靶向降钙素原的抗体A4D7及其应用的制作方法

本发明涉及免疫检测，具体地说，涉及一种靶向降钙素原的抗体a4d7及其应用。

背景技术：

1、降钙素原(procalcitonin，pct)是一种由116个氨基酸组成的非激素活性糖蛋白，是降钙素(calcitonin，ct)的前体。pct是20世纪80年代在肿瘤标志物研究中发现的。20世纪90年代，在对急性肺损伤标志物的研究中，发现脓毒症和感染性休克患者的血清pct指数会出现急剧升高。引入该主题是为了讨论pct与感染之间是否存在关系，后续研究表明，pct可作为严重细菌感染尤其是脓毒症的血清标志物，是早期辅助鉴别诊断全身炎症反应的重要指标，可作为判断疾病严重程度、治疗疗效和预后的重要指标。

2、pct参与免疫调节作为炎症检测指标的临床应用：

3、作为一种免疫调节蛋白，pct是检测炎症最常用的标志物之一。pct诱导受到机体严格的调控，其激活步骤在时间和功能上均高度关联，这种关联性可能被用于反映疾病的严重程度。在生理条件下，pct由甲状腺滤泡旁细胞合成。在存在细菌感染的情况下，身体其他部位的细胞(例如单核细胞和神经内分泌细胞)在细胞因子刺激下激活降钙素原对应的calc-i基因的诱导表达，进而导致pct被持续表达和释放。此外，pct在体内外非常稳定，易于检测，其浓度升高不易受到机体免疫抑制状态的影响。正因如此，pct被认为是在全身炎症反应的早期检测中起着重要作用的生物标记物，从而广泛用于包括细菌感染性疾病在内的多种临床症状的鉴别诊断、病情的判断和预后的评估，包括但不限于重大创伤(意外创伤、手术、烧伤)、多器官功能不全、严重胰腺炎或严重肝病或肾病、新生儿初生早期。另外，非感染性的pct升高可能与严重的组织损伤、血浆促炎细胞因子水平升高、严重的器官环境障碍或者副肿瘤综合征等因素有关。pct对区分感染性和非感染性发热(如肿瘤热、药物热)具有高敏感性和特异性。淋巴瘤患者在化疗后由于免疫功能障碍和粒细胞缺乏症，很容易并发严重感染。研究表明，伴有明显感染和发热的粒细胞减少患者pct水平明显升高，而局灶性感染或不明原因发热患者pct水平无明显改变，为细菌性血流感染的早期诊断以及避免抗生素的过度应用提供了参考。

4、pct的标准化检测方法：

5、pct半衰期为25-30h，体外稳定性好，便于检测，室温采血24h后pct浓度下降约12％。在4℃下储存时仅减少6％。因此，如果血液采集后不能立即进行检测，样本必须低温保存。目前pct临床检测方法主要有化学发光免疫分析法、放射免疫分析法、胶体金法、透射免疫比浊法、时间分辨荧光免疫分析技术等，其基本原理是抗原与抗体的免疫结合反应。

6、侧向层析快速诊断试剂盒的检测方法通常只能提供定性结果，不太适用于需要根据精细的定量结果对感染情况进行诊断的特定病原体(如某些细菌、支原体、病毒等)，而基于时间分辨荧光免疫分析技术的侧向层析快速诊断试剂盒，在使用特定仪器和利用上述(比如基于稀土元素的螯合物等新型设计)特定抗体化学标记的前提下，具有高灵敏度、便捷操作、自动化程度高、标准曲线宽、不受天然样品荧光干扰、标记物制备简单稳定、无放射性污染等特点，可广泛用于快速检测或诊断。通过免疫反应可以考虑使用定量或半定量的方法估算标记抗体的浓度，并推算所结合靶标抗原的浓度，从而理论上可以实现对特定病原微生物的快速诊断和精细(半)定量。

