基于斑马鱼模型筛选头皮去屑化妆品原料的试剂盒及应用的制作方法

本发明属于化妆品原料筛选，具体涉及一种基于斑马鱼模型中筛选头皮去屑化妆品原料的试剂盒及应用。

背景技术：

1、头皮屑是一种常见的、慢性的、轻度炎症性、持续和复发性的头皮健康疾病，影响着世界上约一半的人口，给人们带来负面社会形象的影响。它的典型特征为基底层表皮角质形成细胞(keratinocyte，kc)的增殖增加，从而导致角质细胞的产生和脱落而形成片状的白黄色鳞片，并常伴有瘙痒和皮肤紧绷。在大多数情况下，头皮屑是一种轻度的脂溢性皮炎。随着时间的推移，脱落的死皮、皮脂和其他杂质在头皮上堆积并沉积在毛囊内，堵塞毛囊并促进头皮屑等真菌感染，还会阻碍毛囊生长而破坏坚固头发的能力，进而产生脱发。

2、头皮屑人群的微生物学研究大多数呈现的结果为过量的马拉色氏真菌。通常马拉色菌是脂质依赖性的，在触发因素下可大量繁殖，宿主源性的脂质作为营养源，马拉色菌分泌的脂肪酶和磷脂酶会水解皮肤所含三酰甘油，释放油酸和花生四烯酸等不饱和脂肪酸，破坏表皮角质层的屏障功能，诱导角质形成细胞产生il-13、il-17a、tnf-α等促炎细胞因子。其中il-13细胞因子能促进趋化因子的产生、诱导皮肤屏障功能障碍、抑制抗菌肽的表达，il-17能减少丝聚蛋白和外披蛋白的表达，加剧皮肤的屏障损伤。il-13、il-17a、tnf-α这些促炎细胞因子能够激活jak并导致stat蛋白磷酸化并发生核转移，促进角质形成，引起细胞增殖及异常分化、炎症因子水平升高等病理变化，最终导致皮肤炎症反应和脱屑。因此，筛选出高效、温和的jak抑制剂用于头皮去屑具有重要意义。

3、斑马鱼模型是一种成本低、稳定性好、适用于大通量的动物评价模型。作为化妆品原料筛选评价模型，其优势在于，斑马鱼全年产卵数量多，样本量大；胚胎透明,给药方式简单，可以直接观察化妆品原料对鱼体内脏器官的影响；斑马鱼与人类的基因同源性高，在斑马鱼上得到的评价结果多数情况下也适用于人体。

4、目前，对于化妆品去屑功效评价测试方法常用体外马拉色菌抑菌试验和人体受试法。虽然评价结果直接准确，但存在试验周期长、检测通量不足的缺陷。且该类测试方法以产品成品检测为主，对于化妆品研发初期的原料筛选效果不理想，检测方法与市场需求不匹配。且大多数体外测试方法围绕样品的抑菌作用进行测试，仅针对头皮脱屑发生机制中微生态失衡这一方面，而对于其作用的相关信号通路被激活导致的头皮炎症带来的脱屑，并未有现有技术的报道。

技术实现思路

1、鉴于上述问题，本发明的目的在于设计一种基于斑马鱼模型筛选头皮去屑化妆品原料的试剂盒，以检测角质异常增殖相关炎症介质il-13、il-17a，tnf-α的基因mrna表达，利于实现jak/stat信号通路抑制剂的去屑功效化妆品原料的快速筛选。

2、为了实现上述目的，本发明提供一种基于斑马鱼模型筛选头皮去屑原料的试剂盒，包括rna提取试剂、rna逆转录试剂、特异性引物和qpcr反应体系试剂，用于检测相关基因表达，所述相关基因包括角质异常增殖相关炎症介质il-13、il-17a，tnf-α中的至少一种。

