一种具有屏障结构的类器官模型及其构建方法

本发明涉及组织工程和类器官芯片，特别涉及一种具有屏障结构的类器官模型及其构建方法。

背景技术：

1、据联合国卫生组织估算，目前全世界有近六分之一的人患有中枢神经系统(central nervous system,cns)疾病，包括脑梗塞、脑出血、脑膜炎、脱髓鞘疾病和神经退行性变等。患有cns疾病的患者需要长期服用中枢神经系统药物，治疗神经功能障碍或缓解神经退化进程，cns药物的市场规模也因此快速扩大。中国cns药物的销售额已从2015年的1440亿元增长至2019年的2043亿元，年复合增长率为9.1％，预计2020年至2024年将以4.6％的年复合增长率进一步增长，在2024年达到2509亿元。

2、然而，cns药物市场相比其他治疗领域表现出高风险、高收益的特征。临床试验显示，cns药物的研发非常困难，从临床一期到上市的成功率仅为8.4％，总体的研发成功率仅有6.2％，获得美国食品和药物管理局(fda)批准的时间长达19.3月。2009至2011年间，10家大型制药公司公开可见的临床cns项目数量下降了50％，用于新药研发的风险投资减少了56％，用于神经病学的风险投资减少了39％，相比至下，肿瘤学减少了不到5％。

3、具体来说，cns药物研发的难点主要在于：1、许多cns疾病的准确病因及发病机制尚无定论，药物只能治标不能治本；2、现有的cns临床前模型保真度低，导致研发的治疗靶点或方法在临床试验中成功率低；3、血脑屏障(blood-brain barrier,bbb)的高屏障特性阻碍外周静脉注射药物以可作用的药理浓度到达大脑，药物治疗效果难以真实反映；4、cns药物常伴随较明显的副作用，易引起慢性脑炎、高血压、自杀倾向等。因此，迫切需要开发一种高保真的、具有血脑屏障的大脑模型来进行多种cns疾病模型的构建、相关发病机制的研究，推动cns药物的通透性测试、药效评价及药毒性评估等研发工作。

4、动物模型的大脑天然具有血脑屏障与大脑实质组织，但与人类大脑存在明显差异，是导致药物开发成功率低的主要因素之一。人脑与动物脑的重要区别在于脑容量、神经胶质、神经发生、皮层构成等方面。与人类相比，大多数动物的脑容量、胶质细胞与神经元的比率比较小，神经发生的速度也不相同。动物脑的皮层细胞类型高度保守，但在细胞比例、基因表达水平和层级分布等方面与人脑存在很大差异，不能完全地模拟反映人脑组织，所以许多脑科学的研究并不能在动物模型中找到答案。除此之外，动物模型还具有成本高、研发周期长以及道德和伦理问题等。因此，在体外构建一种人源的、具有血脑屏障结构的大脑模型是cns药物开发的主要挑战。

5、体外血脑屏障模型从transwell系统发展至新兴的器官模型，可以实现bbb细胞的接触培养和血流剪切力的模拟，具有成本低、易操作、条件可控等优点，可用于屏障的病理生理研究和药物的渗透性测试。大脑类器官是大脑实质的优秀代表，由干细胞通过自组织分化形成微尺度脑组织，具有多种神经细胞类型和特定的三维组织结构，可模拟cns疾病的病理表型，进行药物药效评估和毒性测试，具有成本低、易操作、条件及微环境可控、伦理风险低等优点。

6、器官芯片技术与类器官技术应用广泛，但具有血脑屏障的人源大脑类器官模型仍未有研究报道，其原因可能在于：1、多种bbb细胞类型的共培养体系复杂，bbb结构不能长期保持人类生理相关的屏障功能；2、大脑类器官与bbb结构的培养系统差异较大、共培养体系难以搭建，共培养过程中大脑类器官的生物学形态结构及生理功能难以保证；3、bbb结构与大脑类器官在长期动态共培养中的稳态维持问题等。

7、简而言之，我们可以筛选一种共培养bbb细胞的条件培养基，有助于实现bbb结构的功能化。进一步地，通过搭建一个bbb与大脑类器官的共培养体系，可以进行功能化bbb结构与人源大脑类器官的长期稳态共培养，解决大脑类器官缺乏bbb结构、功能化bbb缺乏大脑实质组织的局限性。我们开发的一种人源的、具有血脑屏障的大脑类器官模型，对于推动cns药物的通透性测试、药物药效评价及药物毒性测试的相关研究具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明目的是提供一种具有屏障结构的类器官模型和构建方法，实现功能化bbb结构的构建、人源大脑类器官的悬浮维持培养。通过将功能化bbb结构与人源大脑类器官进行长期稳态共培养，解决了人源大脑类器官缺乏bbb结构、功能化bbb缺乏大脑实质组织的局限性。进一步简化流体实施条件，提高大脑血脑屏障模型的仿生性与保真度，该模型有助于推进cns药物渗透性、药效评估及毒性评价的测试或研究。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、在本发明的第一方面，提供了一种具有屏障结构的类器官模型的构建方法，所述方法包括：

