一种水稻THION22基因及其在调控水稻花粉管生长中的应用

本发明属于属于植物生物，具体是调控水稻花粉管生长的基因。

背景技术：

1、被子植物需要通过双受精形成种子，完成世代繁殖，而双受精过程涉及到一系列复杂且连续的雌雄蕊互作。与动物不同，植物的精细胞不能自主游动，需要依靠花粉管将其输送到胚囊即雌配子体中。雄蕊中的花粉首先通过特定媒介落到雌蕊的柱头上，经水合与相互识别后萌发产生花粉管，花粉管在柱头乳突细胞的细胞间生长并穿过柱头和花柱，最终到达指定的胚囊完成精细胞的输送。在花粉管穿越多层细胞结构最终完成双受精的过程中，花粉管接受很多来自雌蕊和胚囊分泌的信号分子，前人的研究表明这些信号的吸引对被子植物完成双受精而言是必须的。花粉管只有不断接受雌蕊及胚囊分泌的信号分子，才能在雌蕊组织中进行准确的导向性生长，最终进入胚囊完成双受精。

2、过去二十年中，国内外研究人员以模式植物拟南芥及蓝猪耳草等为材料，研究受精过程中雌-雄相互作用的分子机制，在花粉管导向研究领域取得了一系列重大突破。大量实验数据证实，雌性组织及雌配子体各细胞分泌的信号分子和花粉管中的受体相互作用，精确调控花粉管导向。雌蕊来源的分泌信号包括小肽、糖蛋白及激素等，其中分泌小肽与其位于花粉管上的类受体蛋白激酶形成的信号转导通路被发现在花粉管导向的多个过程中发挥关键的调控作用。尽管近些年来在植物双受精过程中雌雄蕊互作的研究取得了较大的进展，一些关键的信号分子及其调控机制被揭示，但这些研究主要集中在双子叶模式植物拟南芥中，对于重要的单子叶粮食作物如水稻中花粉管导向机理的研究极少。水稻雌蕊组织会分泌哪些可促进花粉管生长或吸引花粉管生长的信号，这些科学问题均亟待解决。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种调控水稻花粉管生长的基因thion22及其应用，该基因的功能对水稻雌雄蕊相互作用的研究具有重要应用价值。

2、本发明通过以下技术方案来实现：

3、一种水稻thion22基因，该基因的碱基序列如seq id no.1所示，其主要在调控水稻花粉管生长中的应用。

4、本发明采用crispr/cas 9载体的构建方法对thion22基因进行编辑，获得不同的thion22突变体株系。具体方法为：将cas9蛋白表达盒整合到双元载体上，在靠近双元载体rb的位置上装载多个sgrna表达盒的多克隆位点bsa i，其sgrna表达盒元件安装在中间质粒载体上，通过酶切连接和pcr方法将其拼接起来，再利用golden gate或gibson assembly克隆方法组装到双元载体上，实现对thion22基因编辑。

5、本发明水稻thion22基因回补株系的载体构建，具体方法为：

6、(1)以野生型水稻zh11的基因组dna作为模板，利用thion22-pro-f/r引物将thion22基因起始密码子atg上游2500bp的启动子用pcr扩增出来；

7、(2)以成熟时期水稻小穗组织的cdna为模板，利用thion22-cds-f/r引物将thion22基因完成的cds序列扩增出来，具体见；

8、(3)将(1)和(2)中的两个pcr片段同时作为模板，利用两端的引物将连个片段扩增在一起，经凝胶电泳检测后进行片段回收；

9、(4)将(3)中pcr片段连接到pentrtm/d-topo载体并通过测序验证，然后通过lr反应重组到目的载体pgwb504中，并通过根癌农杆菌转化方法转化到thion22突变体中即可获得水稻回补株系。

10、本发明水稻成熟稻穗结实率的观察与统计，将不同品系的水稻种植温室环境中，条件设置为：温度26℃～28℃，空气湿度50％，光照14h，黑暗10h；待水稻生长成熟，将穗子剪下进行结实率统计。每个品种至少统计30株水稻，且每株统计1～2个主茎上的穗子。

11、本发明的thion22基因调控花粉管在雌蕊中的生长观察，具体操作方法：

12、(1)配好faa固定液：50％乙醇、冰乙酸、甲醛按照体积比为89:6:5进行配置，10mol/l的naoh溶液备用；

13、(2)取自然开花或者人工授粉(需要提前人工去雄)1.5-2小时后的颖花用faa固定液固定；

14、(3)固定24小时后，再先后放在70％，50％，30％的系列酒精中脱水，每个步骤10-12分钟，最后在蒸馏水中复水，冲洗2-3遍；

15、(4)然后放入预先准备好的10mol/l naoh溶液中，在56℃水浴锅中浸泡5-8分钟，再用蒸馏水冲洗数次后用0.1％苯胺蓝染色10～12h；

16、(5)最后在激光共聚焦显微镜下观察花粉在柱头上附着和萌发及花粉管伸长情况。

17、本发明的有益效果：本发明的水稻thion22基因能够调控水稻的花粉管在雌蕊中的生长，从而影响水稻的结实率，最终影响产量，对水稻花粉管生长调控的研究具有重要的意义，这对水稻育种工作具有一定的应用价值。

技术特征：

1.一种水稻thion22基因，其特征在于，该基因的碱基序列如seq id no.1所示。

2.一种如权利要求1所述的thion22基因的应用，其特征在于，其在调控水稻花粉管生长中的应用。

3.权利要求2所述的thion22基因的应用，其特征在于，采用rispr/cas 9载体的构建方法对thion22基因进行编辑，获得不同的thion22突变体株系。

4.权利要求3所述的thion22基因的应用，其特征在于，rispr/cas 9载体的构建具体方法为：将cas9蛋白表达盒整合到双元载体上，在靠近双元载体rb的位置上装载多个sgrna表达盒的多克隆位点bsa i，其sgrna表达盒元件安装在中间质粒载体上，通过酶切连接和pcr方法将其拼接起来，再利用golden gate或gibson assembly克隆方法组装到双元载体上，实现对thion22基因编辑。

5.权利要求2所述的thion22基因的应用，其特征在于，水稻thion22基因回补株系的载体构建，具体方法为：

6.权利要求5所述的thion22基因的应用，其特征在于，所述thion22-pro-f引物为ggccgcccccttcaccgcgcagtgatgcttacagat；

7.权利要求5所述的thion22基因的应用，其特征在于，所述thion22-cds-f引物为agaagaatcgcatcaatggaggtgaagaag；

8.权利要求5所述的thion22基因的应用，其特征在于，水稻成熟稻穗结实率的观察与统计，将不同品系的水稻种植温室环境中，条件设置为：温度26℃～28℃，空气湿度50％，光照14h，黑暗10h；待水稻生长成熟，将穗子剪下进行结实率统计。

9.权利要求5所述的thion22基因的应用，其特征在于，所述每个品种至少统计30株水稻，且每株统计1～2个主茎上的穗子。

10.权利要求5所述的thion22基因的应用，其特征在于，thion22基因调控花粉管在雌蕊中的生长观察，具体操作方法：

技术总结
本发明属于植物生物技术领域，具体公开了一种水稻THION22基因及其在调控水稻花粉管生长中的应用。本发明实验表明THION22基因能够调控水稻的花粉管在雌蕊中的生长情况，从而影响水稻的结实率，最终影响水稻产量，对水稻花粉管生长调控的研究具有重要的意义，这对水稻育种工作具有应用价值。

技术研发人员：秦源,柴梦楠,严茂凯,蔡汉阳,郭明亮
受保护的技术使用者：福建农林大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/4