一种调节巨噬细胞极化的方法

本发明涉及生物医药，具体来说，涉及一种调节巨噬细胞极化的方法。

背景技术：

1、在肿瘤微环境中巨噬细胞是其中一个主要的组成成分，可以分化为不同的功能表型，其中m2型的巨噬细胞可以通过多种机制促进肿瘤的生长。在高级别胶质瘤含有丰富的髓样细胞，在多形性胶质母细胞瘤(gbm)中，肿瘤相关巨噬细胞和小胶质细胞占肿瘤总质量的40％。gbms产生的细胞因子，如巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)，使巨噬细胞和小胶质细胞向免疫抑制、促进肿瘤生长的m2型极化，m-csf是一种重要的细胞因子，通过其受体csf-1r介导巨噬细胞的分化和功能。m-csf和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)常用于诱导成熟的巨噬细胞，分别参与向m2或m1表型的极化。干扰素调节因子(irfs)是m-csf和gm-csf诱导巨噬细胞极化能力的基础，irf5激活促进il-12、il-6编码基因的转录，从而与m1极化相关，而irf4缺失导致il-1β和tnfα的产生以及m1标记物的表达增加，表明irf4激活有助于m2极化。

2、巨噬细胞是病毒感染中i型干扰素(ifn)的主要来源，而tank结合激酶1(tbk1)可以介导i型ifn基因的诱导，参与抗病毒先天免疫应答。

3、在树突状细胞中tbk1的缺失抑制了一些干扰素应答基因的表达。此外，条件性敲除tbk1的树突状细胞表现出免疫抑制因子il-10的下调和几种免疫刺激因子的上调，包括il-1β、il-12和il-23。通过调节免疫耐受，树突状细胞中tbk1缺乏可促进肿瘤逃逸。

4、在不同疾病模型的巨噬细胞中，tbk1在其中起着至关重要的抗炎作用。有研究报道将髓系细胞中tbk1特异性敲除的小鼠(mko)，在老年时自发发生脂肪肥大和代谢紊乱，与脂肪组织m1型巨噬细胞浸润和促炎细胞因子表达增加有关。

5、在人单核/巨噬细胞中，趋化因子cxcl4和toll样受体8(tlr8)的共刺激可协同激活tbk1-irf5信号，导致炎症基因的增加和炎性小体的激活，这表明靶向tbk1-irf5轴可能对炎症性疾病有益。然而，tbk1在巨噬细胞中的作用，特别是在m-csf刺激的情况下，调节巨噬细胞极化以及与调节irfs的潜在的机制尚不清楚。

技术实现思路

1、(一)解决的技术问题

2、针对现有技术的不足，本发明提供了一种调节巨噬细胞极化的方法，它采用磁珠的细胞分选方案进行细胞分离，制备单细胞悬液后，用抗cd11b粒子标记肿瘤或瘤周组织的阳性细胞，标记后，使用bd imagtm磁性细胞分选仪分离细胞，收集阴性(cd11b-)和阳性(cd11b+)部分进行分析的优点，进而解决了上述背景技术中的问题。

3、(二)技术方案

4、为实现上述,采用磁珠的细胞分选方案进行细胞分离，制备单细胞悬液后，用抗cd11b粒子标记肿瘤或瘤周组织的阳性细胞，标记后，使用bd imagtm磁性细胞分选仪分离细胞，收集阴性(cd11b-)和阳性(cd11b+)部分进行分析的优点，本发明采用的具体技术方案如下：

5、一种调节巨噬细胞极化的方法，它采用磁珠的细胞分选方案进行细胞分离，制备单细胞悬液后，用抗cd11b粒子标记肿瘤或瘤周组织的阳性细胞，标记后，使用bd imagtm磁性细胞分选仪分离细胞，收集阴性(cd11b-)和阳性(cd11b+)部分进行分析,它包含骨髓来源的巨噬细胞、动物模型的建立、免疫印迹实验、免疫荧光染色、免疫组织化学与实时定量pcr分析。

6、骨髓来源的巨噬细胞的获取；用dmem冲洗tbk1fl/fllysm-cre(tbk1-mko)小鼠或tbk1fl/fl野生型(wt)小鼠的胫骨和股骨中的骨髓,将细胞通过70μm尼龙过滤器过滤；在室温下500rpm离心5min后，将细胞重悬于含有10％胎牛血清的dmem/f12中，骨髓细胞在25cm2无菌瓶中以2×106/ml的浓度在dmem/f12中培养；加入巨噬细胞集落刺激因子(m-csf,10ng/ml,peprotech)，在37℃、5％ co2条件下培养7天，获得分化的巨噬细胞。