7、无论如何，侧向层析快速诊断试剂盒达到了灵敏度、稳定性、经济性和易用性兼顾的一般标准，通常情况下并不需要快速诊断所需的设备，因而具有重要而广泛的实用价值。侧流免疫层析快速诊断试剂盒的这些优势对于缺乏专业设备和未经培训的技术人员的单位和地区尤为重要，而对于拥有专业设备和经过培训的技术人员的单位和地区，相应的产品的新型设计依然能够满足精细的定量或半定量的要求。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种靶向降钙素原的抗体a4d7及其应用。

2、为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种靶向降钙素原的抗体a4d7，所述抗体的轻链高变区cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3的氨基酸序列分别为rssdsllhsngitylf、qmsalas和aqnlhlpwt，抗体m1301的重链高变区cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3的氨基酸序列分别为sdyswe、yidfrgstkynpslrs和rgsfry。

3、所述抗体的轻链、重链的氨基酸序列分别如seq id no:1、2所示。

4、第二方面，本发明提供所述抗体在制备降钙素原检测试剂或试剂盒中的应用。

5、第三方面，本发明提供由所述抗体制备的降钙素原检测试剂或试剂盒。

6、第四方面，本发明提供所述抗体在制备降钙素原免疫层析检测试纸条或试剂盒中的应用。

7、第五方面，本发明提供所述抗体在制备降钙素原侧向流免疫层析诊断试剂盒中的应用。

8、第六方面，本发明提供一种降钙素原免疫层析检测试纸条，包括样品垫、结合垫、nc膜、吸水垫和底板，所述反应膜上设有检测线和质控线，所述样品垫、结合垫、nc膜和吸水垫依次粘贴在底板上。

9、其中，所述结合垫上包被有免疫(荧光)微球偶联的靶向降钙素原的抗体f4b4；所述检测线包被有抗体a4d7，所述质控线包被有羊抗鼠多抗。

10、抗体f4b4的轻链、重链的氨基酸序列分别如seq id no:3、4所示。

11、优选地，所述结合垫上包被的抗体f4b4的浓度为10-15μg/ml。

12、优选地，所述检测线上包被的抗体a4d7的浓度为1.5-2mg/ml。

13、优选地，所述样品垫、所述吸水垫的材质为纤维素，所述结合垫的材质为玻璃纤维。

14、第七方面，本发明提供降钙素原定性和(半)定量快速检测方法(含非诊断目的)，所述检测方法为双抗体夹心法，所用第一抗体为靶向降钙素原的抗体f4b4(其轻链、重链的氨基酸序列分别如seq id no:3、4所示)，所用第二抗体为抗体a4d7。

15、本发明中，抗体f4b4和a4d7分别结合于降钙素原的不同表位。

16、本发明中，相应的抗原氨基酸序列为进行相应调整或修饰后的氨基酸序列，修饰材料包括但不限于纳米材料、荧光材料、酶类、生物素和蛋白质中的一种或几种。有利于将调整或修饰的氨基酸序列应用于降钙素原的检测、降钙素原的免疫抗原设计等。

17、借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

18、(一)本发明提供一种靶向识别降钙素原的抗体a4d7，并将其用于侧向流免疫层析快速诊断试剂盒的构建。该抗体具有高特异性和高亲和力特性，以各氨基酸序列中的一个或多个为核心，将其应用于降钙素原治疗靶点设计，可以设计出针对降钙素原的治疗制剂，所述治疗靶点设计包括但不限于治疗性抗体的靶点设计。

19、(二)该抗体不仅可以有效用于降钙素原的定量和/或定性检测，还可用于elisa检测、免疫化学发光法检测和免疫荧光法检测等多种检测方法，应用范围广、适用性强。

20、(三)本发明基于侧向流免疫层析快速诊断试剂盒的优势在于检测限较低，灵敏度较高；并且选用的抗体是特异性靶向具有高度保守氨基酸序列的抗原表位，降低检测成本，缩短检测时间，提高检测效率。侧向流免疫层析快速诊断试剂盒是一项具有重要应用价值的检测技术，能够实现快速诊断所要求的灵敏、稳定、经济、用户友好和无需设备等通用标准。该侧向流免疫层析快速诊断试剂盒的这些优势，尤其是对于缺乏专业设备和缺乏受过良好训练的技术人员的单位或地区具有重要意义。