一种非洲猪瘟病毒抗原表位多肽及ELISA抗体检测试剂盒的制作方法

本发明属于生物检测。

背景技术：

1、非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(african swine fever virus，asfv)引起猪(包括家猪和野猪)的一种急性、热性、高度接触性传染病，临床上以高热、网状内皮系统出血和高死亡率为特征，给世界养猪业造成了严重损失。世界动物卫生组织(woah)将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为a类动物传染病。由于asfv感染机制复杂，目前为止仍缺乏有效的asf疫苗可以用于预防及治疗，因此，建立精准的诊断和检测技术对于asf的防控至关重要。然而，asf引起的非特异性临床症状与猪瘟等常见猪病难以区分。oie推荐的如病毒分离、抗原鉴定(红细胞吸附试验、荧光抗体试验和pcr)和血清学试验(酶联免疫吸附试验、间接荧光抗体试验、免疫过氧化物酶试验和免疫印迹试验)等诊断方法均需要熟练的技术人员在实验室条件下操作完成，并需配置有昂贵的仪器设备，导致在资源有限、条件较差的基层和偏远地区，无法对asf做出及时准确的诊断，致使疫情难以有效控制。

2、asfv是一种有囊膜的双链dna病毒，属于非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属成员，病毒粒子平均直径200nm左右，基因组全长约170-194kb，编码至少125种病毒蛋白，其中结构蛋白34种以上。在主要的结构蛋白中，由b646l基因编码的p72蛋白是asfv的主要衣壳蛋白，参与asfv的吸附和侵入过程，具有重要抗原性和免疫原性，常被用作asfv的诊断抗原。p72蛋白适用于感染晚期检测，首次在感染后9天可检测，pp62蛋白为p35蛋白和p15蛋白的多聚蛋白前体，参与病毒核心的装配，形成于病毒感染早期，pp62抗原检测灵敏性和特异性高，检测效果优于p30、p54。

3、目前，国内主要通过荧光定量pcr对asfv进行定性检测，但自然弱毒株或一过性感染后生猪的抽检血液检测结果时会出现呈阴性的假象，不能有效及时发现病猪。因此，临床急需快速准确、易于操作、便于现场诊断的asf抗体检测技术。

技术实现思路

1、本发明目的在于提供一种非洲猪瘟病毒抗原表位多肽，同时提供采用抗原表位多肽为包被抗原的elisa抗体检测试剂盒是本发明的另一发明目的。

2、基于上述目的，本发明采取以下技术方案：

3、一种非洲猪瘟病毒抗原表位多肽，抗原表位多肽由非洲猪瘟病毒p72蛋白抗原表位多肽和pp62蛋白抗原表位多肽组成，p72蛋白抗原表位多肽序列为nksygkpdpeptlsqi，位置37-52aa；pp62蛋白抗原表位多肽序列为dflytaipeekvggne，位置450-465aa。

4、抗原表位多肽基于生物信息学方法和人工化学合成技术制得。

5、一种非洲猪瘟病毒合成肽elisa抗体检测试剂盒，试剂盒包括包被有抗原表位多肽的酶联反应板。

6、酶联反应板包被抗原表位多肽的方法：将p72蛋白抗原表位多肽和pp62蛋白抗原表位多肽按照一定质量比例溶于包被液后(抗原表位多肽浓度1200-1800ng/ml)，添加到酶联反应板的孔中，每孔包被量100μl(抗原表位多肽的包被量120-180ng/孔)，静置，加入封闭液，封闭、干燥、密封保存；p72蛋白抗原表位多肽和pp62蛋白抗原表位多肽的质量比为(1-2)∶1。

7、试剂盒还包括酶标二抗、样品稀释液、洗涤液、显色液、终止液、阳性对照血清、阴性对照血清中的一种或多种。

8、所述包被液为ph9.6的碳酸盐溶液；封闭液为含有10mg/ml的牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，封闭液的添加量为300μl/孔；酶标二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗猪igg抗体；所述酶联反应板为可拆卸96孔酶标板；显色液包括显色液a和显色液b。

9、所述显色液a为含0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸-磷酸盐缓冲液；显色液b为0.2mg/ml的四甲基联苯胺溶液；终止液为2mol/l的硫酸溶液。

