用于快速诊断川崎病的分子生物标志物和分析方法与流程

本发明涉及生物标志物组合和表征方法，用于在临床环境中诊断川崎病(kd)。具体而言，本发明声称使用rna/dna分子生物标志物及其拷贝数(浓度)的组合来得出kd得分，以辅助诊断、预后、风险评估和kd的治疗/监测。更具体地说，这些生物标志物表征试剂，如引物和聚合酶，将与测试系统，例如applied biosystems quantstudio 6一起打包在套件中，该测试系统可以测量生物标志物的浓度，生成kd得分，以区分kd与其他发热性儿科症状。

背景技术：

1、川崎病(kd)是一种罕见的儿童急性炎症性疾病，与血管炎和持续发热有关。kd是美国儿童获得性心脏病的主要原因，kd在发展中国家有明显增加的趋势。如果不及时治疗，会发生严重的并发症，大约25％的儿童会患冠状动脉损伤。kd死亡率很低，然而，由于受损动脉的血管重构，狭窄性病变可能会晚期发展。长期结果研究表明，初期因kd患冠状动脉瘤的50％的儿童需要再血管化手术或有心肌梗死的高风险。

2、kd的病因目前尚不清楚。然而，广泛认为它是特定遗传易感个体对感染因子异常和持续的免疫反应。不幸的是，到目前为止还没有确定一致的感染因子，进一步增加了诊断困难。此外，还观察到不同的kd族群分布。kd在东亚地区发病率最高，日本每150个儿童中就有1个受影响，它约占韩国儿童住院的1-2％。在白种人人口中，kd显著较低，患病率为9-17/10万人，而在5岁以下儿童中，日本的患病率为265/10万人。其他亚洲国家的平均患病率为51-194/10万人。

3、目前，kd的诊断主要依靠临床症状，目前没有可用的客观分子检测辅助诊断。由于kd具有许多儿童常见的自限性发热疾病的症状和特征，例如发热、皮疹、粘膜表现、淋巴结肿大和炎症等，因此临床诊断很困难。约15％至36.2％的kd病例被认为是不完全kd，不显示完整的临床特征，根据美国心脏协会的标准，缺少四个以上的kd临床表现，这会严重影响诊断的准确性。对于表现为“不完全”kd且未达到全部临床标准的患者，及时诊断至关重要。在发热发作后十天内进行早期诊断和治疗，使用静脉免疫球蛋白(ivig)可显著降低冠状动脉疾病的发生率，从而减少永久性心脏损伤和冠状动脉瘤的风险。

4、对于许多临床医生来说，及时识别、诊断和治疗通常是具有挑战性的。对于那些不熟悉或对复杂临床算法感到困惑的医生，根据持续发热和临床标准进行kd诊断的指南常常会延误诊断。此外，目前没有临床有用且易于获取的客观分子生物标志物测试，以帮助医生诊断kd。因此，迫切需要一种基于血液生物标志物的客观检测方法，以帮助医生识别不符合全部临床标准但需要治疗以预防心血管损伤的kd患者。

5、我们通过geo、文献和多重蛋白质平台等研究了与川崎病相关的潜在分子生物标志物(图1)。我们筛选出了61个候选基因，包括abcc1、adm、c10orf59、c1s、camk4、cd274、cd55、cd59、clec4d、cr1、crtam、ctgf、fcgr1b、fkbp1a、fkbp5、fkbp6、fut7、ifi30、lcn2、lgals2、lilra5、mapk14、mmp8、mpo、myd88、nktr、notch4、olfm4、pcolce2、pparg、pvrl2、s100a12、s100a8、s100a9、slc11a1、slc11a2、tlr7、treml4、vegfa、hgf、zbtb20、casp5、cacna1e、clic3、ifi27、klhl2、pyroxd2、rtn1、s100p、smox、znf185、c11orf82、plgf、cxcl16、osm、nppb、tnfsf14、cxcl6、ckm、ckb、il1r1。我们使用定量聚合酶链式反应(qpcr)平台和测定系统，例如applied biosystem quantstudio、7500实时pcr系统或bio-rad cfx系统，来测定这些生物标志物在样品中的rna拷贝数。然后，基于这些关键生物标志物的rna拷贝，我们开发了kd诊断模型和kd得分，能够将kd与其他发热患者区分开来。