3、进一步地，用于检测il-13基因表达的特异性引物序列如seq id no：1-2所示：

4、forward：cgggttttacgttgaaaggca；

5、reverse：tgacagaaataatcatgctcacac。

6、进一步地，用于检测il-17a基因表达的特异性引物序列如seq id no：3-4所示：

7、forward：tatcattcggtgctgagggg；

8、reverse：ggatgggattggttgaggct。

9、进一步地，用于检测tnf-α基因表达的特异性引物序列如seq id no：5-6所示：

10、forward：atagaacaacccagcaaactcg；

11、reverse：ttcctcctagacaccatcacca。

12、本发明还提供一种上述试剂盒的应用，通过建立斑马鱼模型，使用所述试剂盒筛选头皮去屑的化妆品原料。

13、进一步地，通过建立斑马鱼模型筛选出jak/stat信号通路的抑制剂，以筛选头皮去屑的化妆品原料。

14、进一步地，所述斑马鱼模型是使用斑马鱼ab品系，通过lps诱导建立相关模型。

15、进一步地，使用所述试剂盒筛选头皮去屑的化妆品原料的方法，包括如下步骤：

16、(1)培养斑马鱼，并分别设置模型组、对照组和样品处理组，其中，模型组和样品处理组是将受精24hpf的斑马鱼胚胎转移至含有lps胚胎培养液中进行诱导，对照组是将24hpf的斑马鱼胚胎转移至不含lps的胚胎培养液中培养。

17、(2)向样品处理组的培养液中分别加入待筛选的化妆品原料，化妆品原料浓度为安全浓度，继续培养；

18、(3)使用所述试剂盒，对模型组、对照组和样品处理组的斑马鱼胚胎进行rna的提取和纯化、逆转录、pcr扩增后，通过检测并分析化妆品原料对相关基因mrna表达的影响，以筛选化妆品原料。

19、进一步地，步骤(3)中，当检测结果中il-13基因、il-17a基因和tnf-α基因三种基因的表达没有出现全部显著的下降，则通过马拉色菌抑制实验进一步验证待筛选原料的功效。

20、本发明实现的有益效果为：(1)基于斑马鱼模型，对通过抑制jak/stat信号通路对去屑功效的化妆品原料的快速筛选，极大减少了实验周期；(2)定量检测jak/stat及其相关炎症介质的基因表达，灵敏、方便地检测出待筛选化妆品原料的去屑效果；(3)使用本发明设计的试剂盒能够快速筛选出抑制jak/stat信号通路的化妆品原料，对去屑相关化妆品功效成分的开发，具有重要意义。

技术特征：

1.一种基于斑马鱼模型筛选头皮去屑化妆品原料的试剂盒，其特征在于，包括rna提取试剂、rna逆转录试剂、特异性引物和qpcr反应体系试剂，用于检测相关基因的表达，所述相关基因包括il-13基因、il-17a基因和tnf-α基因中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，用于检测il-13基因表达的特异性引物序列如seq id no：1-2所示：

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，用于检测il-17a基因表达的特异性引物序列如seq id no：3-4所示：

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，用于检测tnf-α基因表达的特异性引物序列如seq id no：5-6所示：

5.一种如权利要求1-4中任意一项所述的试剂盒的应用，其特征在于，通过建立斑马鱼模型，使用所述试剂盒筛选头皮去屑的化妆品原料。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，通过建立斑马鱼模型筛选jak/stat信号通路的抑制剂，以筛选头皮去屑的化妆品原料。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述斑马鱼模型是使用斑马鱼ab品系，通过lps诱导建立相关模型。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，使用所述试剂盒筛选头皮去屑的化妆品原料的方法，包括如下步骤：

技术总结
本发明提供了一种基于斑马鱼模型筛选头皮去屑化妆品原料的试剂盒，所述试剂盒包括了RNA提取试剂、RNA逆转录试剂、特异性引物和qPCR反应体系试剂，用于检测相关基因的表达，所述相关基因包括IL‑13基因、IL‑17A基因、TNF‑α基因中的至少一种。本发明还提供一种上述试剂盒的应用，通过建立斑马鱼模型，使用所述试剂盒筛选出具有去屑功效的化妆品原料，这极大减少了实验周期，对去屑相关化妆品功效成分的开发，具有重要意义。

技术研发人员：杨俊武,蒋旭峰,张阳,陆瑾,王卫国,陈凡
受保护的技术使用者：福建中妆技术研究有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/4