一种根癌农杆菌介导的老芒麦遗传转化方法

本发明属于植物组培技术和植物转基因，具体地涉及一种诱导老芒麦(elymussibiricuslinn.)幼穗产生愈伤组织，并以这些愈伤组织作为根癌农杆菌侵染对象，成功地建立了老芒麦的遗传转化体系。

背景技术：

1、老芒麦(elymussibiricuslinn.)别名西伯利亚披碱草(siberian wildrye)，是禾本科(poaceae)小麦族(triticeae)披碱草属(elymus)的一种多年生自花授粉、异源四倍体疏丛型旱生牧草。老芒麦具有叶量多、产草量高、适口性好、抗逆性强等优点；老芒麦植株分蘖好、再生力强、返青早、营养价值高，其粗蛋白含量高达11.13％,消化率达80％以上,青草和调制的干草均为马、牛、羊所喜食。野生老芒麦种质资源广泛分布于北半球温带地区，在我国西藏、四川、新疆、内蒙古等多个省区均有分布，是草甸草原和草甸群落中的重要成分。老芒麦作为牧草生态草兼用型乡土草种，因其牧草品质较佳和极强的抗逆性，是青藏高原大面积播种的主要牧草之一，因此老芒麦作为重要的栽培牧草和生态修复草种在青藏高原地区被大面积推广种植。同时老芒麦较耐旱，在建设高产人工草地和恢复改良天然草地中发挥着重要作用。由于老芒麦分布范围广泛和多样的生境类型，使得野生老芒麦种质具有极为丰富的形态多样性，存在很多潜在的优良种质资源，具有很大的开发利用潜力。

2、采用传统的育种方法选育新品种需要耗费大量的人力物力并且过程极为缓慢，随着分子生物学技术的发展，人们可以用基因工程技术改良植物，不断培育出符合人类期望的老芒麦新品种。近年来,随着分子生物学的发展,对植物进行功能基因研究成为热点,尤其是crispr/cas9技术的产生,为分子育种奠定了基础，大大加快了作物分子育种的进程。但由于遗传转化体系的限制，植物基因功能的研究目前主要集中在一些模式植物上。

3、禾本科是第四大植物家族，包含有650到785种属，大约含有10000多种植物。所有的谷类作物和75％的栽培牧草都属于草类。虽然整个草家族很庞大，但是只有极少数的被开发作为牧草。植物遗传转化体系中，高效遗传转化受体系统的建立是转化过程中最关键的一步，因此建立一种有效的、稳定的再生系统和转化系统仍有许多问题需要进行细致深入的研究。基因枪法的不足之处在于其转化频率较低成本较高，插入的外源基因多为多拷贝、易出现嵌合体和基因沉默现象，遗传稳定性较差，致使该方法存在高投入低产出的弊端。根癌农杆菌介导法是转基因技术中经常采用的一种手段，根癌农杆菌介导的遗传转化技术在植物基因工程发展中是研究最清楚应用最广泛的，利用根癌农杆菌在双子叶植株中的转化已经十分完善，其中的dna能够转移到植物基因组上，从而使得植物得到转化。根癌农杆菌介导的遗传转化过程是自然界发生的完美的基因转化过程，它的一段dna能插入到受体植物细胞基因组，并稳定的遗传给后代，作为一种天然的植物基因转化系统，具有转化的外源dna结构完整、转化机理清楚、整合位点稳定、拷贝数低、聚合后的外源基因结构变异较小等优点，因而备受重视。近年来该方法在单子叶植物上取得了突破性进展，已成功获得了转基因玉米、水稻和小麦等禾本科作物，但是因为老芒麦等单子叶植物不是根癌农杆菌的天然寄主，转化工程比较困难。因此关于老芒麦遗传转化的报道较少。本发明人团队之前所申请的专利cn112553248b一种老芒麦遗传转化体系的建立方法及遗传转化方法仅能获得阳性愈伤组织，未能成功分化成植株。

4、鉴于根癌农杆菌侵染转化老芒麦的重要性，筛选可分化且可侵染的老芒麦的基因型是建立老芒麦高效遗传转化的首要条件。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题在于提供一种通过根癌农杆菌侵染愈伤组织，建立老芒麦遗传转化体系的方法。利用本发明所述方法能够高效快捷的转化老芒麦愈伤组织，并且能得到老芒麦再生植株。

2、本发明采用下述技术方案予以实现：

3、一种根癌农杆菌介导的老芒麦遗传转化方法，所述方法包括获得老芒麦组培无菌愈伤组织、转化根癌农杆菌感受态、活化根癌农杆菌、侵染老芒麦愈伤组织及共培养、植物转化材料的愈伤组织筛选培养、分化筛选培养和生根培养；

4、所述的分化筛选培养的培养基是在ms基础培养基中添加终浓度60g·l-1蔗糖、7.8g·l-1琼脂、3mg·l-16-ba、300mg·l-1特美汀和5mg·l-1潮霉素，14-21天继代一次；经过2-3月筛选培养之后，未转化材料死亡，阳性愈伤组织进行分化获得分化苗；培养条件为27℃下，光照强度2000lx，光周期为14小时光照/10小时黑暗；

