肟菌酯含量检测用半抗原及其应用的制作方法

本技术涉及农药残留检测，特别是一种肟菌酯含量检测用半抗原及其应用。

背景技术：

1、肟菌酯(trifloxystrobin)属于甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，通过阻止细胞腺苷三磷酸酶的合成，从而抑制线粒体呼吸而发挥抑菌作用，对多数真菌都有强烈的抑制作用。由于其具有高效、广谱、持效期长等特性，且对作物和环境安全，常用于防治稻瘟病、稻曲病、纹枯病等，但其不合理的使用带来的残留会对土壤和水生生态系统产生破坏。尽管肟菌酯毒性较低，但由于食品安全学科的发展及人们对食品安全性的关注度的提升，许多国家对于其在食品、农作物上的残留已给出了相关的最高残留限量(mrl)，我国国家标准gb 2763中规定肟菌酯在蔬菜水果中的mrl为0.05～15mg/kg。

2、目前国内外对肟菌酯残留的检测方法主要有气相色谱法、气相色谱-质谱法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱法等。此类仪器分析方法具备检测灵敏度高、特异性强等优势，但是检测样本前处理繁琐、耗时，样品还需提取和净化处理，同时仪器检测方法需要昂贵的大型仪器和设备，配备专业的检测技术人员进行操作和管理，无法进行现场大规模检测，时效性差，难以推广。

3、免疫学检测分析技术以其高灵敏、高特异性、快速、操作简便等优点，已被药物残留检测领域广泛应用，与仪器检测方法相比具有很多优势。但现有技术中缺乏对肟菌酯具有特异性反应的检测试剂，阻碍了免疫分析检测法在肟菌酯检测中的运用。

4、在建立免疫学检测方法并应用该检测方法检测肟菌酯时，关键技术在于能够获取特异性强、灵敏度高的抗体，而要实现这一目标，前提条件是需要合成、制备出合适的肟菌酯半抗原。

技术实现思路

1、本技术提供了一种肟菌酯含量检测用半抗原及其应用，用于解决现有技术中存在的肟菌酯检测方法样本前处理繁琐、检测效率低、无法实现快速大批量检测；缺乏针对肟菌酯具有特异性的酶联免疫检测半抗原的技术问题。

2、本技术提供了一种肟菌酯含量检测用半抗原，化学结构式为：：

3、

4、所述肟菌酯含量检测用半抗原的制备方法包括以下步骤：

5、以2-[2-[(4-乙酰苯氧基)甲基]苯基]-2-甲氧基亚氨基乙酸甲酯为原料，与2-(氨基氧基)乙酸在吡啶的催化下进行缩合反应，得到所述肟菌酯含量检测用半抗原。

6、具有该结构式的半抗原按现有技术中常用方法处理后可制得抗体，该抗体能对经过预处理后的各类蔬菜水果中所含的肟菌酯产生特异性反应。根据该特性可对肟菌酯标准品梯度稀释获得不同浓度肟菌酯标准品溶液，采用酶标仪在450nm下测量各标准品溶液的od值得到标准曲线后，对待测样本进行预处理，测定相同波长下的od值，并通过标准曲线得到对应的浓度，从而实现对样本中所含肟菌酯含量的定量有效、快速检测。

7、采用该反应能获得纯度较高的半抗原。该制备方法中所用试剂及反应条件，可按现有缩合反应所需的试剂和条件进行选择。

8、本技术提供该半抗原制成试剂盒后用于对蔬菜水果中所含肟菌酯进行检测时，灵敏度为0.02μg/l，说明该半抗原制成试剂盒后，对肟菌酯的检测灵敏度较高；按现有方法制成试剂盒后，对蔬菜、水果中肟菌酯的检测限为0.5μg/kg，可以用于对果蔬中所含肟菌酯含量的有效检测；该半抗原制成试剂盒后，对肟菌酯的回收率为100％±20％，批内变异系数＜10％，批间变异系数＜15％，准确性较好，能满足检测需要。

9、所得半抗原制成试剂盒后，对其他甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的交叉反应性均小于1％，对肟菌酯则可达100％，说明该半抗原可特异性地检出肟菌酯并避免其他结构类似物对检测结果的干扰，能很好地填补现有技术中缺乏针对肟菌酯具有明显特异性的半抗原。

10、优选的，所述肟菌酯含量检测用半抗原的制备方法包括以下步骤：

11、1)加乙醇溶解2-[2-[(4-乙酰苯氧基)甲基]苯基]-2-甲氧基亚氨基乙酸甲酯；

12、2)加水溶解2-(氨基氧基)乙酸，加入吡啶充分搅拌混匀后，滴加到上述1)所得溶液中，室温反应4h，停止反应，得到反应液；

13、3)对所得反应液进行分离纯化得到所述肟菌酯含量检测用半抗原。

14、本技术半抗原制备方法的反应方程式如式(2)所示：

15、

16、由上可知，该反应可以正常发生，并制得具有上述结构的半抗原。

17、优选的，该制备方法中步骤3)中所述分离纯化操作包括以下步骤：对所得反应液旋蒸除去乙醇及吡啶，加200ml水、100ml乙酸乙酯萃取，分去水相，有机相蒸干，上硅胶柱，用体积比为3:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶液洗脱分离，得到所述肟菌酯含量检测用半抗原。

18、为实现对半抗原的有效应用，可进行以下应用：

19、本技术另一方面还提供了一种肟菌酯含量检测用抗原，为由上述半抗原与载体蛋白偶联得到的偶联物。

20、优选的，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白。采用以上种类的载体蛋白能有效发挥半抗原的检测作用。