技术实现思路

1、本发明披露了使用血液/血浆/血清蛋白生物标志物进行kd的诊断、风险评估和治疗/监测的方法。特别是，发明人发现并使用了一组基因生物标志物(rna、dna或蛋白质)来计算kd风险得分，可用于诊断、确定风险、监测kd治疗以及将kd与其他发热性疾病区分开来。生物标志物可以使用适当的检测系统(例如应用生物系统quantstudio、7500实时pcr系统或bio-rad cfx系统)的套件来确定，以确定rna拷贝数以推导出可单独使用或与其他kd临床标准结合使用的kd得分以确定和确认kd诊断。

2、rna/dna生物标志物的浓度，例如但不限于abcc1、adm、c10orf59、c1s、camk4、cd274、cd55、cd59、clec4d、cr1、crtam、ctgf、fcgr1b、fkbp1a、fkbp5、fkbp6、fut7、ifi30、lcn2、lgals2、lilra5、mapk14、mmp8、mpo、myd88、nktr、notch4、olfm4、pcolce2、pparg、pvrl2、s100a12、s100a8、s100a9、slc11a1、slc11a2、tlr7、treml4、vegfa、hgf、zbtb20、casp5、cacna1e、clic3、ifi27、klhl2、pyroxd2、rtn1、s100p、smox、znf185、c11orf82、plgf、cxcl16、osm、nppb、tnfsf14、cxcl6、ckm、ckb、il1r1，这些生物标志物在血液/血浆/血清中组合出现与kd的发展和诊断有关，利用定量pcr系统(例如应用生物系统quantstudio、7500实时pcr系统或bio-rad cfx系统)测量血液生物标志物拷贝数精确分离kd患者与其他发热患者(图1)。

3、本发明揭示了一种使用生物标志物的方法，可在本发明实践中使用，包括来自生物标志物的蛋白质生物标志物或rna/dna序列，包括但不限于ifi27，c19orf59，cacna1e，casp5，cr1，clic3，crtam，fkbp5，hgf，il1rl1，klhl2，mapk14，nktr，slc11a1，s100a12，s100a9，tlr7和zhf185等。

4、在某些实施例中，使用这些生物标志物的组合组用于诊断kd。kd诊断的生物标志物组可以包括至少2个生物标志物(一对)和最多18个生物标志物(9对基因)的完整组，如上所述。这将包括上述第1段描述的任何生物标志物的任何组合，其中至少包括2个，4个，6个，8个，10个，12个，14个，16个和18个生物标志物。较小的生物标志物组合组足以区分kd和其他发热疾病，并且更经济实惠。但是，较大的组可能提供更详细的信息，并且可以在不同的区域人群中用于本发明的实践。

5、在二元得分系统中，基于计算kd得分的方法用于区分患者和其他发热疾病。低kd得分表示患者不太可能患有kd。高kd得分表示患者很可能患有kd(规则)。

6、基于上述生物标志物和方法计算kd得分，并确定具有三个不同范围的kd风险的风险确定kd的方法。低于低分截断值的低kd风险表示患者患kd的风险很低。高于高分截断值的高kd风险表示患者患kd的风险很高。在低和高kd得分截断值之间的得分表示中等kd风险。

7、在某些情况下，临床参数与本文中描述的生物标志物结合使用来诊断kd。例如，本发明包括一种用于确定疑似患有kd的患者的kd得分的方法，该患者连续发烧5天。该方法包括根据患者的标准护理测量至少七个临床参数，包括发热持续时间、血液中血红蛋白浓度、血液中c-反应蛋白浓度、白细胞计数、血液中嗜酸性粒细胞百分比、血液中单核细胞百分比和血液中未成熟中性粒细胞百分比。

8、kd得分可以通过几何平均值、多元线性判别分析(lda)或分布式梯度提升决策树(gbdt)机器学习，例如xgboost，从所测量的血液生物标志物值中计算出来。在二元模型中，可以从生物标志物组合或配对中得出受试者工作特征(roc)曲线。然后，可以通过本文所述的方法将kd得分分类为低风险kd临床得分、中危险kd临床得分或高风险kd临床得分。

9、在另一个方面，本发明包括使用所述的生物标志物组合和计算kd得分的方法和程序来诊断患有kd的患者的方法。该方法包括：1)从患者中获取生物样品，2)测量生物样品中每个生物标志物的rna/dna拷贝数或浓度，3)将每个生物标志物的水平与生物标志物的相应参考值范围进行比较。参考值范围可以代表来自无kd的受试者的一个或多个样品的生物标志物的水平(即正常样品)，或代表来自一个或多个患有kd的一个或多个受试者的生物标志物的水平。生物标志物组合的血液生物标志物的差异水平与对照组主体的生物标志物的参考值相比，表明患者患有kd。在一种实施例中，该方法还包括计算kd得分的方法，以区分患者的发热疾病是否为kd。

