一种具备脊髓胸腰段及腹侧区域运动神经元特征的脊髓类器官培养基和培养方法与流程

本发明涉及类器官培养，具体涉及一种具备脊髓胸腰段及腹侧区域运动神经元特征的脊髓类器官培养基和培养方法。

背景技术：

1、类器官模型在关键细胞结构、复杂功能特征等方面表现出更完整的人体组织器官再现能力。尤其是神经系统类器官，近二十多年来，干细胞生物学家开展了大量基于人成体干细胞(adult stem cells，adscs)以及多能干细胞(pluripotent stem cells，pscs)，包括人胚胎干细胞以及人诱导多能干细胞的细胞生物过程以及应用探索方面的工作，对多能干细胞生物行为的进一步理解保证了多种器官组织类器官的建立，从发育中的全脑类器官到特定区域的类器官，以及模拟功能区域间交互的组装-聚集体(assembloids)。利用胚状体(ebs)的早期谱系限制后的自组装，自模式，和自形态发生特性，研究人员可以轻松制造出神经系统的关键结构和复杂特征。更重要的是，类器官的这种类似4d(3d环境下的时间线索模拟)组装方式可提供神经系统谱系发育，疾病发生发展及对干预措施的反馈等动态信息。

2、代表性的，lancasterm.a.团队致力于构建全脑类器官以研究中枢神经系统发育与疾病研究；不同于全脑类器官，sergiu p.shi-yanng等课题组开发出包括皮质、中脑、后脑/脊髓的区域特异性类器官模型，可应用于特异性神经系统疾病的建模以及发病机理、治疗手段、药物筛选等研究；但至今还未开发出一种运动神经元特征明显的脊髓类器官培养方法。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种脊髓类器官培养基及方法，构建了一种具有胸腰段以及脊髓前角区域运动神经元特征的脊髓类器官，可模拟脊髓前角的发育过程及细胞组成，为人类脊髓相关疾病的发病机制提供体外研究平台，为相关疾病的防治手段提供研究工具。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一个方面，本发明提供了一种具备脊髓胸腰段及腹侧区域运动神经元特征的脊髓类器官培养基，所述培养基包括：多能干细胞分化为神经中胚层祖细胞的组合物1，该组合物包括bmp信号抑制剂与wnt通路激活剂；决定脊髓类器官背腹侧及喙尾端命运的组合物2，该组合物包括维甲酸ra、shh激活剂与成纤维细胞生长因子fgf-2；以及，促进脊髓类器官神经化及神经元维持的组合物3，该组合物包括notch信号抑制剂、表皮生长因子egf、胰岛素样生长因子igf、l-抗坏血酸aa与脑源性神经营养因子bdnf。

4、优选地，所述培养基还包括：含有成纤维细胞生长因子fgf-2、bmp信号抑制剂ldn193189及alk5抑制剂sb431542的培养基1；含有bmp信号抑制剂ldn193189及alk5抑制剂sb431542的培养基2；含有所述多能干细胞分化为神经中胚层祖细胞的组合物1及alk5抑制剂sb431542的培养基3；所述多能干细胞分化为神经中胚层祖细胞的组合物中的所述bmp信号抑制剂为ldn193189，所述wnt通路激活剂为chir99021；含有wnt通路激活剂chir99021、表皮生长因子egf、成纤维细胞生长因子fgf-2、维甲酸ra的培养基4；含有所述决定脊髓类器官背腹侧及喙尾端命运的组合物2以及wnt通路激活剂chir99021、表皮生长因子egf的培养基5；所述决定脊髓类器官背腹侧及喙尾端命运的组合物包括维甲酸ra、shh激活剂与成纤维细胞生长因子fgf-2；含有所述促进脊髓类器官神经化及神经元维持的组合物3的培养基6；所述促进脊髓类器官神经化及神经元维持的组合物包括notch信号抑制剂、表皮生长因子egf、胰岛素样生长因子igf、l-抗坏血酸aa与脑源性神经营养因子bdnf；以及，含有胰岛素样生长因子igf、l-抗坏血酸aa、脑源性神经营养因子bdnf的培养基7。

