活细胞产品保存液及其制备、使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及细胞培养领域，尤其设及一种活细胞产品保存液及其制备、使用方法。
【背景技术】
[0002] 活细胞产品一般指经体外诱导培养得到或直接从体内采集得到的具有一定治疗、 保健等功效的活体细胞。目前最常见的活细胞产品为干细胞和免疫细胞，也包括神经细胞、 肝细胞等人体活细胞。
[0003] 随着对干细胞和免疫细胞功能作用的开发和疾病治疗的研究，特别是免疫细胞对 肿瘤疾病的治疗效果的凸显，干细胞或免疫细胞等活细胞的临床应用也日趋广泛。干细胞、 免疫细胞等活细胞在回输前的保存至关重要，特别设及到活细胞的长途运输，如何保证活 细胞的活率和稳定性，是细胞治疗效果的关键。
[0004] 在W往的活细胞运输中设及到的保存液主要有如下几种方案：
[0005] 方案1、用生理盐水作为保存液直接在常溫或2-8°C低溫保存；
[0006] 方案2、在无菌水中添加一定浓度比例的化CUKC1、巧樣酸钢、葡萄糖、CaCb、白蛋 白、氨基酸和维生素；
[0007] 方案3、保存液中W生理盐水、憐酸盐缓冲液等为溶液介质，同时添加一定浓度比 例的白蛋白、肝素、维生素；
[000引方案4、在保存基础液中添加一定浓度比例的白蛋白、葡萄糖、维生素 C，保存基础 液为复方电解质注射液与复方氨基酸注射液按1:1-1:2体积比配制而成。
[0009] 现有保存液有很多不足之处。如方案1单纯W生理盐水作为保存液时，没有维持细 胞代谢的营养成分和维持细胞稳定性的成分，故不能长时间保存活细胞，在24h之后细胞活 率下降明显。方案2-4都通过添加维生素来维持细胞代谢的稳定性和清除细胞代谢产生的 自由基等氧化物质，而维生素在空气或水溶液中容易失去抗氧化性，也不能过长时间保存 细胞，且无菌密封保存的活细胞在代谢过程中引起保存液的酸碱度变化也会对细胞造成影 响。
【发明内容】
[0010] 有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种活细胞产品保存液及其制备、使用方 法。
[0011] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0012] 活细胞产品保存液，包含下述组分:儿茶素、葡萄糖、人血白蛋白、碳酸氨钢和保存 基础液，所述保存基础液由0.9 %氯化钢溶液和复方电解质溶液组成。
[0013] 优选地，所述活细胞产品保存液包含下述质量百分浓度的下述组分:儿茶素0.5-5%，葡萄糖1-10%，人血白蛋白1-5%，碳酸氨钢1-10% ;余量为保存基础液，所述保存基础 液由0.9%氯化钢溶液和复方电解质溶液按照1:1-5:1体积比组成。
[0014] 优选地，所述活细胞产品保存液包含下述质量百分浓度的下述组分：儿茶素2- 5%，葡萄糖5-10%，人血白蛋白3-5%，碳酸氨钢5-10% ;余量为保存基础液，所述保存基础 液由0.9%氯化钢溶液和复方电解质溶液按照1:1-5:1体积比组成。
[0015] 优选地，所述活细胞产品保存液包含下述质量百分浓度的下述组分:儿茶素4%， 葡萄糖8 %，人血白蛋白3 %，碳酸氨钢8 % ;余量为保存基础液，所述保存基础液由0.9 %氯 化钢溶液和复方电解质溶液按照1:1-5:1体积比组成。
[0016] 优选地，所述保存基础液由0.9%氯化钢溶液和复方电解质溶液按照1:1-3:1体积 比组成。
