磷酸化MET和甲基化PTPRO作为生物标志物的应用的制作方法

本发明涉及恶性肿瘤领域，特别涉及磷酸化met和甲基化ptpro作为生物标志物的应用。

背景技术：

1、恶性肿瘤是威胁人类健康的一大杀手，是目前造成人类的死亡的最主要原因之一。恶性肿瘤的发生常伴随着基因的突变和扩增，肿瘤中基因的突变和扩增已成为肿瘤靶向治疗的重要靶点。而检测基因突变和扩增也成为临床上靶向药物筛选的伴随诊断指标，并且在临床上获得了一定的治疗成效。然而，目前在该领域上也面临着一系列的困境。比如一些正常组织细胞中(包括食管，皮肤，肺组织等)也存在相当数量的基因突变(包括肿瘤驱动基因突变)，因此基因突变不是肿瘤细胞所独有的，其也存在于正常的组织细胞中，故针对基因突变的靶向治疗也会“误伤”到某些正常的组织。另外，一些肿瘤的突变率很低甚至不出现突变，突变的基因不作为驱动肿瘤发生发展进程的关键，突变和扩增基因与患者预后无关。以c-met为例，c-met原癌基因是由一位非常著名的美国科学家vande woude于1984年发现，并在当时掀起一股热潮。c-met是一种由该基因编码的蛋白产物，为肝细胞生长因子受体，具有酪氨酸激酶活性，与多种癌基因产物和调节蛋白相关，参与细胞信息传导、细胞骨架重排的调控，是细胞增殖、分化和运动的重要因素。当时大家都认为c-met会跟egfr一样引起肿瘤靶向药物的巨大变革。目前已有大分子药物(onartuzumab)和小分子药物(arq197)在招募的met阳性的晚期非小细胞肺癌患者ⅲ期临床实验中并未看到很好的临床获益。在近期新出现卡马替尼(capmatinib)在用于治疗携带met基因外显子14跳跃突变的晚期非小细胞肺癌上有着惊艳的表现,美国fad加速批准了其在美国的上市。可见前期临床实验单纯以met阳性作为靶向met治疗药物的使用标准是可能造成结果不如人意的重要原因。其次在众多肿瘤中c-met基因的突变和扩增的频率并不高，在非小细胞肺癌中突变率5.42％，扩增率1.67％；在肺腺癌中突变率3.53％，扩增率1.41％；和在胃癌中突变率1.58％，扩增率2.93％；除此之外的很多肿瘤中c-met的突变很低，如乳腺癌中突变率0.73％，扩增率0.1％；在肝癌中突变率0.53％，扩增率3.45％；尤其在食管鳞癌中突变率仅0.72％，且极少出现扩增。我们也进一步发现在食管癌中met的突变和扩增与病人的预后无明显相关性。再者就是目前使用靶向治疗药物的评价标准不恰当导致临床出现上针对某基因突变和扩增开发的通路抑制药物出现耐药等问题，以及在靶向药物的临床应用过程中常常会发现没有检测到靶基因的变异但患者仍然对靶向治疗有反应的情况。例如在c-met突变和扩增基础上开发出的一系列靶向c-met通路的抑制剂多数临床试验都未能证明其有效性，且临床应用出现耐药等问题。在评价met靶向药物反应性的时候有的临床试验甚至不以met基因扩增为标准而是将met过表达为标准。而研究表明met基因扩增和蛋白过表达之间并不完全一致。已知有18.9％的病例检测到了met基因扩增但其蛋白表达却是降低的。相反，也存在无met基因变异(包括扩增、突变)，但代表其功能活性的磷酸化蛋白高表达的情况。针对这类突变非依赖肿瘤，仅仅检测基因突变和扩增，不能精准指导c-met靶向用药。

2、以上证据表明单纯依靠基因突变作为评定治疗方式的标准，不适合目前精准医疗。因此针对以上的存在的问题，特别是突变非依赖的肿瘤，我们急需一种更为适合的筛选病人使用met靶向治疗方式的手段，发现新的反映met活性和选择met抑制剂的良好指标。

技术实现思路

1、本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，基于发明人研究发现多种肿瘤中(肺癌、乳腺癌、胃癌、肝癌、食管癌)存在较高比例的met过磷酸化现象且进一步研究发现met磷酸化的升高是由于ptpro甲基化进而表达下调引起的，提供一种定量检测生物标志物的试剂或包括该试剂的产品在制备预测癌症患者的预后的工具中的应用；