7、建立动物模型；其中，动物为tbk1fl/fl小鼠与lysm-cre小鼠，通过tbk1fl/fl小鼠与lysm-cre小鼠杂交，获得tbk1fl/fllysm-cre(以下命名为tbk1-mko)和tbk1fl/fl野生型(wt)小鼠；通过pcr基因型鉴定确定基因型，选择6-8周龄小鼠用于研究，饲养条件为受控条件(光照/黑暗循环12h，相对湿度60％±10％，温度22±1℃)。

8、gbm的动物模型；将gl261细胞接种到c57bl/6小鼠的纹状体中，小鼠用2％戊巴比妥钠(3.3μl/g)静脉注射麻醉，手术区皮肤用碘伏液消毒，并将动物固定在一个小动物立体定向装置中；在眶后1mm、中线右侧2mm处做一个2-3mm的切口，暴露颅骨，使用1ml注射器和26g针在前囟右侧2mm处钻孔，用25μl汉密尔顿注射器注射1×105gl261细胞；注射完成后，等待2-3min后再逐步退出，在缝合皮肤之前用碘伏擦拭头骨；建立皮下(sc)肿瘤模型，将2x106 gl261细胞皮下注射到tbk1fl/fllysm-cre(tbk1-mko)小鼠或tbk1fl/fl野生型(wt)小鼠的腋下，每组2-4只小鼠，实验重复3次。

9、免疫印迹；提取细胞的蛋白质，将细胞放入含有磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂和pmsf的预冷ripa缓冲液中进行裂解；采用bca蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度，在10％或12％的sds-聚丙烯酰胺凝胶上分离，上样量为30μg，随后将其转移到pvdf膜上。将膜与一抗在4℃下孵育过夜，二抗37℃孵育1h后，使用红外成像系统获取图像，检测感兴趣的波段，采用imagej软件进行定量分析。

10、免疫荧光染色；荷瘤小鼠于第3周麻醉，经4％多聚甲醛灌注，切除肿瘤组织，并在4％多聚甲醛中后固定，使用震荡切片机切割为25μm的切片。用马血清封闭30min后，0.3％triton x-100pbs在室温下打孔30min后，加入一抗，在4℃下孵育过夜，切片用荧光二抗孵育1h，并用hoechst33342在37℃的避光容器中进行核染色15min。使用荧光共聚焦显微镜获得图像。

11、免疫组织化学；将wt小鼠中分离的bmdms接种在24孔板的玻片上，单独用m-csf或与tbk1抑制剂一起处理，用4％多聚甲醛固定细胞；用pbs洗涤3次，使用含有10％马血清的0.3％triton x-100pbs进行细胞渗透和阻断30min，在3％过氧化氢中室温孵育15min，将细胞与抗tbk1、磷酸化tbk1、irf5、irf4、inos和arg1的抗体在4℃下孵育过夜。将载玻片与生物素偶联的二抗在室温下孵育1h，然后与hrp偶联的链霉亲和素孵育1h，并以3,3二氨基联苯胺作为显色剂孵育5min，用光镜观察和分析切片。

12、实时定量pcr；提取细胞总rna后，利用逆转录系统合成cdna，用sybr green在m3005p仪器上进行测定，所有样品在95℃反应体系中处理10min，然后在95℃、60℃、72℃分别扩增10s、20s、20s，循环40次，通过δct方法将靶基因的ct水平归一化为gapdh的水平，计算相对基因表达水平，使用δδct方法将数据进一步归一化到实验对照样本(2-δδct)。

13、(三)有益效果

14、与现有技术相比，本发明提供了一种调节巨噬细胞极化的方法，具备以下有益效果：

15、它实现了p-tbk1在m-csf刺激的巨噬细胞中高表达，tbk1的缺失诱导m-csf刺激的巨噬细胞表现出m1样表型，irf4和irf5是tbk1调控m-csf刺激下的巨噬细胞极化的重要转录因子，敲除irf5后，逆转了抑制tbk1对m-csf相关巨噬细胞极化作用的影响。