5、所述的生根培养为待分化苗在长至4-6cm时，将分化苗继代在生根培养基上；在27℃下，光照强度2000lx，光周期为14小时光照/10小时黑暗，培养10-20天老芒麦生根；生根培养基是在1/2ms基本培养基中添加15g·l-1蔗糖、7.8g·l-1琼脂和300mg·l-1特美汀。

6、进一步，所述获得老芒麦组培无菌愈伤组织：以老芒麦的幼穗为外植体，在诱导培养基上进行愈伤组织的诱导，外植体长出愈伤组织后，将愈伤组织在无菌的环境中转移到含相应植物激素组合的新鲜的继代培养基上，继代一次，将愈伤组织继代到分化培养基上。

7、进一步，所述继代培养的环境条件：温度为27℃，光周期为24h黑暗。

8、进一步，所述的诱导培养基是在ms基础培养基中添加5mg·l-12,4-d、30g·l-1蔗糖和7.8g·l-1琼脂，调节ph5.8。

9、进一步，所述的继代培养基是在ms基础培养基中添加1.5mg·l-12,4-d、30g·l-1蔗糖和7.8g·l-1琼脂，调节ph5.8。

10、进一步，所述的分化培养基是在ms基础培养基中添加60g·l-1蔗糖、7.8g·l-1琼脂、3mg·l-16-ba和潮霉素5mg·l-1，调节ph5.8。

11、进一步，所述的转化根癌农杆菌感受态：冰上融化根癌农杆菌eha105感受态细胞，冰上融化后，加入3ul的潮霉素(hyg)质粒dna，冰上静置30分钟，液氮中冷冻1分钟；然后37℃水浴3min加入950μl无抗生素的yep培养基，28℃，200rpm，振荡培养3小时；离心浓缩菌液，用100μlyep培养基回溶菌体，后将回溶后的菌体涂于加50mg·l-1卡那霉素的固体yep培养基上，28℃下培养，长出单克隆后，用pcr鉴定潮霉素b抗性基因，保存阳性根癌农杆菌落。

12、进一步，所述的活化根癌农杆菌：将阳性根癌农杆在培养基中培养至od600值等于0.3-0.4，作为转化老芒麦愈伤组织的侵染液。

13、进一步，所述侵染老芒麦愈伤组织并共培养：选择继代培养基上生长状况良好、致密有颗粒感的愈伤组织，作为根癌农杆菌侵染的外植体；把愈伤组织放到根癌农杆菌侵染液中，抽真空10min，超声5min，抽真空10min；倒去上层菌液，将侵染后的愈伤组织捞出放滤纸上吹干以除去过多的附着根癌农杆菌，期间需不断翻愈伤组织至干燥；然后将侵染后的愈伤组织在滤纸上共培养4天。

14、进一步，所述的植物转化材料的愈伤组织筛选培养：经侵染的植物组织材料与根癌农杆菌共培养4天之后，取出愈伤组织在无菌条件下转到筛选培养基上，暗培养筛选3-6周，每14-21天继代一次以保持抗生素筛选压力的稳定。

15、进一步，所述的筛选培养基是在ms基础培养基中加入30g·l-1蔗糖、7.8g·l-1琼脂、1.5mg·l-12,4-d、300mg·l-1特美汀和30mg·l-1潮霉素。

16、本发明与现有技术相比的有益效果：

17、本发明由根癌农杆菌介导，通过根癌农杆菌系统导入外源基因并获得转基因植株。首先在植物组织培养过程中，基本培养基只能保证外植体生存的最低要求，蔗糖是细胞骨架构成和能量的主要来源，是体胚培养过程中的主要碳源，在分化培养过程中，不同植物在体胚诱导阶段往往都需要提供大量的能量才能够诱导分化。蔗糖在胚性愈伤组织诱导过程中需要的浓度范围是20-30g/l或者更高，随着蔗糖浓度的升高，胚性愈伤组织的形成率也会有所提高，进而提高植物分化的效率。当蔗糖浓度高于80g/l时，分化会受到明显的抑制。植物在分化诱导阶段往往需要一种细胞分裂素或者多种细胞分裂素配合使用，通常使用的细胞分裂素为6-ba、kt、zt、tdz，其中tdz一般单独使用，而6-ba与kt或naa配合使用。本研究以高浓度的6-ba与高浓度的蔗糖配合使用并筛选得到了适合侵染老芒麦愈伤组织基因型db-50，使老芒麦分化效率达到30％以上，得到了老芒麦愈伤组织分化而来的再生植株。进一步对根癌农杆菌介导的转化方法进行了研究，获得了带有hyg基因的转基因株系，为老芒麦品种db-50的遗传转化体系的建立提供了一种可能性。此外，老芒麦植株叶量多，产草量大，老芒麦遗传转化体系的建立，方便了以老芒麦作为模型，研究控制其叶片生物量的分子机制，挖掘老芒麦中叶量相关的基因，通过基因工程手段，将挖掘到的相关基因应用到其他作物中，提高作物的地上部分生物量。