一种用于树突状细胞的引物组、试剂盒及其应用

本发明涉及生物，特别是涉及一种用于树突状细胞的引物组、试剂盒及其应用。

背景技术：

1、树突状细胞是t细胞成熟的关键启动者，是肿瘤免疫治疗的新兴力量，体外恢复肿瘤患者树突状细胞功能，可增强肿瘤特异性t细胞免疫效应。

2、制备自体肿瘤多信号活化树突状细胞的过程包括分离患者外周血单核细胞分离、扩增dcs、肿瘤抗原刺激树突状细胞活化，并再次与患者pbmc共培养，使之成为肿瘤特异性的ctls和htls，从外周静脉回输给患者。因为整个制备过程均为体外操作，可能受到细菌污染，所以在回输给患者之前需要进行微生物学检测确保安全，另外，抗原特异性树突状细胞整个的体外培养诱导过程约14天，在回输之前也需要刮取部分细胞进行检测以确认表型。

3、为了达到上述质量控制目的，确保树突状细胞回输的安全性及有效性，现有的方法为逐项检测，在细胞培养过程中分别进行细菌、真菌培养，刮取大量培养瓶中的树突状细胞进行流式表型检测，然而这些方法费时、繁琐，且容易损伤并损失所培养的树突状细胞。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明提供一种用于树突状细胞的引物组，采用该引物组能够简单、有效地对体外培养至成熟、活化的树突状细胞进行检测，从而对其培养情况进行质控，采用该引物组进行检测不仅具有高灵敏性、特异性，还能减少树突状细胞的损伤和损失。

2、为了达到上述目的，本发明提供了一种用于树突状细胞的引物组，包括：病原体引物组、树突状细胞表型引物组、hla-dr引物组、血红蛋白亚基β引物组中的至少1个；

3、所述病原体引物组的扩增目标序列选自：n-乙酰胞壁酸和/或1-3-β-d-葡聚糖的序列。

4、在其中一个实施例中，所述病原体引物组包括细菌引物组和/或真菌引物组；

5、所述细菌引物组包括：

6、上游引物：acggagatgcaaaatcccca(seq id no:1)；

7、下游引物：agcagtttggcgtaccgtaa(seq id no:2)；

8、探针：5’-acttgccctccactcgatcctcgtacaa-3’(seq id no:3)；

9、所述真菌引物组包括：

10、上游引物：ccgtagtagtccatgtccgc(seq id no:4)；

11、下游引物：ccttgaacggtctccaggac(seq id no:5)；

12、探针：5’-acttgccctccactcgatcctcgtacaa-3’(seq id no:6)。

13、在其中一个实施例中，所述病原体引物组的探针的5’端修饰有荧光基团，所述荧光基团为fam；所述病原体引物组的探针的3’端修饰有淬灭基团，所述淬灭基团为bhq1。

14、上述病原体引物组用于检测树突状细胞培养体系有无病原体污染。

15、在其中一个实施例中，所述树突状细胞表型引物组包括：cd3引物组、cd14引物组、cd19引物组、cd20引物组、cd56引物组中的至少1种；

16、所述cd3引物组包括：

17、上游引物：tcccttccctaagcggctat(seq id no:7)；

18、下游引物：ccaataggtggcgcttctga(seq id no:8)；

19、探针：5’-actaataggtgctcgatcctcgtacaa-3’(seq id no:9)；

20、所述cd14引物组包括：

21、上游引物：acgccagaaccttgtgagc(seq id no:10)；

22、下游引物：gcatggatctccacctctactg(seq id no:11)；

23、探针：5’-actggatctccaccgatcctcgtacaa-3’(seq id no:12)；

24、所述cd19引物组包括：

25、上游引物：ggcccgaggaacctctagt(seq id no:13)；

26、下游引物：taagaagggtttaagcgggga(seq id no:14)；

27、探针：5’-actcccgaggactcgatcctcgtacaa-3’(seq id no:15)；

28、所述cd20引物组包括：

29、上游引物：ccggcagagccaatgaaag(seq id no:16)；

30、下游引物：cagatgggtgcatagatccct(seq id no:17)；

31、探针：5’-acttcagagccaaccaatcctcgtacaa-3’(seq id no:18)；

32、所述cd56引物组包括：

33、上游引物：ggcatttacaagtgtgtggttac(seq id no:19)；

34、下游引物：ttggcgcattcttgaacatga(seq id no:20)；

35、探针：5’-acttgcccttcttgaacctcgtacaa-3’(seq id no:21)。

36、在其中一个实施例中，所述树突状细胞表型引物组的探针的5’端修饰有荧光基团，所述荧光基团为rox/red610；所述树突状细胞表型引物组的探针的3’端修饰有淬灭基团，所述淬灭基团为bhq2。

