一种猫粒细胞集落刺激因子突变体以及聚乙二醇衍生物和应用的制作方法

本发明属于生物工程的，具体涉及一种猫粒细胞集落刺激因子突变体以及聚乙二醇衍生物和应用。

背景技术：

1、粒细胞集落刺激因子(g-csf)是主要由纤维母细胞、骨髓间质细胞、单核巨噬细胞和血管内皮细胞产生的一种可选择性刺激造血干细胞增殖分化为某一谱系的细胞因子，其对粒细胞前体细胞的活力、增殖、分化和中性粒细胞的功能具有调节作用，在临床上主要用于治疗由各种原因(如肿瘤化疗)引起的粒细胞减少症。此外，新的研究表明，g-csf在治疗复发性流产、促进心梗患者的心肌血管再生方面也有一定的效果。目前宠物类的集落刺激因子集中在犬的集落刺激因子的表达及活性研究，市面上还没有专用的猫集落刺激因子产品，《2021年中国宠物行业白皮书》显示，中国城镇家庭养育宠物猫的数量已达到5806万只，因此猫集落刺激因子开发具有良好的市场前景。

2、通过基因工程手段及相关现代分子生物学技术来表达和生产猫粒细胞集落刺激因子(fg-csf)是一种经济、高效的方法，然而fg-csf在在机体内存在易受蛋白酶降解、半衰期短的特点，持续给药会引发药疹、发热、肌痛、骨痛等副作用，导致实际用量远低于理论需用量，直接影响临床治疗效果，这极大的限制了其在临床治疗中的应用，因此开发一款专用于猫且具有长半衰期的集落刺激因子产品是必要的。

3、聚乙二醇(peg)化学修饰是延长蛋白类药物半衰期的一个有效途径，末端活化的peg是一种惰性、两亲、不带电荷的柔性长链高分子聚合物，已经作为多种药物的安全载体用于临床应用，比如说peg-干扰素、peg-生长抑素等。peg通过共价键与蛋白质连接，可与蛋白质分子中的氨基(位于n末端的氨基或赖氨酸残基)或者巯基(位于半胱氨酸)反应对蛋白质分子进行修饰，从而增大蛋白质的相对分子质量(mr)并屏蔽酶的攻击、掩盖蛋白质的部分抗原决定簇。peg修饰可以有效地改变蛋白类药物在体内的分布和药物学特性，延长蛋白质药物的血药浓度，同时还可降低免疫原性、毒副作用以及增强物理化学生物的稳定性，在很大程度上扩宽了蛋白质和多肽的应用范围。

4、目前大部分g-csf的相关产品都是用的大肠杆菌表达系统表达，主要因为csf相关蛋白活性对翻译后修饰要求低，大肠杆菌表达系统具有培养操作简单，生长繁殖快，成本低，靶蛋白快速大规模生产等优点。因此在原核表达系统可更高效地实现对猫粒细胞集落刺激因子的表达和最终产业化生产。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明的目的在于提供一种猫粒细胞集落刺激因子突变体以及聚乙二醇衍生物和应用。

2、本发明的技术内容如下：

3、本发明提供了一种猫粒细胞集落刺激因子fg-csf突变体，所述突变体为将成熟肽猫粒细胞集落刺激因子fg-csf(np_001009227.1)进行氨基酸位点的突变得到；

4、所述突变的氨基酸位点包括成熟肽fg-csf第24位缬氨酸、第33位谷氨酸、第45位谷氨酸、第73位甘氨酸、第101位的脯氨酸、第110位异亮氨酸、第123位门冬氨酸、第159位丝氨酸、第170位组氨酸的一个位点以上；

5、所述氨基酸位点的突变包括如下：

6、第一种：将成熟肽fg-csf第24位缬氨酸突变为异亮氨酸，第33位谷氨酸突变为赖氨酸，第45位谷氨酸突变为谷氨酰胺，第73位甘氨酸突变为赖氨酸，第110位异亮氨酸突变为缬氨酸；

7、第二种：将成熟肽第24位缬氨酸突变为异亮氨酸，第45位谷氨酸突变为谷氨酰胺，第101位脯氨酸突变为赖氨酸，第110位异亮氨酸突变为缬氨酸，第123位门冬氨酸突变为赖氨酸；

8、第三种：将成熟肽第24位缬氨酸突变为异亮氨酸，第45位谷氨酸突变为谷氨酰胺，第110位异亮氨酸突变为缬氨酸，第159位丝氨酸突变为赖氨酸，第170位组氨酸突变为赖氨酸；

