本发明涉及生物，尤其是涉及一种谷氨酸非依赖型γ-聚谷氨酸的生产方法。
背景技术：
1、γ-聚谷氨酸（γ-pga）是一种天然高分子聚合物，由d-谷氨酸和l-谷氨酸通过γ-酰胺键聚合而成，与不同种类氨基酸通过α-氨基和α-羧基之间的酰胺键连接成的蛋白质明显不同。
2、根据谷氨酸残基的组成，γ-pga可分为三类：d-谷氨酸均聚物（d-γ-pga）、l-谷氨酸均聚物（l-γ-pga）和由d-和l-谷氨酸组成的无规共聚物（d-l-γ-pga）。
3、γ-pga具有良好的生物相容性，离子吸附和生物降解性，对人体和环境无害等性质，常用于化妆品、食品加工、农业、医药、环保等领域。
4、生产γ-pga的芽孢杆菌可分成两类：需要外部供应谷氨酸的菌株生产γ-pga，即谷氨酸依赖型菌株；另一种是没有外部供应谷氨酸也能够产生γ-pga，为谷氨酸非依赖型菌株。
5、现阶段谷氨酸依赖性菌株的γ-pga产量较高，所以通常选择谷氨酸依赖性菌株进行发酵生产，如本公司2022年的发明专利cn114456980a公开过一种高产γ-聚谷氨酸的芽孢杆菌，该菌株命名为地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis) bcsw-11052，所述菌株已于2021年11月24日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为cgmcc no.23967；其中所产的高分子聚合物经分析鉴定为γ-聚谷氨酸。所述发明专利利用糖蜜作为碳源，添加外源谷氨酸情况下，单位体积发酵液中γ-pga含量可达86.3 g/l。但理论上添加外源谷氨酸增加了生产成本。谷氨酸非依赖型菌种生产γ-pga具有较大的潜在能力，并且谷氨酸非依赖型菌株生产γ-pga的研究有助于解析γ-pga的生物合成和调节机制。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供本发明旨在利用保藏号为cgmcc no.23967的地衣芽孢杆菌 (bacilluslicheniformis)生产谷氨酸依赖型γ-pga的基础上，开发出一种生产谷氨酸非依赖型γ-pga的生产方法，发酵得到谷氨酸非依赖型γ-pga 40.60 g/l。
2、本发明提供了一种谷氨酸非依赖型γ-聚谷氨酸的生产方法，使用地衣芽孢杆菌发酵生产谷氨酸非依赖型γ-聚谷氨酸，包括以下步骤：
3、(1)菌种活化：将地衣芽孢杆菌菌株转接至固体斜面lb培养基中活化；
4、(2)种子培养：将步骤（1）中活化的菌种转接至种子培养基中，进行种子培养，得到种子培养液；
5、(3)发酵培养：将步骤（2）制得的种子培养液接种到发酵培养基中发酵培养；
6、(4)γ-聚谷氨酸测定：将步骤(3)所得的发酵液离心后取上清液，使用流动相稀释100倍，经hplc法检测。
7、优选地，所述步骤（1）中，固体斜面培养基包括以下成分：胰蛋白胨10.00g/l、酵母浸粉5.00 g/l、氯化钠10.00 g/l、琼脂粉20.00 g/l，ph 7.2。
8、优选地，步骤（1）中，菌种活化的条件为：37℃恒温培养箱中培养14-16h。
9、优选地，所述步骤（1）中所述lb培养基于121℃灭菌20min。
10、优选地，步骤（2）中，所述种子培养基包括以下成分：葡萄糖 20.00g/l、酵母浸粉25.00g/l、k2hpo4·3h2o1.00 g/l、mgso4·7h2o 0.50 g/l。溶剂为去离子水，配成种子培养基后用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌20min。
11、优选地，步骤（2）中，种子培养的条件为：34-40℃、ph7.0-7.2的条件下、转速为180-240rpm振荡培养10-12小时；更优选地，步骤（2）中，种子培养的条件为：于37℃、ph7.0条件下，以振荡速度220rpm培养10h。
12、优选地，步骤（3）中，所述发酵培养基包括以下成分：葡萄糖10-70g/l、柠檬酸60-100g/l、酵母浸粉30-60g/l、蛋白胨10-30g/l、mgso4·7h2o1.00-1.6g/l、k2hpo4·3h2o 0.1-0.3 g/l、mnso4·h2o0.1-0.3g/l、znso4·7h2o 0.5-1.0g/l。ph 7.2，溶剂为去离子水，配成发酵培养基后用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌20min。