10、生物标志物可以通过使用特定引物和报告系统来测量，以确定上述生物标志物和方法中生物标志物的拷贝数。例如，但不限于，执行定量pcr分析(qpcr)、反转录定量pcr(rt-qpcr)、基因微阵列、rna或dna测序(rnaseq/dnaseq)、夹心试验、磁性捕获、微球捕获、电泳印迹、表面增强拉曼光谱(sers)、流式细胞术或质谱分析等方法，以确定这些生物标志物的拷贝数。在某些实施例中，从特定dna引物与生物标志物rna的结合开始测量生物标志物的拷贝数，然后进行逆转录和聚合酶链式反应，以确定具有可检测的报告者(例如bybr绿色染料等)的生物标志物的拷贝数。其中引物特异性地结合到生物标志物或其片段。

11、本发明还包括一种用于评估治疗患有kd患者的干预剂的疗效的方法。该方法包括：使用本文所述的生物标志物组从患者的样品中分析治疗前后每个生物标志物的拷贝数或浓度。可以通过相应的参考值范围和计算的kd得分来确定治疗的有效性。

12、特别地，本发明包括一种用于选择疑似患有kd的患者接受静脉免疫球蛋白(ivig)治疗的方法，该过程包括：1)根据本文所述的方法对患者进行诊断；b)如果患者确诊kd，则选择该患者接受ivig治疗。在另一实施例中，该方法包括1)确定患者的kd得分；并且b)根据包含本文所述的生物标志物组的表达谱的高危险区或中危险区的kd得分和确诊kd来选择患者接受ivig治疗。

13、另一方面，本发明涉及一种用于治疗疑似患有kd的患者的方法，包括以下步骤：1)按照本文所述的方法对患者进行诊断或接收有关患者诊断的信息；以及2)对患者进行静脉免疫球蛋白(ivig)治疗，如果患者确诊kd。在一方面，该方法包括1)确定患者的kd临床得分；以及2)如果患者具有高危kd临床得分或中等危险kd临床得分并且根据第1至11段的生物标志物组的表达谱确诊kd，则向受试者施用静脉免疫球蛋白(ivig)的治疗有效剂量。

14、另一方面，本发明涉及用于定量qpcr系统(即用于测量样品中rna/dna生物标志物的系统)的试剂盒。该试剂盒可以包括用于容纳从疑似患有kd的人类患者采集和分离的生物样品的容器。该试剂盒至少包含一种用于测量kd生物标志物的试剂和印刷说明书，用于将试剂与生物样品或生物样品的一部分反应，以在生物样品中测量至少一个kd生物标志物。试剂可以包装在单独的容器中。该试剂盒还可以包括一种或多种控制参考样品和用于执行检测生物标志物复制数的qpcr的试剂，如本文所述。

15、另一方面，本发明涉及一种检测方法，包括：a)在从疑似患有kd的患者采集的血液、血浆或血清样品中测量生物标志物组(如本文所述)中每个生物标志物的拷贝数；并b)将每个生物标志物的测量值与控制受试者每个生物标志物的参考值进行比较，其中与参考值相比血液、血浆或血清样品中的生物标志物的差异表达表明患者患有kd。在一方面，该检测方法进一步包括根据患者的这些生物标志物浓度确定kd得分。

16、在某些情况下，通过引物靶向生物标志物的测量至少一种生物标志物，其中引物专门结合到生物标志物或生物标志物的一个片段，并通过pcr反应确定生物标志物的拷贝数。在某些实施方式中，引物是从生物标志物的编码区(外显子)序列中选择的。在一个案例中，至少选择一对引物从包括特异性结合到ifi27的引物对、特异性结合到c19orf19的引物对、特异性结合到s100a12的引物对、特异性结合到s100a9的引物对、特异性结合到cacna1e的引物对、特异性结合到slc11a1的引物对、特异性结合到nktr的引物对、特异性结合到camk4的引物对、特异性结合到clic3的引物对和特异性结合到lgals2的引物对的群组中选择。