9、根据peg修饰原理，所述氨基酸位点还包括突变为赖氨酸、组氨酸、精氨酸或其他氨基酸残基之上，均在本专利保护范围。

10、所述成熟肽猫粒细胞集落刺激因子fg-csf及其突变体fg-csf-lys-mut1、fg-csf-lys-mut2、fg-csf-lys-mut3的氨基酸序列分别如seq id no.1～4所示，与组氨酸标签(6×his)融合的fg-csf-h、fg-csf-lys-mut1-h、fg-csf-lys-mut2-h、fg-csf-lys-mut3-h经密码子优化之后的核酸序列分别如seq idno.5～8所示。

11、本发明还提供了一种猫粒细胞集落刺激因子聚乙二醇衍生物的制备方法：

12、1)将上述组氨酸标签(6×his)融合的fg-csf-h、fg-csf-lys-mut1-h、fg-csf-lys-mut2-h、fg-csf-lys-mut3-h合成于大肠杆菌表达载体，之后转化至表达菌株(大肠杆菌)，进行诱导表达、纯化得到fg-csf-h、fg-csf-lys-mut1-h、fg-csf-lys-mut2-h、fg-csf-lys-mut3-h蛋白；

13、所述表达载体包括但不限于pet-3a、pet-11a、pet-12a、pet-14b、pet-15b、pet-16b、pet-17b、pet-19b、pet-20b、pet-21a、pet-22b、pet-23a、pet-24a、pet-25b、pet-26b、pet-27b、pet-28a、pet-29a、pet-30a、pet-31b、pet-32a、pet-33b、pet-34b、pet-35b、pet-37b、pet-39b、pet-40b、pet-41a、pet-42a、pet-43.1a、pet-44a、pet-45b、pet-47b、pet-48b、pet-49b、pet-50b、pet-51b、pet-52b、petduet-1、pacycduet-1、pcdfduet-1、prsfduet-1、pcoladuet-1的一种及其相关的改造载体；

14、所述表达菌株包括但不限于bl21、cbl21、bl21(de3)、bl21codonplus(de3)、bl21star(de3)、b834(de3)、tuner(de3)、rosetta(de3)、rosetta2(de3)、anta rctic express(de3)、origami(de3)、origami2(de3)、origamib(de3)、shuffle t7、er2566、overexpressc43(de3)、blr(de3)、hms174(de3)、gt115、mg1655、novablue(de3)的一种及其相关的改造菌株；

15、2)将步骤1)的fg-csf-h、fg-csf-lys-mut1-h、fg-csf-lys-mut2-h、fg-csf-lys-mut3-h蛋白进行peg化修饰与纯化；

16、所述peg化修饰为将peg溶解液分别与稀释后的蛋白以摩尔比(2～20)：1混合，进行避光反应，之后终止反应、纯化得到经peg修饰的peg-fg-csf-h、peg-fg-csf-lys-mut1-h、peg-fg-csf-lys-mut2-h、peg-fg-csf-lys-mut3-h蛋白；

17、所述peg溶解液为通过溶解分子量10-20kda的mpeg-spa得到，浓度为50～100mg/ml；

18、所述蛋白为采用ph5.5～7.0、10～40mmol/l的磷酸盐缓冲液进行稀释；

19、所述终止反应为采用胱氨酸搅拌反应，浓度为20～60mmol/l。

20、本发明还提供了一种猫粒细胞集落刺激因子聚乙二醇衍生物的应用，用于制备治疗白细胞减少相关疾病的药物。

21、本发明的有益效果如下：

22、本发明的猫粒细胞集落刺激因子突变体，为对成熟肽fg-csf进行氨基酸位点的突变得到，并进行了密码子偏嗜性优化，在大肠杆菌表达系统中，所述突变体的表达量更优，且具有高回收率、易于放大的特点，经表达、纯化复性后，具有高活性；

23、本发明猫粒细胞集落刺激因子聚乙二醇衍生物，利用大肠杆菌表达系统表达高产量的fg-csf，经peg修饰获得的长效fg-csf，且fg-csf突变体组的peg偶联效率高于未突变的fg-csf组，纯化后的fg-csf突变体及其peg偶联后较未突变的fg-csf组及peg偶联的蛋白具有更高的活性，同时经peg化修饰可明显延长fg-csf突变体及其突变体的半衰期，解决了现有犬g-csf用于猫的治疗上的一些异源反应，活性不高且半衰期较短的问题。