专利名称：新的免疫避孕肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及能够诱发抗透明带蛋白ZP3的免疫应答的肽，用该肽产生能与其发生免疫反应的抗体、单克隆抗体的用途，能产生所述抗体的杂交瘤细胞系，将所述肽或所述抗体用于制备避孕疫苗的用途，含有所述肽或抗体的避孕疫苗，将所述肽用于检测样品中抗ZP3的自身免疫抗体的用途，含有所述抗体的诊断试剂盒和用于检测样品中抗ZP3的自身免疫抗体的检验试剂盒。
透明带(ZP)是哺乳动物卵母细胞周围的复合胞外糖蛋白基质。该基质是在卵母细胞成熟初期和卵泡发育初期形成的，它包括三种高度糖基化的蛋白，被称为ZP1、ZP2或ZP3。所述ZP在受精过程中起着重要作用，因为哺乳动物配子之间的首次相互作用是由精子与ZP上的特异受体的结合引起的。在小鼠中，ZP3糖蛋白已被证实为位于精子表面膜里的互补分子的迎精体(其综述参见Wasserman，Development 1081-17，1990)。ZP3的上述配体功能可引发一种被称为顶体反应的过程，该反应的结果会释放出蛋白酶，使得所述精子穿透透明带并通过与卵母细胞的质膜融合而使卵母细胞受精。
ZP3糖蛋白在精-卵相互作用中的重要作用及其卵母细胞特异表达的事实提示我们，ZP蛋白可作为理想的靶抗原，用于开发避孕疫苗(例如，Gwatkin等，Fert.Ster.28871-877，1977；Paterson和Aitken，Gurr.Opinion in Immunol.，2743-747，1990)。在很多研究中都已证实，给哺乳动物接种猪的透明带蛋白可产生抗所用抗原的高抗体效价，并伴随不育。通过体外研究，也可获得了预示ZP3免疫的避孕效果的结果。业已证实，抗ZP3特异抗体能抑制雄配子同盐储人卵母细胞的结合(van Duin等，Hum.Reprod.9(Suppl.4)41，1994)，而且还会破坏人体的体外受精(Henderson等，Gam.Res.，1988)。
用天然ZP3蛋白为靶抗原，通过工程方法制备基于ZP3的疫苗是不可行的，因为这种生物材料极为有限。最近对编码ZP蛋白基因的克隆解决了上述问题，从而提供了产生重组ZP3蛋白或其片段的可能性。所述鼠ZP3 DNA的克隆及鉴定构成了迈向这一目的的重要步骤(Ringuette等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 834341-4345，1986；Rin-guette等，Dev.Biol.，127287-295，1988)。已披露了各种哺乳动物ZP3基因的克隆及相关ZP3蛋白的一级氨基酸序列，如人ZP3(WO 90/15624)、仓鼠ZP3(Kinloch等，Dev.Biol.，142414-421，1990)、绒猴ZP3(WO 94/10304)、猪ZP3(WO 93/14786)、猫ZP3(JP-A-06014784；WO 94、11019)、狗ZP3(JP-A-05336974；WO 94、11019)、兔ZP3(WO 94/11019)、牛ZP3(WO 94/11019)和弥猴ZP3(WO 94/11019)。迄今所阐明的所有哺乳动物ZP3氨基酸序列都表现出很高的进化保守性，氨基酸的同源性在65～90％的范围内。不同哺乳动物物种的这种蛋白的N-末端的保守性较差，这表明ZP3蛋白的这一部分在哺乳动物受精过程中的种特异性具有潜在作用。
很多用完整ZP3蛋白免疫的哺乳动物在大多数情况下都能产生高的抗ZP3效价，并伴随不育。不过，有关上述研究的报导中也提到了如下一致的结果表现为紊乱的月经周期的卵巢功能失常、卵巢病理学和各个发育阶段的卵泡的丧失，包括原始卵泡的丧失(例如，Skinner等，Endocrinology，1152418-2432，1984；Upadhyay等，Biol.Reprod.41665-673，1989；Sehgal等，Pathology 21105-110，1989；Dunbar等，Fert.Ster.52311-318，1989；Jones等，J.Reprod.Fert.95513～525，1992；Mahi-Brown等，J.Reprod.Immunol.2129-46，1992；Paterson等，Biol.Reprod.46523-534，1992)。这种功能失常会导致永久性不育。尤其是对人体来说，这是一种极为槽糕的副作用，因为基于ZP3的疫苗的免疫避孕作用只需用于控制受精，因此，所诱发的不育性最好是能够自动地或通过操作的方式恢复正常。因此，完整的ZP3不适用于开发安全的避孕药。
ZP3起着抗原决定簇的作用，它可以诱发由T细胞或B细胞介导的免疫应答。根据所诱发应答的类型可将所述抗原决定簇称为T细胞表位或B细胞表位。以小鼠为模型，已证实用ZP蛋白免疫后所观察到的卵巢病理学是一种由T细胞介导的现象。在用一种8个氨基酸的小T细胞表位(相当于鼠ZP3的氨基酸330-337)进行免疫之后，可诱发小鼠的卵巢病理学，具体为卵巢炎。将所述动物的T细胞转移到未免疫的动物体内同样会导致卵巢损伤，这一结果有力地支持了T细胞表位是在ZP3免疫之后导致卵巢损伤的原因的看法(Rhim等，J.Clin.Invest.8928-35，1992；Luo等，J.Clin.Invest.922117-2123，1993)。