17、本发明提供用于测量选自以下生物标志物组的一种或多种川崎病生物标志物的量的检测试剂在制备用于确定受试者川崎病生物标志物水平呈现的试剂盒中的用途，其特征在于，所述川崎病生物标志物组包括ifi27、c19orf59、cacna1e、casp5、cr1、clic3、crtam、fkbp5、hgf、il1rl1、klhl2、mapk14、nktr、slc11a1、s100a12、s100a9、tlr7和zhf185中的一种或多种，所述确定受试者川崎病生物标志物水平呈现的方法包括：

18、a.评估来自受试者的样品中的一组川崎病生物标志物，所述样品为血液、血清或血浆，以确定样品中每个川崎病生物标志物的表达水平；

19、b.基于组中每个川崎病生物标志物的水平来获得川崎病生物标志物的水平表示。

20、在一些具体实施方案中，测量每个川崎病生物标志物的寡核苷酸的全长或其核苷酸序列、rna或dna水平。

21、在一些具体实施方案中，所述生物标志物表达水平以循环阈值c(t)表示。

22、在一些具体实施方案中，所述组包括c19orf59和ifi27。

23、在一些具体实施方案中，所述组包括c19orf59、ifi27、s100a12和s100a9。

24、在一些具体实施方案中，所述组包括c19orf59、ifi27、s100a12、s100a9、clic3和slc11a1。

25、在一些具体实施方案中，所述组包括c19orf59、ifi27、s100a12、s100a9、clic3、slc11a1、cacna1e和lgals2。

26、在一些具体实施方案中，所述组包括c19orf59、ifi27、s100a12、s100a9、clic3、slc11a1、cacna1e、lgals2、abcc1和camk4。

27、在一些具体实施方案中，还包括提供川崎病生物标志物水平表示的报告。

28、在一些具体实施方案中，所述川崎病生物标志物水平呈现导出川崎病得分，其中所述川崎病得分：

29、a.从两个不同基因之间的循环阈值c(t)差异导出；

30、b.通过几何均值、多元线性判别分析(lda)或分布式梯度增强决策树(gbdt)机器学习，从所测量的血液生物标志物的值导出；或

31、c.是每个生物标志物水平的倍数。

32、本发明提供一种诊断系统，包括试剂盒、试剂和从来自受试者的样品中产生川崎病得分的仪器，所述样品为血液、血清或血浆，其特征在于，包括：用于测量选自以下生物标志物组的一种或多种川崎病生物标志物的量的检测试剂，所述川崎病生物标志物组包括ifi27、c19orf59、cacna1e、casp5、cr1、clic3、crtam、fkbp5、hgf、il1rl1、klhl2、mapk14、nktr、slc11a1、s100a12、s100a9、tlr7和zhf185中的一种或多种。

33、在一些具体实施方案中，进一步包括：

34、a.用于测量川崎病生物标志物的平台系统；

35、b.计算川崎病得分的计算表，以及

36、c.确定患者是否患有川崎病的指示。

37、在一些具体实施方案中，所述组包括c19orf59和ifi27。

38、在一些具体实施方案中，所述组包括c19orf59、ifi27、s100a12和s100a9。

39、在一些具体实施方案中，所述组包括c19orf59、ifi27、s100a12、s100a9、clic3和slc11a1。

40、在一些具体实施方案中，所述组包括c19orf59、ifi27、s100a12、s100a9、clic3、slc11a1、cacna1e和lgals2。

41、在一些具体实施方案中，所述组包括c19orf59、ifi27、s100a12、s100a9、clic3、slc11a1、cacna1e、lgals2、abcc1和camk4。

42、本发明提供川崎病生物标志物组，其特征在于，包括选自ifi27、c19orf59、cacna1e、casp5、cr1、clic3、crtam、fkbp5、hgf、il1rl1、klhl2、mapk14、nktr、slc11a1、s100a12、s100a9、tlr7和zhf185的一种或多种生物标志物。

43、在一些具体实施方案中，包括c19orf59和ifi27。

44、在一些具体实施方案中，包括c19orf59、ifi27、s100a12和s100a9。

45、在一些具体实施方案中，包括c19orf59、ifi27、s100a12、s100a9、clic3和slc11a1。

46、在一些具体实施方案中，包括c19orf59、ifi27、s100a12、s100a9、clic3、slc11a1、cacna1e和lgals2。

47、在本文所述的披露方案的技术领域内，对于这些和其他实施方案，对于技术人员而言会很容易想到。