一种牛卵母细胞成熟液和应用

本发明属于动物繁殖，尤其涉及一种牛卵母细胞成熟液和应用。

背景技术：

1、本部分的陈述仅仅是提供了与本发明相关的背景技术信息，不必然构成在先技术。

2、家畜胚胎工程技术是优秀种质快速繁育的重要途径。为提高供体母牛使用效率，通常采用活体采卵-体外胚胎生产技术扩繁良种。牛卵母细胞的体外成熟是生产体外胚胎的关键步骤，卵母细胞质量不高是导致胚胎生产效率低的主要因素。优化牛卵母细胞体外成熟培养液、改进体外成熟方法是改善卵母细胞质量、提高体外胚胎生产技术效率的有效手段。

3、在卵母细胞体外成熟过程中，其外表包裹的卵丘细胞分泌的激素与细胞因子对于卵母细胞成熟过程发挥了重要促进作用。但是，体外培养环境经常出现卵丘细胞发生凋亡、生长缓慢的现象，导致卵丘细胞功能受损，卵母细胞成熟度差，降低了囊胚获得率及体外胚胎移植成功率。

技术实现思路

1、为克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种牛卵母细胞成熟液和应用。本发明的主要目的是为了进一步提高体外牛卵母细胞成熟率，促进囊胚获得率、提高牛体外胚胎生产效率。

2、为实现上述目的，本发明的一个或多个实施例提供了如下技术方案：

3、本发明的第一方面，提供脂氧素在如下任意一种或多种的应用：

4、1)体外促进卵母细胞成熟或制备促进卵母细胞成熟试剂中的应用；

5、2)体外提高囊胚获得率或制备提高囊胚获得率试剂中的应用；

6、3)体外促进卵丘细胞增殖或制备促进卵丘细胞增殖试剂中的应用；

7、4)体外中和炎性因子或者制备抗炎性因子试剂中的应用；

8、5)提高牛体外胚胎生产效率及制备提高体外胚胎生产效率试剂中的应用；

9、所述脂氧素包括lxa4；

10、所述卵母细胞为有2层以上卵丘细胞包裹的卵母细胞；

11、所述卵母细胞来源于牛；

12、所述囊胚为受精后7天所得囊胚；

13、所述应用包括用于制备细胞模型或动物模型，包括制备科研试剂。

14、脂氧素是一种内源性的脂氧合酶衍生的类二十烷酸调节剂，具有抑制细胞炎症因子释放、中和细胞炎症反应的作用。以往的研究中，重视脂氧素在体内的抗炎作用，但是体外是否能够有效抑制炎症因子释放、中和炎症因子，或者其能否作为一种细胞培养基添加剂，提高体外胚胎生产效率并不可知。

15、本发明具体实施方式中，将脂氧素配置成1μm、10μm、100μm的1000x浓缩液。具体操作方法为，向250μl 283μm的脂氧素中加入457.5μl乙醇，即得到100μm的1000x浓缩液；取100μm的1000x浓缩液100μl，加入900μl乙醇混合，即得到10μm的1000x浓缩液；取10μm的1000x浓缩液100μl，加入900μl乙醇混合，即得到1μm的1000x浓缩液。各浓度1000x浓缩液每管分装10μl后，存储于-80℃超低温冰箱。

16、本发明的第二方面，提供一种卵母细胞成熟液，所述卵母细胞成熟液在基础培养基中添加10-100nm脂氧素；

17、所述脂氧素为lxa4；

18、所述卵母细胞来源于牛。

19、在本发明的具体实施方式中，所述基础培养基为m199、ncsu-37、ncsu-23、ham’sf10、α-mem中的任一种；优选为m199。

20、在本发明的具体实施方式中，所述卵母细胞成熟液还包括胎牛血清、fsh、egf、igf-1、glutamax、青-链霉素100x浓缩液；

21、优选的，所述卵母细胞成熟液还包括体积分数8-15％的胎牛血清，0.3-0.8μg/mlfsh，8-15ng/ml egf，8-15ng/ml igf-1，体积分数0.5-1.5％的glutamax，体积分数0.5-1.5％的青-链霉素100x浓缩液。

