一株毕赤酵母菌及其含毕赤酵母菌的微生物除磷复合菌剂与应用的制作方法

本发明属于环境微生物领域，具体涉及一株毕赤酵母菌及其含毕赤酵母菌的微生物除磷复合菌剂与应用。

背景技术：

1、水体富营养化已经是全球面临的重大水环境问题，人类活动中氮磷等营养元素进入水体是导致水体富营养化的主要原因。传统的生物除磷工艺是通过活性污泥处理污水过程中的厌氧阶段和好氧阶段的交替运行，为系统中特定的能够“超量吸磷”的微生物营造合适的生长条件，磷随着好氧阶段末端的排泥得到去除。该方法具有操作简单，成本费用低、环境友好无污染等优势，然而传统的聚磷菌反应条件较为复杂，对环境要求也较高，如盐度、温度、ph、对碳源的选择性等外部条件都对此类聚磷菌的除磷效果有巨大的影响。因此，传统的活性污泥法去磷效果参差，往往需要搭配化学沉淀除磷，共同开展除磷工艺。

2、通过生物强化手段降解各类污染物已经屡见不鲜，其主要过程为通过引入具备特定功能微生物，使系统对于特定污染物的降解能力和降解效率都有所提高，成本较之原有工艺改造低廉有效，避免引起二次污染，从而使得生物强化技术在工业废水处理中应用较为普遍。并且由于现今生活污水的组分复杂、受季节性影响较大、碳源复杂等越来越多的问题出现，生物强化技术在生活污水中也具有较好的应用场景。近年来，以生物强化为主要调节手段的新型水处理技术正得到越来越广泛的关注，在高浓度有机废水、污水重金属吸附、有毒废水的生化处理等方面具有良好的应用前景。

3、酵母菌作为一类单细胞真菌，具有耐渗透压、耐酸、耐低温高温、比表面积大、代谢效率高、适应能力强、分布广泛等特点，同时酵母菌是磷的地球化学循环过程中最重要的生物因子之一，但由于酵母在活性污泥中占的比例较小，在过往的污水处理系统中长期被忽视。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一株高效除磷、环境抗逆性强的毕赤酵母菌。

2、本发明还要提供含有上述毕赤酵母菌的微生物除磷复合菌剂。

3、本发明最后要提供上述毕赤酵母菌或含有上述毕赤酵母菌的微生物除磷复合菌剂在强化含磷污水除磷处理中的应用。

4、本发明的发明思路是：水污染问题日益严峻，随着工农业的发展，水体磷污染成为全球面临的一大问题。而传统的生物除磷菌剂受限于严格厌氧-好氧交替工艺，对环境要求较高等壁垒，除磷效果受限，往往需要搭配大量的化学除磷絮凝剂，由此产生的成本过高、二次污染等问题目前仍是困扰环境行业的问题。为了克服上述缺点，本发明旨在提供一株毕赤酵母菌、一种强化生物除磷过程的微生物除磷复合菌剂及其应用，用于强化生物除磷效率，优化除磷工艺。

5、为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

6、一株毕赤酵母菌，分类命名为pichia sp.，菌株号为gxgd-hb-8，保藏编号为gdmccno：63615，已于2023年7月3日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

7、其中，所述的毕赤酵母菌是于2022年10月24日从山东某氨基酸厂的活性污泥和废水中富集分离筛选得到的。

8、对上述毕赤酵母菌gxgd-hb-8进行鉴定：

9、(1)生物学鉴定：白色，稍突，光滑，有光泽，中等大小，圆形，周边整齐；专性或兼性好氧生活，无鞭毛，不能游动；菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一。

10、(2)分子生物学鉴定：its rdna基因序列如seq id no.1所示：tactacactgcgtgagcggacgaaaacaacaacacctaaaatgtggaatatagcatatagtcgacaagagaaatctacgaaaaaccaaccaaactttccacaacgggtctcttggttcccccctccatgaaaaacgccacgaaatgggatacccaatggggattggcaccctccgggatcctccagttcctggaccccccttggccccccccgcatttcgggggggctggctggttgaaccgcctttccctcctggccctgccccaaattgggggaaccgaacggaccaactggaaaaaacgtccgaactgccactcccctggaaaggaaccaaactgggccaaccaactaaaatttttttccaggaccctttgcggcccaaaaccaatggtgccaaaccaccaaaaactccacccccaatccgggaagaaaaccccctgaactttaacctatccataaaccgaagaaaa

11、将该序列在genbank数据库中进行blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)比对，结果发现该序列与pichia sp.菌株的同源性最高。

12、其中，所述的毕赤酵母菌其能够耐受ph 5.5-9.0，温度5～40℃，盐度0～4％的含磷环境，且在不同的碳源污水条件下适应性良好。

13、具体的，在含磷20.0mg/l，ph 5.5～9.0的污水应用条件下，菌株gxgd-hb-8均可以有效除磷，以ph 5.0和9.0条件下，24h除磷率最低，分别为74.5％和82％；以ph 7.0最优，24h除磷率可至最高98％。

14、具体的，在含磷20.0mg/l，温度5～40℃的污水应用条件下，菌株gxgd-hb-8均可以有效除磷，以低温5℃和高温40℃条件下，24h除磷率最低，但仍高达84.1％和87.6％；以中温30℃最优，24h除磷率最高至97％，说明本发明中菌株gxgd-hb-8受温度的制约性不大。