13、优选地，所述步骤（3）中种子液以7％-12％(v/v)接种量接种至发酵的培养基中。更优选地，种子液的接种量为8％-10％(v/v)。
14、优选地，步骤（3）中，所述步骤(3)的发酵培养为摇瓶发酵培养或发酵罐培养；
15、摇瓶发酵培养时，发酵培养条件为：温度为34-40℃、ph为7.0-7.2、转速200-220rpm的条件下培养72～96h；
16、发酵罐培养时，发酵培养条件为：温度为34-40℃、罐压0.02-0.05mpa、通风比1:1～1:1.5、ph为6.3-7.8的条件下，转速300～450rpm培养60～96h；本申请中通风比是指每分钟通气量和发酵液体积之比，如3l发酵液，通风比为1:1.25，通风量就是3.75l/min。
17、更优选地，发酵罐培养时，发酵培养的条件为：温度为37℃、ph为7.2，在发酵前20h过程中，ph会显著下降，当ph值低于6.0时，用6m的naoh溶液调节ph到6.3，即保证ph值不能小于6.3，20h之后不用再干涉发酵罐内的ph值，其会缓慢上升，直至7.5左右基本稳定，转速为400rpm、通风比1：1.25的条件下培养72小时。
18、优选地，所述步骤(4)中，使用hplc法检测γ-聚谷氨酸产量的方法为：波长210nm，流动相为：0.05mol/l硫酸钠溶液，收集步骤(3)的发酵液，将发酵液在15000rpm条件下离心20min，取上清1ml使用流动相稀释至50ml，过膜，检测单位体积发酵液中γ-pga含量。
19、本发明的有益效果是：
20、本发明以保藏号为cgmcc no .23967的地衣芽孢杆菌（bacillus licheniformis）为出发菌株，通过对发酵培养基的调控，配制出适合谷氨酸非依赖型聚谷氨酸合成的培养基，改变温度从而影响聚谷氨酸合成酶的活性，控制转速和通风从而确定溶氧，控制发酵ph，最终提高γ-聚谷氨酸产量。与其它谷氨酸非依赖型菌株相比，本发明γ-聚谷氨酸产量较高，所用工艺简单，且所用菌株地衣芽孢杆菌cgmcc no.23967既可生产谷氨酸依赖型γ-聚谷氨酸又可生产谷氨酸非依赖型γ-聚谷氨酸。
1.一种谷氨酸非依赖型γ-聚谷氨酸的生产方法，其特征在于，使用保藏号为cgmccno.23967的地衣芽孢杆菌发酵生产谷氨酸非依赖型γ-聚谷氨酸，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的谷氨酸非依赖型γ-聚谷氨酸的生产方法，其特征在于，步骤（1）中活化条件为37℃恒温培养箱中培养14-16h。
3.根据权利要求1所述的谷氨酸非依赖型γ-聚谷氨酸的生产方法，其特征在于，步骤（2）中所述种子培养基为：葡萄糖20g/l、酵母浸粉25g/l、k2hpo4·3h2o1g/l、mgso4·7h2o0.5g/l，溶剂为去离子水。
4.根据权利要求1所述的谷氨酸非依赖型γ-聚谷氨酸的生产方法，其特征在于，步骤（2）中种子培养的条件为：34-40℃、ph7.0-7.2的条件下、转速为180-240rpm振荡培养10-12小时。
5.根据权利要求1所述的谷氨酸非依赖型γ-聚谷氨酸的生产方法，其特征在于，步骤（3）中种子液以7％-12％(v/v)接种量接种至发酵的培养基中。
6.根据权利要求1所述的谷氨酸非依赖型γ-聚谷氨酸的生产方法，其特征在于，步骤（3）中发酵培养方法为摇瓶发酵培养或发酵罐培养。
7.根据权利要求6所述的谷氨酸非依赖型γ-聚谷氨酸的生产方法，其特征在于，摇瓶发酵培养时，发酵培养条件为：在温度34-40℃、ph为7.0-7.2、转速200-220rpm的条件下培养72～96h。
8.根据权利要求6所述的谷氨酸非依赖型γ-聚谷氨酸的生产方法，其特征在于，发酵罐培养时，发酵培养条件为：温度为34-40℃、罐压0.02-0.05mpa、通风比1:1～1:1.5、ph为6.3-7.8的条件下，转速300～450rpm培养60～96h。
9.根据权利要求8所述的谷氨酸非依赖型γ-聚谷氨酸的生产方法，其特征在于，所述发酵罐培养的条件为：发酵温度为37℃、初始ph为7.2，在发酵前20h过程中，当ph值低于6.0时，调节ph到6.3、转速为400rpm、通风比1：1.25的条件下培养72小时。