fr2的氨基酸序列为seq id no.26；

32、轻链骨架区fr3的氨基酸序列为seq id no.27；

33、轻链骨架区fr4的氨基酸序列为seq id no.28。

34、优选的，抗体16c12包含以下序列之一：

35、1)如seq id no.29的氨基酸序列所示的重链可变区；

36、2)如seq id no.30的氨基酸序列所示的轻链可变区；或者

37、3)如seq id no.29的氨基酸序列所示的重链可变区和如seq id no.30的氨基酸序列所示的轻链可变区；

38、抗体19h3包含以下序列之一：

39、1)如seq id no.31的氨基酸序列所示的重链可变区；

40、2)如seq id no.32的氨基酸序列所示的轻链可变区；或者

41、3)如seq id no.31的氨基酸序列所示的重链可变区和如seq id no.32的氨基酸序列所示的轻链可变区；

42、优选的，抗体16c12和抗体19h3的重链恒定区ch的氨基酸序列包括seq id no.33，抗体16c12和抗体19h3的轻链恒定区cl的氨基酸序列包括seq id no.34。

43、在本发明中，seq id no.1-seq id no.34的氨基酸序列如下表1所示。

44、表1

45、

46、

47、

48、本发明的第二个方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子的核苷酸序列编码如本发明所述的抗msln抗体。

49、优选的，编码抗体16c12的重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列选自以下序列之一：

50、1.1)如seq id no.35所示的核苷酸序列；

51、1.2)由于遗传密码子的简并性区别于1.1)中的核苷酸序列的核苷酸序列；

52、编码抗体16c12的轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列选自以下序列之一：

53、2.1)如seq id no.36所示的核苷酸序列；

54、2.2)由于遗传密码子的简并性区别于2.1)中的核苷酸序列的核苷酸序列。

55、编码抗体19h3的重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列选自以下序列之一：

56、3.1)如seq id no.37所示的核苷酸序列；

57、3.2)由于遗传密码子的简并性区别于3.1)中的核苷酸序列的核苷酸序列。

58、编码抗体19h3的重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列选自以下序列之一：

59、4.1)如seq id no.38所示的核苷酸序列；

60、4.2)由于遗传密码子的简并性区别于4.1)中的核苷酸序列的核苷酸序列。

61、优选的，编码抗体16c12和抗体19h3的重链恒定区的氨基酸序列的核苷酸序列选自以下序列之一：

62、5.1)如seq id no.39所示的核苷酸序列；

63、5.2)由于遗传密码子的简并性区别于5.1)中的核苷酸序列的核苷酸序列；

64、编码抗体16c12和抗体19h3的轻链恒定区的氨基酸序列的核苷酸序列选自以下序列之一：

65、6.1)如seq id no.40所示的核苷酸序列；

66、6.2)由于遗传密码子的简并性区别于6.1)中的核苷酸序列的核苷酸序列。在本发明中，seq id no.35-seq id no.40的核苷酸序列如下表2所示。

67、表2

68、

69、

70、

71、本发明的第三个方面，提供了一种表达载体，所述载体包含本发明所述的核酸分子。

72、本发明的第四个方面，提供了一种宿主细胞，所述细胞包含本发明所述的核酸分子，或者本发明所述的表达载体。

73、本发明的第五个方面，提供了一种药物偶联物，所述药物偶联物包含本发明所述的抗msln抗体。

74、本发明的第六个方面，提供了一种试剂盒，包含本发明所述的msln抗体，或者本发明所述的核酸分子。

75、本发明的第七个方面，提供了一种制备本发明所述的msln抗体的方法，包括以下步骤：培养本发明所述的宿主细胞，回收msln抗体。

76、本发明的第八个方面，提供了一种非诊断目的的检测样品中msln的方法，包括以下步骤：使用本发明所述的msln抗体接触待测样本，确认所述待测样本中msln是否存在或水平。

77、本发明的第九个方面，提供了如下任意一项所述的应用：

78、1)本发明所述的msln抗体、本发明所述的核酸分子、本发明所述的表达载体、本发明所述的宿主细胞在非诊断目的的检测msln中的应用；

79、2)本发明所述的msln抗体、本发明所述的核酸分子、本发明所述的表达载体、本发明所述的宿主细胞在制备诊断和治疗msln相关的疾病的产品中的应用。

80、优选的，所述疾病包括：胰腺癌、恶性胸膜间皮瘤、卵巢癌和肺癌。

81、本发明的第十个方面，提供了一种获得抗体的方体，包括以下步骤：

82、s1、动物免疫，采用抗原进行动物免疫；

83、s2、细胞分离，摘取免疫动物的器官，分离出免疫细胞

84、s3、b细胞培养和鉴定，利用生物素标记的抗原与成功免疫的免疫细胞共孵育，分选得到记忆性b细胞；

85、s4、收集b细胞阳性克隆，选择部分阳性克隆用rnaiso plus提取总rna并反转录成cdna，通过pcr方法，扩增轻链可变区和重链可变区序列，并构建到含有对应重链恒定区和轻链恒定区的ptt5表达载体上进行测序，获得正确序列；

86、s5、b细胞阳性克隆的表达纯化。

87、优选的，所述动物为哺乳动物。

88、与现有技术相比，本发明有益效果及显著进步在于：

89、1、本发明利用b细胞的体外培养技术开发单抗，避免了骨髓瘤融合时抗体多样性的丢失，也避免了噬菌体展示技术造成的抗体轻重链配对不再是天然组合的问题；

90、2、本发明提供的抗msln抗体活性高、亲和力高。