10、所述样品稀释液为含5mg/ml酪蛋白的磷酸盐缓冲液；洗涤液为含体积百分比浓度0.8～1.2％tween-20的磷酸盐缓冲液。

11、所述磷酸盐缓冲液的摩尔浓度为0.01mol/l，ph值为7.4。

12、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

13、1)本发明采用生物信息学方法对非洲猪瘟病毒p72和pp62蛋白的抗原表位进行精确分析，筛选出适合elisa检测用的肽段，该肽段具有灵敏性高、特异性强的优点。

14、2)本发明利用非洲猪瘟病毒p72和pp62蛋白抗原表位多肽作为包被抗原，制成的试剂盒，能够有效检测被检动物是否感染非洲猪瘟病毒，经试验证明，该试剂盒特异性强、敏感性高和重复性好，有利于我国非洲猪瘟病毒防控体系的建立。

技术特征：

1.一种非洲猪瘟病毒抗原表位多肽，其特征在于，抗原表位多肽由非洲猪瘟病毒p72蛋白抗原表位多肽和pp62蛋白抗原表位多肽组成，p72蛋白抗原表位多肽序列为nksygkpdpeptlsqi，位置37-52aa；pp62蛋白抗原表位多肽序列为dflytaipeekvggne，位置450-465aa。

2.一种非洲猪瘟病毒合成肽elisa抗体检测试剂盒，其特征在于，试剂盒包括包被有权利要求1所述的抗原表位多肽的酶联反应板。

3.如权利要求2所述的非洲猪瘟病毒合成肽elisa抗体检测试剂盒，其特征在于，酶联反应板包被抗原表位多肽的方法：将p72蛋白抗原表位多肽和pp62蛋白抗原表位多肽按照一定质量比例溶于包被液后，添加到酶联反应板的孔中，抗原表位多肽的包被量120-180ng/孔，静置，加入封闭液，封闭、干燥、密封保存；p72蛋白抗原表位多肽和pp62蛋白抗原表位多肽的质量比为（1-2）∶1。

4.如权利要求3所述的非洲猪瘟病毒合成肽elisa抗体检测试剂盒，其特征在于，试剂盒还包括酶标二抗、样品稀释液、洗涤液、显色液、终止液、阳性对照血清、阴性对照血清中的一种或多种。

5.如权利要求4所述的非洲猪瘟病毒合成肽elisa抗体检测试剂盒，其特征在于，所述包被液为ph9.6的碳酸盐溶液；封闭液为含有10mg/ml的牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，封闭液的添加量为300μl/孔；酶标二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗猪igg抗体；所述酶联反应板为可拆卸96孔酶标板；显色液包括显色液a和显色液b。

6.如权利要求5所述的非洲猪瘟病毒合成肽elisa抗体检测试剂盒，其特征在于，所述显色液a为含0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸-磷酸盐缓冲液；显色液b为0.2mg/ml的四甲基联苯胺溶液；终止液为2mol/l的硫酸溶液。

7.如权利要求6所述的非洲猪瘟病毒合成肽elisa抗体检测试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为含5mg/ml酪蛋白的磷酸盐缓冲液；洗涤液为含体积百分比浓度0.8～1.2％tween-20的磷酸盐缓冲液。

8.如权利要求7所述的非洲猪瘟病毒合成肽elisa抗体检测试剂盒，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的摩尔浓度为0.01mol/l，ph值为7.4。

技术总结
本发明公开一种非洲猪瘟病毒抗原表位多肽，抗原表位多肽由非洲猪瘟病毒p72蛋白抗原表位多肽和pp62蛋白抗原表位多肽组成，p72蛋白抗原表位多肽序列为NKSYGKPDPEPTLSQI，位置37‑52aa；pp62蛋白抗原表位多肽序列为DFLYTAIPEEKVGGNE，位置450‑465aa。同时提供一种非洲猪瘟病毒合成肽ELISA抗体检测试剂盒，试剂盒包括包被有抗原表位多肽的酶联反应板。本发明采用生物信息学方法对非洲猪瘟病毒p72和pp62蛋白的抗原表位进行精确分析，筛选出适合ELISA检测用的肽段，该肽段具有灵敏性高、特异性强的优点。本发明利用非洲猪瘟病毒p72和pp62蛋白抗原表位多肽作为包被抗原，制成的试剂盒，能够有效检测被检动物是否感染非洲猪瘟病毒，该试剂盒特异性强、敏感性高和重复性好，有利于我国非洲猪瘟病毒防控体系的建立。

技术研发人员：秦保亮,李任峰,李春艳,王超,牛巧平,牛可可
受保护的技术使用者：新乡市动物疫病预防控制中心
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15