一种广谱识别人源诺如病毒的可溶性单链抗体及制备方法

本发明涉及生物，尤其涉及一种广谱识别人源诺如病毒的可溶性单链抗体及制备方法。

背景技术：

1、目前，人源诺如病毒(human norovirus，hnov)的检测方法主要有：基于病毒核酸片段的分子检测法和检测抗原决定簇的免疫学方法。

2、分子检测法主要包括：rt-pcr和rt-qpcr。其中，因rt-qpcr方法敏感性和特异性高，成为了该病毒检测的“金标准”。然而，hnov基因型多样且易发生突变，没有通用的检测体系；且此方法通常需要精密的设备和专业的操作人员，检测周期约2h，使用场景严重受限。

3、免疫学方法是通过检测病毒抗原，诊断是否感(污)染hnov；主要衣壳蛋白是该病毒的主要免疫原性蛋白，可分为高度保守的壳区和易发生变异的突出区。以突出区作为检测靶标，仅可检测个别基因型hnov；以保守区为检测靶标，可以广谱性检测hnov。但是，免疫学检测所用到的单克隆抗体制备流程复杂、对技术员要求苛刻、生产成本高，且杂交瘤细胞易退化。

4、抗体是效应b细胞产生的一类能识别抗原并与其特异性结合的免疫球蛋白，经典的抗体是由两条重链和轻链组成的“y”型结构，重链和轻链都包括可变区和恒定区。单链抗体(single chain fragment variable，scfv)是一种基因工程抗体，是通过一条连接肽(linker)将重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)连接起来的多肽链。linker序列应具有一定的亲水性且不应太短，减少多肽链的聚集，保证在蛋白质折叠过程中linker不会影响vh和vl所形成的空间结构。其中，连接肽(gly4ser)3的柔韧性好、免疫原性低，已成为目前应用最广泛的linker。

5、大肠杆菌培养成本低、生长速度快、候选克隆载体和宿主菌株数量多，已成为生产scfv最常见的宿主。在大肠杆菌细胞质的还原环境中大量表达时，scfv容易形成不溶性聚集体(包涵体)，无生物学活性。为了保障scfv的识别活性，可利用信号肽将scfv引导至大肠杆菌的周质空间中提高可溶性表达，但表达量太低。另外，添加促溶标签蛋白是表达可溶性单链抗体的常用方法之一，常用的促溶标签蛋白有麦芽糖结合蛋白(maltose bindingprotein，mbp)、谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione s-transferase，gst)和小泛素样修饰蛋白(small ubiquitin-related modifier，sumo)等。

6、因此，本领域的技术人员致力于开发一种低成本、可溶且特异性识别并结合抗原的可广谱性识别不同基因型hnov的scfv。

技术实现思路

1、有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何制备一种低成本、可溶且特异性识别并结合抗原的可广谱性识别不同基因型hnov的scfv。

2、为实现上述目的，本发明提供了一种可溶性单链抗体j5d，氨基酸序列如seqidno.3所示。

3、本发明还提供了一种可溶性单链抗体j5d的制备方法，包括以下步骤：

4、步骤1、获得广谱识别不同基因型hnov的可溶性单链抗体j5d核苷酸序列；

5、步骤2、以步骤1得到的j5d基因编码序列为模板，构建重组原核表达质粒pmal-c5x-j5d；

6、步骤3、培养含步骤2得到的重组原核表达质粒pmal-c5x-j5d的重组菌，进行j5d的原核表达和纯化。

7、进一步地，步骤1还包括以下步骤：

8、步骤1.1、设计鼠源单克隆抗体可变区引物；

9、步骤1.2、培养杂交瘤细胞，提取mrna，以反转录获得的cdna为模板，利用步骤1.1得到的鼠源单克隆抗体可变区引物扩增j5d的vh和vl基因片段；

10、步骤1.3、分别以含步骤1.2得到的j5d的vh和vl基因序列的t载体为模板，以5h-f和5h-r-linker为引物扩增j5d-vh-linker核苷酸片段，以linker-5k-f和5k-r为引物扩增linker-j5d-vl核苷酸片段，利用soe-pcr将其拼接，得到j5d基因。