22、在本发明的具体实施方式中，所述卵母细胞成熟液中还包括体积分数10％的胎牛血清，0.5μg/ml fsh，10ng/ml egf，10ng/ml igf-1，体积分数1％的glutamax，体积分数1％的青-链霉素100x浓缩液。

23、本发明的第三方面，提供第二方面所述的卵母细胞成熟液在如下任意一种中的应用：

24、1)体外促进卵母细胞成熟或制备促进卵母细胞成熟试剂中的应用；

25、2)体外提高囊胚获得率或制备提高囊胚获得率试剂中的应用；

26、3)体外促进卵丘细胞增殖或制备促进卵丘细胞增殖试剂中的应用；

27、4)体外中和炎性因子或者制备抗炎性因子试剂中的应用；

28、5)提高牛体外胚胎生产效率及制备提高体外胚胎生产效率试剂中的应用。

29、本发明的第四方面，提供一种体外促进牛卵母细胞成熟的方法，将牛卵丘-卵母细胞复合体置于第二方面所述的卵母细胞成熟液中，5％二氧化碳、饱和湿度、38.5℃的培养箱中培养20-24h获得；

30、或，

31、将牛卵丘-卵母细胞复合体置于细胞培养基i中，5％二氧化碳、饱和湿度、38.5℃的培养箱中培养6-18h后，滴加脂氧素继续以相同条件继续培养2-18h后获得，总培养时间为20-24h；

32、所述卵母细胞中有2层以上卵丘细胞包裹。

33、作为优选方案，可将30-50个牛卵丘-卵母细胞复合体置于50-100μl卵母细胞成熟液微滴中或将80-120个牛卵丘-卵母细胞复合体置于装有200-300μl卵母细胞成熟液的孔中体外成熟培养。

34、在本发明的具体实施方式中，将牛卵丘-卵母细胞复合体置于细胞培养基i中，5％二氧化碳、饱和湿度、38.5℃的培养箱中培养12h后，滴加脂氧素以相同培养条件继续培养2-18h后获得。

35、本发明的第五方面，提供一种促进卵丘细胞增殖的方法，包括以下步骤：

36、1)从牛卵丘-卵母细胞复合体中分离获得卵丘细胞；

37、2)将步骤1)所得卵丘细胞置于细胞培养基ii中，5％二氧化碳、饱和湿度、38.5℃的培养箱中培养6-24h后获得；

38、其中细胞培养基ii中含有10-100nm脂氧素；

39、优选的，所述细胞培养基ii以m199培养液为基础培养基，添加8-15％的胎牛血清、0.5-1.5％青-链霉素及10-100nm脂氧素；

40、优选的，脂氧素添加量为10nm或100nm。

41、本发明的第六方面，提供一种提高牛体外胚胎的生产效率的方法，所述方法包括：

42、1)获取牛卵丘-卵母细胞复合体；

43、2)采用第四方面所述方法将步骤(1)获取的牛卵丘-卵母细胞复合体培养获得成熟牛卵母细胞；

44、3)将步骤2)获得的成熟牛卵母细胞置于体外受精培养液中，与精子混合培养10-16h获得合子期胚胎；

45、4)采用透明质酸酶去除步骤3)合子期胚胎中的卵丘细胞，将去除卵丘细胞后的胚胎转移到胚胎体外培养液中培养7-8天。

46、以上一个或多个技术方案存在以下有益效果：

47、现有技术中，优化牛卵母细胞体外成熟的途径目前主要为通过外源添加细胞因子或激素，或通过添加无血清培养基等达到抗氧化、促生长等目的。本发明中，首次发现脂氧素能够有效促进牛卵母细胞成熟。

48、本发明发现，脂氧素的添加可有效提高牛卵母细胞成熟效率，促进卵丘细胞增殖，还能降低卵丘细胞炎性因子释放，提高了胚胎发育能力、牛体外胚胎生产效率。

49、本发明还确定了进一步提高牛卵母细胞成熟率及囊胚获得率的方法，通过研究发现，在体外培养牛卵丘-卵母细胞复合体12h后添加一定量脂氧素，更有利于提高牛体外胚胎生产效率。

50、本发明附加方面的优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。