37、上述树突状细胞表型引物组用于检测树突状细胞表型的阴性标志物，进而明确树突状细胞的表型。

38、在其中一个实施例中，所述hla-dr引物组包括：

39、上游引物：agtccctgtgctaggatttttca(seq id no:22)；

40、下游引物：acataaactcgcctgattggtc(seq id no:23)；

41、探针：5’-actactcgcctgattggatcctcgtacaa-3’(seq id no:24)。

42、在其中一个实施例中，所述hla-dr引物组的探针的5’端修饰有荧光基团，所述荧光基团为cy5；所述hla-dr引物组的探针的3’端修饰有淬灭基团，所述淬灭基团为bhq3。

43、上述hla-dr引物组为阳性内标。

44、在其中一个实施例中，所述血红蛋白亚基β引物组包括：

45、上游引物：aggagaagtctgccgttactg(seq id no:25)；

46、下游引物：ccgagcactttcttgccatga(seq id no:26)；

47、探针：5’-acttgccctccaactcgcctgattgcaa-3’(seq id no:27)。

48、在其中一个实施例中，所述血红蛋白亚基β引物组的探针的5’端修饰有荧光基团，所述荧光基团为hex/joe；所述血红蛋白亚基β引物组的探针的3’端修饰有淬灭基团，所述淬灭基团为tamra。

49、上述血红蛋白亚基β引物组为内参内标。

50、本发明还提供了所述引物组在制备用于树突状细胞质控试剂盒中的应用。

51、本发明还提供了一种用于树突状细胞质控的试剂盒，该试剂盒包括多重荧光定量pcr反应体系，所述多重荧光定量pcr包括所述引物组。

52、在其中一个实施例中，所述引物组的工作浓度为50μm。

53、所述工作浓度为上述引物组在使用时能够达到预期效果的浓度，可以理解的，本领域技术人员在配制含有上述引物组的试剂时，可以配制浓度更高的母液或者储备液，待使用时再稀释，所述母液或者储备液及其浓度均在本发明的保护范围之内。

54、在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括多重荧光定量pcr反应液。

55、在其中一个实施例中，所述多重荧光定量pcr反应液为商售产品(promegaqpcr master mix,a6010)。

56、本发明还提供了一种树突状细胞的质控方法，包括以下步骤：培养树突状细胞至成熟、活化，得到含有活化树突状细胞的培养液，取上清液，提取核酸，逆转录为cdna，采用所述试剂盒进行多重荧光定量pcr反应。

57、通过上述质控方法，不仅能检测培养得到的树突状细胞是否受到细菌或真菌的污染，还能通过一步操作同时检测树突状细胞的表型，达到质控目的。

58、在其中一个实施例中，所述培养树突状细胞至成熟、活化包括以下步骤：对待测样本进行单核细胞分离，扩增dcs，肿瘤抗原刺激树突状细胞活化，与pbmc共培养，得到肿瘤特异性的ctls和htls。

59、在其中一个实施例中，所述多重荧光定量pcr反应的条件包括：95℃预变性5min，95℃变形10s，60℃退火30s，共45个循环。

60、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

61、本发明的一种用于树突状细胞的引物组、试剂盒及其应用，采用该引物组能够简单、有效地对体外培养至成熟、活化的树突状细胞进行检测，从而对其培养情况进行质控，采用该引物组进行检测不仅具有高灵敏性、特异性，还能减少树突状细胞的损伤和损失。采用该试剂盒，能够通过多重荧光定量pcr反应对培养得到的树突状细胞进行质控，不仅能检测培养得到的树突状细胞是否受到细菌或真菌的污染，还能通过一步操作同时检测树突状细胞的表型，进而达到一次性进行质量控制的目的。在大批量培养树突状细胞的过程中，与传统的细菌、真菌培养，刮取树突状细胞进行抗体标记染色、上机检测相比，该试剂盒将大大减少工作量、节约时间和成本。