21、本发明中所用半抗原与载体蛋白偶联方法可以为现有常用由半抗原制备抗原的方法，例如以牛血清白蛋白为载体蛋白的偶联方法可以为：

22、取上述半抗原15.44mg，加1ml n,n-二甲基甲酰胺溶解，加n-羟基丁二酰亚胺8.58mg、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐14.29mg，用移液器吹打混匀，室温反应2h，得到半抗原活化液a液；取牛血清白蛋白(bsa)50mg，加0.1mol/l ph 8.0的pb缓冲液4ml溶解；滴加全部的a液，室温反应6h，用0.02mol/l的pb缓冲液透析纯化3天，每天换液3次，离心，得到与牛血清白蛋白偶联的肟菌酯抗原，分装，-20℃保存。

23、以卵清蛋白为载体蛋白的偶联方法包括以下步骤：

24、取上述半抗原20.24mg，加1mln,n-二甲基甲酰胺溶解，加n-羟基丁二酰亚胺8.58mg、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐14.29mg，用移液器吹打混匀，室温反应2h，得到半抗原活化液a液；取卵清蛋白(ova)100mg，加0.1mol/l ph 8.0的pb缓冲液4ml溶解；滴加全部的a液，室温反应6h，用0.02mol/l的pb缓冲液透析纯化3天，每天换液3次，离心，得到与卵清蛋白偶联的肟菌酯抗原，分装，-20℃保存。

25、本发明另一方面还提供了一种肟菌酯含量检测用抗体，为由上述抗原经动物免疫得到的抗体；所述抗体与肟菌酯发生特异性免疫反应。

26、优选的，所述抗体为肟菌酯单克隆抗体。

27、本方面中所用由上述抗原制备抗体的方法可以为本领域常用动物免疫方法，例如包括以下步骤：

28、(1)动物免疫：将与牛血清白蛋白偶联的肟菌酯抗原注入到balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生多克隆抗体血清。

29、(2)细胞融合和克隆化：小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按8:1比例与sp2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争elisa测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

30、(3)细胞冻存和复苏：将肟菌酯的单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成1×109个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

31、(4)单克隆抗体的生产与纯化：将balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7天后腹腔注射肟菌酯的单克隆杂交瘤细胞株6×105个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，-20℃保存。

32、(5)单克隆抗体效价的测定：用间接竞争elisa法测定抗体的效价为1:512000。

33、该抗体以单克隆抗体形式投入运用，其效价较高。

34、本发明另一方面还提供了一种肟菌酯含量检测用酶联免疫试剂盒，包括：酶标板、抗体，所述酶标板包被有如上述的肟菌酯含量检测用抗原；所述抗体为如上述的肟菌酯含量检测用抗体。

35、该试剂盒按现有方法制得，具体方法本领域技术人员可通过检索现有酶联免疫试剂盒生产方法制备得到。

36、优选的，所述肟菌酯含量检测用酶联免疫试剂盒还包括：梯度浓度的肟菌酯标准品溶液、酶标二抗、底物液a液、底物液b液、终止液、洗涤液、复溶液。

37、优选的，所述梯度浓度的肟菌酯标准品溶液的梯度浓度分别为0μg/l、0.02μg/l、0.06μg/l、0.18μg/l、0.54μg/l、1.62μg/l；

38、酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体；

39、底物液a液为过氧化脲，底物液b液为四甲基联苯胺；

40、终止液为2mol/l硫酸溶液；

41、洗涤液为ph 7.2，含0.8％～1.2％吐温-20、0.01‰～0.03‰硫柳汞防腐剂、0.1～0.3mol/l的碳酸盐缓冲液；

42、复溶液为ph 7.6，含8％～12％酪蛋白、0.1～0.3mol/l的磷酸盐缓冲液。

43、采用上述各成分制成的试剂盒检测效率高、准确性好，适用于对现场大批量样品进行检测。

44、本技术中室温温度范围为20～25℃，以操作当时温度计读数为准。

45、本发明能产生的有益效果包括：

46、1)本发明所提供的肟菌酯含量检测用半抗原，本技术提供该半抗原制成试剂盒后用于对蔬菜水果中所含肟菌酯进行检测时，灵敏度为0.02μg/l，说明该半抗原制成试剂盒后，对肟菌酯的检测灵敏度较高；按现有方法制成试剂盒后，对蔬菜、水果中肟菌酯的检测限为0.5μg/kg，可以用于对果蔬中所含肟菌酯含量的有效检测；该半抗原制成试剂盒后，对肟菌酯的回收率为100％±20％，批内变异系数＜10％，批间变异系数＜15％，准确性较好，能满足检测需要。该半抗原能最大程度保留肟菌酯特征结构，以此半抗原制备人工抗体后，该抗体具有对肟菌酯检测灵敏度高和特异性强的特点。

47、2)本发明所提供的肟菌酯含量检测用半抗原，采用该半抗原为原料制备的抗体，由于以该半抗原为原料，显示针对肟菌酯残留检测较强的免疫原性；用该半抗原作为原料，制备适于动物免疫的人工抗原体系免疫动物，所得抗体的效价、特异性、亲和力都比较好，针对肟菌酯的检测灵敏度可达0.02μg/l。

48、3)本发明所提供的肟菌酯含量检测用抗体及试剂盒，检测操作简单，无需购置大型仪器分析设备，仅需通过试剂盒即可完成对样本的检测，适宜现场大批量检测。

49、4)本发明所提供的酶联免疫试剂盒，以所得抗体制成，使用方便、检测成本低、检测方法高效、准确、快速、可同时检测大批量样本，适于果蔬中肟菌酯的现场监控和大量样本的筛查。