叶酸代谢基因MTHFR多态性位点快速检测的制作方法

本发明涉及一种叶酸代谢基因多态性位点的基因型检测。

背景技术：

1、叶酸是维生素b家族中的一员，参与dna的合成、甲基化供体的生成、以及许多氨基酸的代谢过程。叶酸的缺乏会增加心血管疾病、认知功能障碍和某些癌症的风险。在严重缺乏时，还会造成巨幼红细胞性贫血，引起疲劳气短和无力的症状。人亚甲基四氢叶酸还原酶(mthfr)是叶酸代谢的一种必需酶，它能够催化5,10-亚甲基四氢叶酸转变为5-甲基四氢叶酸，且5-甲基四氢叶酸与同型半胱氨酸的代谢密切相关。目前已有多个mthfr基因多态性已被发现与酶活性降低和叶酸摄入量有关，其中c.677c>t(也称为rs1801133)最具有临床意义，c.677c>t突变会引发第222位丙氨酸被缬氨酸替代，通过影响蛋白构象形成热不稳定蛋白而明显降低酶活性。mthfr c.677c>t多态性与多种疾病的危险性相关，包括出生缺陷、高危妊娠、心脑血管疾病等。因此，临床环境中mthfr c.677c>t多态性的基因型鉴定有助于为个性化营养补充或治疗决策提供信息。

2、早期对mthfr c.677c>t多态性基因分型的方法多样，大多数采用pcr-rflp技术，但操作过程繁琐，周期较长；测序法作为基因检测的金标准，需要昂贵的测序仪，并且对技术人员要求较高，操作过程复杂；基因芯片技术可以实现高通量全自动基因分型，但对dna质量要求高，价格昂贵，并且周期较长。这些技术不足之处在于检测样本主要来源是成人静脉血，是侵入性取样，并且样品制备过程操作繁琐，检测时间较长，测序成本高，数据分析难度较大。

技术实现思路

1、本发明的目的在于针对叶酸代谢基因mthfr多态性位点c.677c>t，提供一种快速准确的检测手段。

2、根据本发明的第一方面，提供了一种用于叶酸代谢基因mthfr多态性位点c.677c>t的检测试剂盒，包括：

3、序列号为seq no.1的on crrna；

4、序列号为seq no.2的off crrna；

5、cpf1蛋白；

6、扩增引物对，包含序列号为seq no.3、seq no.4或seq no.5的上游扩增引物以及序列号为seq no.6、seq no.7或seq no.8的下游扩增引物；及

7、ssdna报告系统。

8、根据本发明的试剂盒的一个优选实施例，上游扩增引物的序列号为seqno.5，下游扩增引物的序列号为seq no.8。

9、根据本发明的试剂盒，其中ssdna报告系统包括用于酶标仪荧光检测的ssdna fqreporter和/或用于免疫胶体金试纸条检测的ssdna db reporter。

10、另外，本发明的试剂盒还可以包括其它所需合适检测试剂。

11、根据本发明的另一方面，还提供了一种用于叶酸代谢基因mthfr多态性位点c.677c>t的非诊断目的检测方法，包括：

12、提供待测样品并将其分成两份独立样品；

13、在其中一份独立样品中加入扩增引物对、cpf1蛋白、on crrna和ssdna报告系统进行扩增及酶切检测；

14、在另一份独立样品中加入扩增引物对、cpf1蛋白、off crrna和ssdna报告系统进行扩增及酶切检测；以及

15、比较两份独立样品的检测结果并基于比较结果确定叶酸代谢基因mthfr多态性位点c.677c>t的基因分型，

16、其中on crrna序列号为seq no.1，off crrna序列号为seq no.2，

17、扩增引物对，包含序列号为seq no.3、seq no.4或seq no.5的上游扩增引物以及序列号为seq no.6、seq no.7或seq no.8的下游扩增引物。

18、根据本发明的检测方法，ssdna报告系统可以为用于酶标仪荧光检测的ssdna fqreporter，当基于on crrna和基于off crrna检测的荧光比值大于1.5时，判断待测样本为纯合野生型cc样本；当比值小于0.5时，判断待测样本为纯合突变型tt样本；当比值介于0.5-1.5之间时，判断待测样本为杂合型ct样本。