15、具体的，在含磷20.0mg/l，含盐0.5％-4％的污水应用条件下，在盐度不高于4％范围内，菌株gxgd-hb-8均可以有效除磷，盐度4％条件下，24h除磷率最低为73.1％；以含盐0.5％最优，24h除磷率最高至94％。这表明本发明的菌株gxgd-hb-8对盐度有较好的耐受性，尽管随着盐度升高，除磷效果有所下降，但仍保持较高的除磷效率。

16、具体的，在含磷20.0mg/l，在不同碳源污水(油脂废水、乳品废水、屠宰废水、餐厨废水、淀粉废水、制糖废水)应用条件下，菌株gxgd-hb-8对于不同种类的碳源有着良好的生物适应性。其中，以屠宰废水最优，24h除磷率可至100％。这表明本发明筛选得到的菌株gxgd-hb-8应用场景广泛，无特殊碳源需求，易于工业化推广使用。

17、一种微生物除磷复合菌剂，所述的微生物除磷复合菌剂包括上述毕赤酵母菌。

18、进一步的，所述的微生物除磷复合菌剂还包括热带假丝酵母菌candidatropicalis、缺陷短波单胞菌brevundimonas diminuta和广州不动杆菌acinetobacterguangzhouensis.。

19、其中，所述的毕赤酵母菌pichia sp.、热带假丝酵母菌candida tropicalis、缺陷短波单胞菌brevundimonas diminuta和广州不动杆菌acinetobacter guangzhouensis，其体积比为2:(1～2):2:(1～2)。优选的体积比为2:1:2:1.

20、其中，所述的热带假丝酵母菌candida tropicalis)、缺陷短波单胞菌(brevundimonas diminuta)和广州不动杆菌(acinetobacter guangzhouensis)均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)，其编号依次为2.1387、1.8077、1.12967，在文中分别用pao-1、pao-2、pao-3表示。

21、具体的，是将活化后的各个菌株的种子液按照10％v/v的接种量分别接种到装有40l种子培养基的50l发酵罐中进行种子液培养，得到各个菌株的种子液。然后将上述制得的各个菌种的种子液按照2:1:2:1的体积比混合制成混合种子液，接着在无菌条件下按上述混合种子液2％～5％的重量百分比添加保护剂至混合种子液中，获得液体微生物除磷复合菌剂。经-80℃冷冻干燥24h后获得干粉状微生物除磷复合菌剂。

22、其中，所述的微生物除磷复合菌剂，其活菌数≥6.5×109cfu/ml。

23、上述毕赤酵母菌在强化含磷污水除磷处理中的应用也在本发明所保护的范围之内。

24、上述含有所述毕赤酵母菌的微生物除磷复合菌剂在强化含磷污水除磷处理中的应用也在本发明所保护的范围之内。

25、具体的，在实际工业含磷污水中的应用中，取南京江北新区某医药公司污水厂污水(医药废水)为原水，开展常温条件下a/o工艺除磷实验，该污水站日处理水量为50吨水，水力停留时间在48h内，并且污水水质ph呈中性，cod在300～700mg/l波动，总氮在50～90mg/l波动，盐度约为1％，总磷在30～50mg/l波动。经a/o工艺处理后，生化尾端出水的磷含量约为20mg/l上下。按照的投加比例(即一立方污水投加500g菌粉)投加上述含所述毕赤酵母菌的微生物除磷复合菌剂后，出水含磷总量降至8mg/l以下，除磷率稳定在78.9％以上。

26、具体的，在实际污水厂中的应用中，取南京江北新区某污水处理厂污水为原水，开展常温单一好氧曝气工艺除磷实验。其中，污水厂的原水的cod为150mg/l上下，ph近中性，总氮在25mg/l上下波动，总磷在3.0-8.0mg/l波动，经好氧曝气处理后，要求出水总磷达到污水综合排放二级标准，即1mg/l以下。实验在一个容积200l的好氧罐中开展，其中水力停留时间为27h，通气量为1:0.8～1.2。按照的投加比例(即一立方污水投加200g)投加上述含所述毕赤酵母菌的微生物除磷复合菌剂后，出水端的总磷含量稳定在0.8mg/l以下，最低能够无磷检出，除磷率稳定在90％以上。

27、有益效果：

28、(1)本发明经富集、分离纯化筛选到了一株高效除磷、环境抗逆性强的毕赤酵母菌(pichia sp.)，并通过复配获得了一种能够强化生物除磷过程的微生物除磷复合菌剂。

29、(2)本发明筛选得到的毕赤酵母菌(pichia sp.)gxgd-hb-8能够适应ph 5.5～9.0、温度5～40℃、盐度0～4％条件下的含磷污水，同时能够适应不同碳源(油脂废水、乳品废水、屠宰废水、餐厨废水、淀粉废水、制糖废水和/或医疗废水)的含磷污水，有很宽的碳源选择性，其除磷率最高可至100％。

30、(3)传统的生物除磷菌剂受限于严格厌氧-好氧交替工艺，对环境要求较高等壁垒，除磷效果受限，往往需要搭配大量的化学除磷絮凝剂。本发明制备得到的微生物除磷复合菌剂充分发挥了真菌和细菌的协同降解作用，且相互间无拮抗作用，不但适用于传统的a/o交替工艺，也适用于非严格单一好氧工艺，同时不会造成二次污染，显著降低了除磷成本，具有广泛的工业应用前景。