4、获得具有屏障结构的类器官芯片，包括：细胞培养板和设于所述细胞培养板内的集成式微孔组件，所述集成式微孔组件从上到下依次包括：上层元件、多孔膜和下层元件；所述上层元件包括第一中空件和第二中空件，所述第一中空件的其中一对相对设置的侧壁均抵接于所述细胞培养板的内壁，所述第一中空件的中部卡接有所述第二中空件，所述第二中空件将所述第一中空件分隔成左培养基储液池和右培养基储液池，所述第二中空件的底部设有所述多孔膜形成培养基加液池；所述下层元件呈中空形且所述下层元件外形与所述第一中空件的外周形状相适配，所述下层元件的中部上表面用于支撑所述多孔膜，所述左培养基储液池的底部和所述右培养基储液池的底部通过所述下层元件的底部相连通形成培养基灌流通道；

5、将所述具有屏障结构的类器官芯片灭菌后，对所述多孔膜进行包被处理；将内皮细胞培养基与用于增强屏障结构的细胞的培养基按照1:9-4:6的体积比配制，获得条件培养基；将内皮细胞接种在所述包被后的多孔膜的一侧，用于增强屏障结构的细胞接种至所述包被后的多孔膜的另一侧，使用所述条件培养基将内皮细胞和用于增强屏障结构的细胞共培养；

6、所述共培养12～72h后，将类器官加载至所述具有屏障结构的类器官芯片的培养基加液池中，分别向所述培养基储液池和所述培养基加液池中添加所述条件培养基与类器官成熟的培养基，后置于精密翘板摇床上进行功能化屏障结构与类器官的长期静态或动态共培养，获得具有屏障结构的类器官模型。

7、在本发明的第二方面，提供了一种采用所述方法制备得到的具有屏障结构的类器官模型。

8、在本发明的第三方面，提供了一种有屏障结构的大脑类器官芯片，其特征在于，所述具有屏障结构的大脑类器官芯片包括：

9、细胞培养板；

10、集成式微孔组件，设于所述细胞培养板内；所述集成式微孔组件从上到下依次包括：上层元件、多孔膜和下层元件；所述上层元件包括第一中空件和第二中空件，所述第一中空件的其中一对相对设置的侧壁均抵接于所述细胞培养板的内壁，所述第一中空件的中部卡接有所述第二中空件，所述第二中空件将所述第一中空件分隔成左培养基储液池和右培养基储液池，所述第二中空件的底部设有所述多孔膜形成培养基加液池；所述下层元件呈中空形且所述下层元件外形与所述第一中空件的外周形状相适配，所述下层元件的中部上表面用于支撑所述多孔膜，所述左培养基储液池的底部和所述右培养基储液池的底部通过所述下层元件的底部相连通形成培养基灌流通道。

11、进一步地，所述第一中空件的高度为2～15mm；所述下层元件的高度为0.5～3mm。

12、进一步地，所述多孔膜的厚度为5～20μm，孔隙大小为0.1～3μm，孔隙率为1×105～5×106孔/cm2。

13、本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

14、1、本发明提供的一种具有屏障结构的类器官芯片集成了人功能性的血脑屏障结构和人源大脑类器官，解决了现有血脑屏障模型的物种差异性问题，一定程度上重现了脑实质的复杂细胞类型与组织结构。

15、2、本发明通过设计上、下层元件与多孔膜形成夹层结构组件的芯片，便于在多孔膜两侧共培养血脑屏障细胞，在上层元件与多孔膜形成的培养基加液池中培养大脑类器官，实现二者的长期稳态共培养，简化了芯片的构建、组装和应用方法。

16、3、本发明通过设计基底、培养基储液池、培养基灌流通道以及培养基加液池，依靠精密翘板摇床提供重力流，有利于在下层元件与基底间形成双向的流体流动，避免了设计复杂的流体通道和使用多种灌流设备，简化了流体实施条件。

17、4、本发明以细胞培养板的培养孔为基底，有利于维持细胞和大脑类器官的活性，生物相容性更强，适用于大规模生产。

18、5、本发明设计的芯片结构简单、便于组装，简化了具有屏障结构的类器官模型的构建流程，便于相关领域人员操作，用户友好性高，具有巨大的应用前景和商业价值。