19、在使用酶标仪荧光检测时，当cpf1检测体系中存在野生型mthfr基因c.677-c位点，会由在on crrna介导下特异性激活cpf1蛋白的核酸内切酶活性，激活后的cpf1蛋白会切割由荧光基团和淬灭基团标记的ssdna fq reporter,从而释放激活荧光基团，使用酶标仪可以检测到荧光读数。相对应的，待检测样品中存在突变的mthfr基因c.677-t位点，会由在off crrna介导下特异性激活cpf1蛋白的核酸内切酶活性，激活后的cpf1蛋白会切割由荧光基团和淬灭基团标记的ssdna fq reporter,从而释放激活荧光基团，使用酶标仪可以检测到荧光读数。

20、根据本发明的检测方法，其中ssdna报告系统可以为用于免疫胶体金试纸条检测的ssdna db reporter，当只有on crrna或off crrna检测结果有阳性条带时，判定样本为纯合野生型cc样本或纯合突变型tt样本，当on crrna和off crrna检测结果均有阳性条带时，判断待测样本为杂合型ct样本。

21、在使用免疫胶体金试纸条检测时，当cpf1切割后待检测样品加入到胶体金试纸条后，被胶体金标记的鼠抗地高辛抗体会与地高辛标记的ssdna报告系统结合，复合物随液流方向从质控线走向检测线；质控线链霉亲和素饱和抓获标记有生物素标的ssdna报告系统，从而显示条带；当cpf1-oncrrna检测到mthfr基因c.677-c正常序列时，会将标记有地高辛和生物素ssdna报告系统切割断开，从而会有地高辛标记的ssdna片段被检测线抓获显色，当cpf1-off crrna检测到mthfr多态性位点t时，将标记有地高辛和生物素ssdna报告系统切割断开，从而产生地高辛标记的ssdna片段被检测线抓获的显色。

22、鉴于对mthfr基因多态性位点进行检测时，纯合野生型，纯合突变型和杂合型的检测信号不同，本发明设计了基因分型方案以更好判读阳性结果：分别对突变位点设计两条crrna，一条on crrna与wt完全匹配，一条off crrna与突变序列完全匹配；基于两条crrna得出的检测信号，得出检测样本类型为纯合患者或突变携带者。

23、本发明的特异性crrna的制备策略是：针对叶酸代谢基因mthfr多态性位点c.677c>t，寻找包含cpf1次优识别序列(pam)tvtv的靶向序列，设计相应长度的crrna，之后合成dna oligo，构建到载体pgl3-t7-crrna，通过体外转录获得目的on/off crrna。

24、本发明还进一步优化了单管法检测体系以实现更好的基因分型效果：针对叶酸代谢基因mthfr多态性位点c.677c>t，寻找包含cpf1次优识别序列tvtv的靶向序列，然后在两端共延伸约200个碱基的位置设计恒温扩增引物，通过对比及测试先扩增后检测的分管法基因分型效果与结合恒温扩增与次优pam cpf1检测体系的单管法基因分型效果，确定mthfr多态性位点c.677c>t基因分型策略；然后，通过对比多种引物组合的单管法基因分型信号差异，以提高on crrna和off crrna的区分信号，找到叶酸代谢基因mthfr多态性位点更好进行基因分型的扩增引物以用于后续试剂盒的检测。

25、本发明通过利用cpf1特异识别核酸和/或联合免疫侧流层析技术，实现对叶酸代谢基因mthfr多态性位点的高准确性、高特异性及快速可视化检测。

26、本发明由此建立了针对叶酸代谢基因mthfr多态性位点的结合恒温扩增和次优pam cpf1检测的单管法检测体系。同时，通过优化恒温扩增引物进一步提升了基因分型的信号差异，能够实现更好的mthfr多态性的纯合与杂合的区分。本发明所建立的mthfr基因多态性位点的快速检测方法，为临床诊断和实验室研究提供了一个准确、快速、简便的检测方法。

27、本发明耗时短、操作简便，其中基于cpf1胶体金试纸的检测方法尤其适用于实验室快速检测和准确判断。