11、进一步地，步骤2还包括提取重组原核表达质粒pmal-c5x-j5d，化学法转化origami2感受态细胞，阳性克隆保存备用。

12、进一步地，步骤3还包括以下步骤：取含重组原核表达质粒pmal-c5x-j5d的origami2大肠杆菌菌液在含氨苄青霉素的lb固体培养基上划线，培养；挑单克隆于含氨苄青霉素的lb液体培养基中，振荡培养；扩大培养，当od600为0.6左右时，取3ml未诱导菌液，离心后弃第一上清，将第一沉淀于-20℃保存；向剩余菌液中加入iptg，振荡培养，取菌液，离心后弃第二上清，将第二沉淀于-20℃保存；剩余诱导后的菌液离心，弃上清，收集菌体，加入lysis buffer重悬，使用超声波细胞粉碎机破碎菌体将蛋白释放，分别收集可能含有可溶性蛋白的上清和可能含有不溶性蛋白的沉淀；第一沉淀为未诱导菌体、第二沉淀为诱导后菌体、可能含有可溶性蛋白的上清为诱导菌体破碎后上清、可能含有不溶性蛋白的沉淀为诱导菌体破碎后沉淀，将未诱导菌体、诱导后菌体、诱导菌体破碎后上清、诱导菌体破碎后沉淀利用sds-page鉴定j5d蛋白是否成功诱导表达，以及是否为可溶性表达。

13、本发明还提供了一种重组原核表达质粒pmal-c5x-j5d，氨基酸序列如seq idno.4所示。

14、进一步地，重组原核表达质粒pmal-c5x-j5d带mbp标签。

15、进一步地，mbp标签具有促溶活性，能够辅助提高scfv的生物学活性。

16、本发明还提供了一种重组原核表达质粒pmal-c5x-j5d的构建方法，包括以下步骤：

17、步骤1)以j5d基因编码序列为模板，利用上游引物和下游引物，通过pcr扩增获得含nde i和hind iii酶切位点的j5d编码基因片段，用琼脂糖凝胶纯化试剂盒将其回收，得到j5d编码基因回收产物；

18、步骤2)提取原核表达质粒pmal-c5x；

19、步骤3)将步骤1)得到的j5d编码基因回收产物和步骤2)得到的质粒pmal-c5x用内切酶消化，利用连接酶将消化后的j5d基因片段和线性化的pmal-c5x质粒片段连接，转化dh5α感受态细胞，涂布平板，37℃倒置培养，得到培养后的平板；

20、步骤4)从步骤3)得到的培养后的平板中挑取单菌落，经过pcr鉴定阳性克隆，提取阳性克隆的质粒，进行dna测序验证，得到重组原核表达质粒pmal-c5x-j5d；

21、步骤3)中内切酶为nde i和hind iii内切酶，连接酶为t4连接酶。

22、进一步地，步骤1)中上游引物含nde i限制性内切酶酶切位点，下游引物含hindiii限制性内切酶酶切位点和his标签编码序列。

23、进一步地，步骤1)中上游引物为5h-f ndei，核苷酸序列如seq id no.5所示，下游引物为5k-r hindiii，核苷酸序列如seq id no.6所示。

24、本发明还提供了一种可溶性单链抗体j5d在广谱识别不同基因型hnov的试剂中的应用。

25、进一步地，广谱识别的不同基因型hnov。

26、在本发明的较佳实施方式1中，详细说明广谱识别hnov的可溶性单链抗体核苷酸序列的获取方式；

27、在本发明的另一较佳实施方式2中，详细说明重组原核表达质粒pmal-c5x-j5d(scfv)的构建过程；

28、在本发明的另一较佳实施方式3中，详细说明j5d(scfv)的原核表达和纯化过程；

29、在本发明的另一较佳实施方式4中，详细说明j5d(scfv)的亲和力测定过程。

30、本发明有益的技术效果如下：

31、本发明提供一种简单易行的可广谱识别不同基因型hnov的scfv制备方法。成功制备了可广谱性识别不同基因型hnov的scfv，特异性强、稳定性高。主要衣壳蛋白是hnov的主要免疫原性蛋白，可分为高度保守的壳区和易变异的突出区，本发明提供一种靶向识别hnov主要衣壳蛋白保守区的scfv。

32、本发明提出的scfv制备方案仅需通过pcr扩增获得基因序列，操作简单；在廉价的大肠杆菌中可大量表达，降低了生产成本；在-20℃可稳定保存。本发明所制备的scfv，操作简单、大幅缩短了生产周期、降低了生产成本且稳定性好。scfv是一种新型基因工程抗体，相对于单克隆抗体，其分子量小、便于大规模生产和储存。

33、本发明表达的带mbp标签的可溶性scfv可特异性识别不同基因型hnov主要衣壳蛋白保守区。筛选并利用mbp标签表达了可溶性scfv，又保留了其特异性识别并结合抗原的能力。mbp标签具有促溶活性，能够辅助提高scfv的生物学活性。

34、以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。