[0017] 优选地，所述复方电解质溶液包含氯化钢、葡萄糖酸钢、醋酸钢、氯化钟和氯化儀。
[0018] 更优选地，所述复方电解质溶液由下述质量百分浓度的下述组分组成：氯化钢 5.26%、葡萄糖酸钢5.02%、醋酸钢3.68%、氯化钟0.37%、氯化儀0.30%，水余量。
[0019] 优选地，所述儿茶素通过W下方法制备：
[0020] SOI、浸提：称取一定量茶叶，娠碎过20皿滤网，加入其重量15-25倍70-90°C的热 水，揽拌下恒溫浸提20-60min，过滤得到茶叶浸提液；
[0021] S02、盐析：向上述茶叶浸提液中加入氯化钢，使氯化钢的质量分数为2-6%，静置 盐析0.5-1.化后过滤；
[0022] S03、沉淀：向上述滤液中加入茶叶重量2-5%的亚硫酸氨钢，然后加入茶叶重量 15-25%的硫酸侣饱和水溶液，加热至70-80°C，用质量百分浓度10-20%的碳酸氨钢溶液在 快速揽拌下调节pH至5-6,大量沉淀析出，沉淀自然沉降一段时间后过滤，最后用等体积70 °0的热水洗涂沉淀3次；
[0023] S04、酸溶:将沉淀在快速揽拌下加入抑2.5-4.5盐酸水溶液中溶解，所述盐酸水溶 液的重量为茶叶重量的1-3倍，控制酸转溶液pH为2.5-4.5，酸溶时间IO-SOmin;
[0024] S05、萃取：向酸转溶液中加入茶叶重量2-5%的碳酸氨钢，然后用其体积0.3-1.5 倍的乙酸乙醋萃取3-5次，每次萃取时间2-lOmin，合并萃取液；
[0025] S06、洗涂：向萃取液体积0.4倍的水中加入茶叶重量1-3%的维生素 C，用巧樣酸调 节水溶液抑至2.5-3.0，等分成2份对乙酸乙醋萃取液洗涂2次；
[00%] S07、浓缩蒸发:将洗涂后的乙酸乙醋相在50-70°C下真空蒸发回收乙酸乙醋，待浓 缩成膏状物时，加入膏状物体积2倍的无水乙醇洗涂挂在壁上的物料，继续浓缩成稠的膏状 物；
[0027] S08、干燥:将膏状物放入真空干燥箱中，在60-90°C下真空干燥至物料成粉末或干 的块状。
[0028] 本发明活细胞产品保存液的制备方法，包括W下步骤:将0.9%氯化钢溶液和复方 电解质溶液按体积比1:1-5:1混匀制得保存基础液；向基础保存液中加入儿茶素、葡萄糖、 人血白蛋白、碳酸氨钢，使儿茶素的质量百分浓度为0.5-5%，葡萄糖的质量百分浓度为1-10%，人血白蛋白的质量百分浓度为1-5%，碳酸氨钢的质量百分浓度为1-10%，过滤除菌 制得本发明活细胞产品保存液。
[0029] 优选地，本发明活细胞产品保存液的制备方法，包含W下步骤：
[0030] S11、0.9%氯化钢溶液和复方电解质溶液按体积比1:1-5:1混匀制得保存基础液；
[0031] S12、向保存基础液中加入儿茶素，儿茶素的质量百分浓度为0.5-5% ,0.22皿滤膜 过滤；
[0032] S13、上步骤S12过滤后的溶液中加入葡萄糖、人血白蛋白和碳酸氨钢，使葡萄糖的 质量百分浓度为1-10%，人血白蛋白的质量百分浓度为1-5%，碳酸氨钢的质量百分浓度为 1-10%，制得保存液。
[0033] 上述活细胞产品保存液保存细胞的使用方法，包括W下步骤:使用本发明活细胞 产品保存液重悬细胞，细胞浓度为0.5 X IO7Cells/ml-5 X IO7CelIs/ml，常溫保存0-72h。
[0034] 优选地，所述常溫为15-30°C。
[0035] 优选地，所述细胞为免疫细胞。