2、本发明的第二目的在于提供一种定量检测生物标志物的试剂或包括该试剂的产品在制备检测met靶向药物治疗的适用性的工具中的应用。

3、本发明的第三目的在于提供一种定量检测生物标志物的试剂或包括该试剂的产品在制备筛选适用met靶向药物治疗的癌症患者的工具中的应用。

4、本发明的目的通过下述技术方案实现：

5、定量检测生物标志物的试剂或包括该试剂的产品在制备预测癌症患者的预后的工具中的应用；

6、所述的生物标志物包括磷酸化met和甲基化ptpro中的至少一种。

7、进一步地，所述的癌症包括食管癌。

8、进一步地，所述的定量检测磷酸化met的试剂为相对定量癌组织中的磷酸化met的试剂。

9、进一步地，所述的定量检测甲基化ptpro的试剂为相对定量癌症患者外周血中的dna的甲基化ptpro的试剂。

10、一种癌症患者预后的预测系统，包括：信息获取模块和预测模块；

11、所述的信息获取模块用于获得受试者的检测信息；

12、所述的预测模块用于分析信息获取模块获取的信息，并显示标志物的量为高或低；所述的标志物为磷酸化met和甲基化ptpro中的至少一种；当磷酸化met的量高低和/或甲基化ptpro的量低时预测癌症患者的预后好，当磷酸化met的量高和/或甲基化ptpro的量高时，预测癌症患者的预后差。

13、进一步地，所述检测信息包括：从外周血提取的dna的实时荧光甲基化特异性聚合酶链式反应结果信息和免疫组化染色后的食管癌组织切片的免疫组化评分结果信息中的至少一种。

14、进一步地，所述的分析信息获取模块获取的信息，为分析从外周血提取的dna的实时荧光甲基化特异性聚合酶链式反应结果信息和/或分析免疫组化染色后的食管癌组织切片的免疫组化评分结果信息；

15、所述的分析免疫组化染色后的食管癌组织切片的免疫组化评分结果信息，包括以下步骤：

16、根据细胞染色强度评分为4级，无阳性着色(阴性)计0分，淡黄色(弱阳性)计1分，棕黄色(阳性)计2分，棕褐色(强阳性)计3分；根据阳性细胞百分比评为4级，≤25％计1分，26％-50％计2分，51％-75％计3分，＞75％计4分，将两项评分相乘得出最终评分结果；

17、当免疫组化评分大于等于6分时，磷酸化met的量高；当免疫组化评分小于6分时，磷酸化met的量低；

18、所述的分析从外周血提取的dna的实时荧光甲基化特异性聚合酶链式反应结果信息，包括以下步骤：

19、当甲基化特异引物扩增出显示明显的目的条带，非甲基化特异引物未扩增出显示明显条带时，甲基化ptpro的量高；当甲基化特异引物未扩增出显示明显的目的条带，非甲基化特异引物扩增出显示明显条带时，甲基化ptpro的量低。

20、进一步地，所述的预后好定义为生存时间超过36个月，所述的预后差定义为生存时间少于36个月。

21、一种预测癌症患者的预后的试剂盒，包括定量检测甲基化ptpro的试剂和定量检测磷酸化met的试剂的至少一种。

22、所述的定量检测甲基化ptpro的试剂包括dna提取试剂、重亚硫酸盐转化试剂和甲基化特异性聚合酶链式反应的试剂。

23、进一步地，所述甲基化特异性聚合酶链式反应的试剂包括甲基化特异性引物：

24、hptpro-mf1：5’-cgtttttggaggatttcgggc-3’；和

25、hptpro-mr1：5’-aaaacacgactacgctaacg-3’。

26、进一步地，所述甲基化特异性聚合酶链式反应的试剂包括非甲基化特异性引物：

27、hptpro-uf1：5’-atgtttttggaggattttgggt-3’；和

28、hptpro-ur1：5’-ataccccatcactacacaaaca-3’。

29、定量检测生物标志物的试剂或包括该试剂的产品在制备检测met靶向药物治疗的适用性的工具中的应用；所述的生物标志物包括磷酸化met和甲基化ptpro中的至少一种。

30、进一步地，所述的癌症包括食管癌。

31、进一步地，所述的定量检测磷酸化met的试剂为相对定量癌组织中的磷酸化met的试剂。

32、进一步地，所述的定量检测甲基化ptpro的试剂为相对定量癌症患者外周血中的dna的甲基化ptpro的试剂。

33、定量检测生物标志物的试剂或包括该试剂的产品在制备筛选适用met靶向药物治疗的癌症患者的工具中的应用；所述的生物标志物包括磷酸化met和甲基化ptpro中的至少一种。

34、进一步地，所述的癌症包括食管癌。

35、进一步地，所述的定量检测磷酸化met的试剂为相对定量癌组织中的磷酸化met的试剂。

36、进一步地，所述的定量检测甲基化ptpro的试剂为相对定量癌症患者外周血中的dna的甲基化ptpro的试剂。

37、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

38、(1)本发明发现了新的标志物可以预测癌症患者的预后，标志物包括磷酸化met和甲基化ptpro中的至少一种；可以通过定量检测该标志物。

39、(2)本发明发现了新的标志物可以反映癌细胞对于met靶向药物的敏感性，可以通过定量检测该标志物检测met靶向药物治疗的适用性，筛选更适用met靶向药物治疗的癌症患者，可以用于可以找到应用met抑制剂的最合适人群，可以指导恶性肿瘤临床个体化、精准化用药；相比于目前以met突变、扩增为指标，结果更加准确。