5、优选地，所述培养基1还包括：dmem/f-12培养基、knockout血清替代物ksr、非必须氨基酸neaa、glutamax、二巯基乙醇、成纤维细胞生长因子fgf-2；所述培养基2还包括：dmem/f-12培养基、knockout血清替代物ksr、非必须氨基酸neaa、glutamax、二巯基乙醇；所述培养基3还包括：dmem/f-12培养基、knockout血清替代物ksr、非必须氨基酸neaa、glutamax、二巯基乙醇；所述培养基4还包括：neurobasal培养基、b27 supplement、glutamax；所述培养基5还包括：neurobasal培养基、b27 supplement、glutamax；所述培养基6还包括：neurobasal培养基、n2 supplement、b27supplement、glutamax、camp；所述培养基7还包括：neurobasal培养基、n2 supplement、b27 supplement、glutamax、camp。

6、优选地，所述培养基1-7中，glutamax的浓度为1％。

7、优选地，所述培养基1-3中，dmem/f-12培养基与knockout血清替代物ksr的体积比为4:1；所述培养基1-3中，非必须氨基酸neaa的浓度为1％；所述培养基1-3中，二巯基乙醇的浓度为0.1mm；所述培养基1-3中，ldn193189的浓度为100nm；所述培养基1-3中，sb431542的浓度为10μm；所述培养基1中，成纤维细胞生长因子fgf-2的浓度为10ng/ml。

8、优选地，所述培养基3-5中，chir99021的浓度为3μm。

9、优选地，所述培养基4-7中，b27 supplement的浓度为2％；所述培养基4-5中，表皮生长因子egf的浓度为20ng/ml；所述培养基4-5中，成纤维细胞生长因子fgf-2的浓度为10ng/ml或20ng/ml；所述培养基4-5中，维甲酸ra的浓度为0.01或0.1μm；所述培养基5中，shh激活剂sag的浓度为1μm；所述培养基6中，notch信号抑制剂dapt的浓度为2.5μm；所述培养基6-7中，n2 supplement的浓度为1％；所述培养基6-7中，camp的浓度为50nm；所述培养基6-7中，胰岛素样生长因子igf的浓度为10ng/ml；所述培养基6-7中，l-抗坏血酸aa的浓度为200nm；所述培养基6-7中，脑源性神经营养因子bdnf的浓度为20ng/ml。

10、第二个方面，本发明提供一种脊髓类器官的培养方法，所述培养方法包括以下步骤：

11、(1)将人多能干细胞在低粘附96孔u型板形成早期胚状体；

12、(2)将步骤(1)培养后得到的胚状体依次在权利要求2～7任一项所述的培养基1-3中进行培养诱导分化；

13、(3)将步骤(2)得到的胚状体转移至低粘附24孔板，并依次在权利要求2～7任一项所述培养基4-7中继续培养诱导分化，完成脊髓类器官培养。

14、优选地，所述步骤(2)中依次培养诱导分化具体为：在所述培养基1中培养的时间为1天；在所述培养基2中培养的时间为3天；在所述培养基3中培养的时间为2天。

15、优选地，所述步骤(3)中依次培养诱导分化具体为：在所述培养基5中培养的时间为8天；在所述培养基6中培养的时间为4天；在所述培养基7中培养的时间为20-300天。

16、上述技术方案具有如下优点或者有益效果：

17、(1)本发明提供一种脊髓类器官的培养方法和培养基，基于该培养基和培养方法可有效促进多能干细胞在三维培养条件下的高效分化。

18、(2)与现有技术相比，该诱导方案实现类器官在分化早期(20天)表现为脊髓胸腰段特征；在分化第30天表现为脊髓腹侧运动神经元发育特征明显(mn)。本发明中的脊髓类器官在诱导第40天即检测到成熟脊髓运动神经元、中间神经元及胶质细胞，具备成熟的神经电生理活动，并且在长期的体外培养(大于12个月)中可稳定维持活性及功能。

19、(3)本发明提供的类器官培养方法过程简单高效，在类器官的构建领域具有潜在的应用价值。