一种肿瘤组织高质量单细胞悬液制备的方法与流程

本发明属于细胞悬液制备，具体为一种肿瘤组织高质量单细胞悬液制备的方法。

背景技术：

1、肿瘤是机体在各种致癌因素作用下,遗传物质受损，导致特定细胞失去对正常生长调控,引起其克隆性异常增生而形成的恶性赘生物。随着单细胞分离技术及单细胞测序技术日益成熟,单个肿瘤细胞全基因组测序已成为肿瘤研究的一个崭新的领域。肿瘤尤其是恶性肿瘤已成为威胁人类健康的最严重疾病之一，常表现为局部肿块。肿瘤转移是导致肿瘤患者死亡的主要原因之一,相同的治疗方案在同一肿瘤患者之间的疗效差异很大,造成这一现象的原因是恶性肿瘤之间的分子分型存在差异。随着精准医疗时代的到来,循环肿瘤细胞(ctc)检测技术应运而生,人类对恶性肿瘤的检测达到单细胞水平。通过单个肿瘤细胞的测序，我们可以更加直接的了解肿瘤的起源、肿瘤的生长规律，以及认识各种肿瘤细胞之间以及个体之间存在差异的起因和解释肿瘤产生的机制。我们研究各类肿瘤细胞的基因组图谱，希望找出恶性细胞在基因组水平是否存在统一结构，但是面对肿瘤异质性的这些问题仍然束手无策。同时肿瘤的异质性是导致肿瘤耐药性问题的原因。如果能从单个肿瘤细胞水平对肿瘤单细胞进行测序，并找出一个肿瘤在单个细胞上的共同结构，揭露出每个肿瘤细胞的突变规律，这将为药物研究、肿瘤的靶向治疗提供基础。当然，必须首先对大量的肿瘤细胞基因组完成测序工作，只有在发现了功能突变位点之后，单个肿瘤基因组测序才能为肿瘤治疗提供帮助。虽然目前出现了一系列的细胞分离技术，例如高级流式细胞术，利用肿瘤标志物分离肿瘤细胞，但是前提是需要把肿瘤组织解离成高质量的单细胞悬液，而面对不同部位的肿瘤组织得到高质量的单细胞悬液是目前分离肿瘤细胞的限制因素。

2、本发明基于肿瘤组织的特点，研发了肿瘤组织消化解离制备单细胞悬液的方案。采用本发明消化解离肿瘤组织，实验结果发现制备的单细胞样本质量符合单细胞测序的要求。因此，在本技术的基础上可以拓展对肿瘤单细胞研究的层面，广泛应用于单细胞测序领域以及生物医疗领域。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种肿瘤组织高质量单细胞悬液制备的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种肿瘤组织高质量单细胞悬液制备的方法，

3、s1.在离心管中用配置dmem配制解离混合酶；

4、s2.将肿瘤组织转移至加入dmem培养基的培养皿中并将肿瘤外的非目标组织剔除干净，再肿瘤组织剪切成2mm直径大小的组织块，用pbs缓冲液清洗1-2次；

5、s3.吸取肿瘤组织颗粒至配制好解离混合酶的离心管中并封口，置于恒温水浴震荡仪中孵育15-30min，每5min用宽口枪头吹打组织一轮，每轮吹打6-10次，质满足收集需求时，酶液依次过70μm和30μm细胞筛，后将酶液离心富集细胞，用含1％ fbs的培养基重悬细胞；

6、s4.将酶液4℃500g离心5分钟富集细胞，弃上清获取细胞沉淀；

7、s5.用pbs缓冲液或培养基重悬细胞沉淀后计数，判断细胞质量，如果有小碎片可用5％ fbs清洗一次。

8、优选的，所述pbs缓冲液不含钙离子和镁离子。

9、优选的，s4中的培养基为rpmi-1640培养基或高糖型dmem培养基。

10、优选的，所述解离混合酶为由胶原酶和中性蛋白酶组成的混合酶。

11、优选的，所述解离混合酶由以下5种酶混合构成：

12、终浓度为0.5mg/ml的胶原蛋白酶ⅰ，

13、终浓度为0.4mg/ml的胶原蛋白酶ⅱ，

14、终浓度为0.5mg/ml的中性蛋白酶，

15、终浓度为0.8mg/ml的链霉蛋白酶，

16、终浓度为0.5mg/ml的dnaseⅰ。

17、优选的，s3中，孵育的过程中，取孵育10分钟的酶液上清计数，如细胞数目不满足收集需求，须继续消化15min。

18、优选的，s3中，针对质地坚硬的肿瘤组织没轮吹打8-10次。

19、优选的，其在肿瘤单细胞的富集、单细胞测序、构建动物模型、构建细胞系、原代细胞培养和cat治疗上的应用。

20、本发明的有益效果如下：

21、本发明通过高质量肿瘤单细胞悬液制备方法富集的肿瘤单细胞具有总量多、活率高、有核率高，结团率低的特点，其推动了肿瘤单细胞测序，细胞培养方面的研究；保留了肿瘤组织的细胞异质性，解决了由肿瘤组织获取高质量单细胞悬液，全面兼容肿瘤细胞类型的难题，为研究肿瘤单细胞基因表达提供了新的技术助力，降低了肿瘤样本研究成本，加快肿瘤科疾病相关的研究。

技术特征：

1.一种肿瘤组织高质量单细胞悬液制备的方法，其特征在于：

2.根据权利要求1所述的一种肿瘤组织高质量单细胞悬液制备的方法，其特征在于：所述pbs缓冲液不含钙离子和镁离子。

3.根据权利要求1所述的一种肿瘤组织高质量单细胞悬液制备的方法，其特征在于：s4中的培养基为rpmi-1640培养基或高糖型dmem培养基。

4.根据权利要求1所述的一种肿瘤组织高质量单细胞悬液制备的方法，其特征在于：所述解离混合酶为由胶原酶和中性蛋白酶组成的混合酶。

5.根据权利要求5所述的一种肿瘤组织高质量单细胞悬液制备的方法，其特征在于：所述解离混合酶由以下5种酶混合构成：

6.根据权利要求1所述的一种肿瘤组织高质量单细胞悬液制备的方法，其特征在于：s3中，孵育的过程中，取孵育10分钟的酶液上清计数，如细胞数目不满足收集需求，须继续消化15min。

7.根据权利要求1所述的一种肿瘤组织高质量单细胞悬液制备的方法，其特征在于：s3中，针对质地坚硬的肿瘤组织没轮吹打8-10次。

技术总结
本发明属于细胞悬液制备技术领域，且公开了一种肿瘤组织高质量单细胞悬液制备的方法，S1.在离心管中用配置DMEM配制解离混合酶；S2.将肿瘤组织转移至加入DMEM培养基的培养皿中并将肿瘤外的非目标组织剔除干净，再肿瘤组织剪切成2mm直径大小的组织块，用PBS缓冲液清洗1‑2次；S3.吸取肿瘤组织颗粒至配制好解离混合酶的离心管中并封口，置于恒温水浴震荡仪中孵育15‑30min，每5min用宽口枪头吹打组织一轮，每轮吹打6‑10次，质满足收集需求时，酶液依次过70μm和30μm细胞筛，后将酶液离心富集细胞，用含1％FBS的培养基重悬细胞；S4.将酶液4℃500g离心5分钟富集细胞，弃上清获取细胞沉淀。本发明富集的肿瘤单细胞具有总量多、活率高、有核率高，结团率低的特点。

技术研发人员：王国荣,张朝政,潘越,杜尧,杨晶文
受保护的技术使用者：上海新开源精准医疗有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15