[0036] 儿茶素又称儿茶精、茶单宁，为黄烧醇的衍生物。儿茶素最初由儿茶中提取出，为 无色结晶形固体;能溶于水，和咖啡因同属茶叶中的两大重要机能性成分，但是又W儿茶素 为茶汤中最主要的成分。儿茶素是良好的自由基清理成分，是天然的油脂抗氧化剂，抗氧化 活性甚至比维他命E还高。儿茶素清理细胞代谢产生的自由基W保护细胞膜，延缓细胞老化 或死亡。另外儿茶素类中其他化合物如没食子儿茶素等也都有类似的立体异构体，它们在 热水溶液中容易发生差向异构化作用或变旋作用而相互转化。儿茶素类可与糖结合成巧或 与有机酸缩合为醋类而存在。所W活细胞在溶液中能长时间保持活性。
[0037] 人血白蛋白是肝脏分泌的一种蛋白，通常从人体血浆中提取，经一定溫度和时间 处理灭活病毒后获得，在细胞保存运输中能起到防止细胞结团和维持细胞膜稳定性的作 用，也可W维持细胞液渗透压的稳定。碳酸氨钢(化肥化)溶液是一种缓冲液，对保存液的酸 碱度具有很好的缓冲作用。
[0038] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0039] 1、本发明活细胞产品保存液添加了儿茶素、人血白蛋白和碳酸氨钢，减小了细胞 代谢过程对pH变化的影响，利于维持细胞膜稳定性，可W用于活细胞长时间保存，活细胞经 本发明保存液保存72h后仍具有高活性和高活率。
[0040] 2、本发明活细胞产品保存液可W在常溫下保存活细胞，不需要低溫运输环境，是 活细胞产品的运输更简便。
[0041] 3、本发明活细胞产品保存液组分简单，制备简便，可W使用0.9%氯化钢溶液可W 使用0.9%氯化钢注射液，复方电解质溶液可W使用复方电解质注射液，便于本发明保存液 快速大规模配制。
【附图说明】
[0042] 图1为使用对比例1所述的保存液保存4她后MT细胞的流式检测图。
[0043] 图2为使用实施例4所述的保存液保存4她后MT细胞的流式检测图。
【具体实施方式】
[0044] 为了更好的说明本发明，下面结合附图和具体实施例做进一步说明。本发明中所 用试剂或仪器均可由市场购得，使用的检测方法第都是本领域所熟知的，在此不再寶述。
[0045] 为了便于本发明保存液的配制，本发明中的质量百分浓度0.9%氯化钢溶液和复 方电解质溶液均使用注射液。本发明中使用的人血白蛋白、葡糖糖、0.9%氯化钢溶液和复 方电解质注射液均购自广州医药生物科技有限公司。其中每升复方电解质溶液含有氯化钢 5.26g、葡萄糖酸钢5.02g、醋酸钢3.68g、氯化钟0.37g、氯化儀0.30g。
[0046] 儿茶素可由茶叶提取，也可使用直接由市场上购买茶多酪成品（儿茶素约占茶多 酪中的60-80%)，如:弟胡天远科技开发有限责任公司的的茶多酪98。
[0047] 实施例1
[004引一种活细胞产品保存液，包含下述质量百分浓度的下述组分:儿茶素0.5 %，葡萄 糖1 %，人血白蛋白1 %，碳酸氨钢1 %;余量为保存基础液，所述保存基础液由0.9 %氯化钢 注射液和复方电解质注射液按照1:1体积比组成。
[0049]本实施例中使用的儿茶素通过W下方法制备：
[(K)加]SOI、浸提：称取一定量茶叶，娠碎过20皿滤网，加入其重量15-25倍70-90°C的热 水，揽拌下恒溫浸提20-60min，过滤得到茶叶浸提液；
[0051] S02、盐析：向上述茶叶浸提液中加入氯化钢，使氯化钢的质量分数为2-6%，静置 盐析0.5-1.化后过滤；
[0052] S03、沉淀：向上述滤液中加入茶叶重量2-5%的亚硫酸氨钢，然后加入茶叶重量 15-25%的硫酸侣饱和水溶液，加热至70-80°C，用质