因此，为了适当制备基于ZP3的避孕疫苗，迫切需要ZP3蛋白的片段，它不含有ZP3的致病性T细胞表位。本发明的一个目的是提供一种肽，它相当于ZP3蛋白的一个单一的抗原决定簇，因此，这种抗原决定簇不会诱发由T细胞介导的致病性免疫应签。
本发明提供了这样一种肽。本发明的肽具有由8-50个氨基酸组成的氨基酸序列，而且，至少包括氨基酸序列PLWLLQ(SEQ ID NO1)或其类似物。
更具体地说，本发明的肽包括氨基酸序列QPLWLLQG(SEQ IDNO2)或其类似物。
本发明的肽上的氨基酸序列PLWLLQ(SEQ ID NO1)的侧翼位点，特别是序列QPLWLLQG(SEQ ID NO2)的侧翼位点相当于人ZP3氨基酸序列的氨基酸24-29的天然侧翼位点，特别是氨基酸23-30的天然侧翼位点，或者相当于由任何随机的氨基酸序列组成的非天然侧翼位点。
本发明的肽具有由8～50个氨基酸残基组成的氨基酸序列，8-35个较好，8～25个更好。具有由8～15个氨基酸残基组成的氨基酸序列的肽尤为理想。特别推荐具有由8或12个氨基酸残基组成的氨基酸序列的肽。
本发明的范围还包括由本发明的肽组成的多聚体，如双体或三体。这种多聚体可提供多种PLWLLQ和/或QPLWLLQG的多种特异氨基酸序列，由其引发免疫应答。
在本文中，类似物是指哪些在氨基酸序列PLWLLQ或QPLWLLQG(SEQ ID NO1和2)或所述序列的多聚体中有取代或置换、插入或缺失的肽，其前提是，这些类似物能够与由保藏号为94032402的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体发生免疫反应，该细胞系已于1994年3月24日交由欧洲动物细胞保藏中心(本文中以下简称ECACC)保藏，该中心设在Port Down，Salisbury(UK)。所述取代或置换并非一定是如M.O.Dayhoff所述的保守置换(Atlas of ProteinStructure，Vol.5，Suppl.3 Natl.Biomedical Research Foundation，1978)，而且可以是非保守的氨基酸置换，这种非保守置换会导致出现氨基酸序列PLWLLQ或QPLWLLQG(SEQ ID NO1或2)的拟态(mimitope)。
本文所说拟态是指一种氨基酸序列，其有别于SEQ ID NO1和2所示序列，但它能够诱发其它抗体，这种抗体能识别的表位与由ECACC保藏的、保藏号为94032402的杂交瘤细胞系所产生的单克隆抗体能识别的表位相同。鉴定这种拟态的方法业已由Geysen等披露(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 813998-4002；1984；J.Immunol.Methods 13423-33；1987)。这种技术在本领域广为人知，而且带有试剂及材料的试剂盒也可由商业途径获得。
例如，至少包括氨基酸序列PLWFWQ(SEQ ID NO3)或PMWTLQ(SEQ ID NO4)的具有由8～50个氨基酸残基组成的氨基酸序列的肽，是能够与由ECACC保藏的、保藏号为94032402的杂交瘤细胞系所产生的抗体发生免疫反应的类似物。
本发明的合适肽为具有氨基酸序列QPLWLLQG(SEQ ID NO2)、PQPLWLLQ(SEQ ID NO5)、PLWLLQGG(SEQ IDNO6)、LCYPQPLWLLQGGASHPETS(SEQ ID NO7)或ADGAPMWTLQGAAGA(SEQ ID NO8)的肽或其混合物。
一种用于开发避孕疫苗的优选肽是具有氨基酸序列QPLWLLQG(SEQ ID NO2)的肽。
在用本发明的肽接种并产生较高抗体效价之后，未观察到卵巢功能紊乱或其它显示卵巢受到损伤的迹象。本发明的肽不会诱发由T细胞介导的致病性免疫应答，因而特别适用于研制可针对ZP3免疫的避孕疫苗。
Millar等早先已披露了一中不会诱发由T细胞介导的致病性免疫应答的肽(Science 246935-938)。Millar证实，相当于小鼠ZP3氨基酸序列的氨基酸336-342一种小型抗原决定簇，在对雌性小鼠进行主动免疫之后，会产生避孕效果，但不会诱发卵巢病理学。不过，这种肽完全不同于本发明的肽。本发明的肽包括在SEQ ID NO1或2中所列出的氨基酸序列或其类似物，该序列相当于人ZP3氨基酸序列中的氨基酸24-29，特别是氨基酸24-30。Millar没有提出或暗示本发明的肽，或是这种肽不会诱发由T细胞介导的致病性免疫应答的事实。
本发明的肽非常适用于开发一种可用于对ZP3进行主动免疫的避孕疫苗。一种用于对ZP3进行主动免疫的避孕疫苗包括有效剂量的一种或几种本发明的肽，以及一种可以药用的载体。给雌性哺乳动物，尤其是女人服用所述避孕疫苗，会诱发针对卵母细胞ZP3蛋白上的相应抗原决定簇的免疫应签，但不会针对ZP3上的所有其它抗原决定簇。因此，与以完整的ZP3为基础的疫苗相比，采用含有本发明的肽的避孕疫苗可以取得更有节制的免疫应答。所产生的抗体能够抑制精细胞与卵母细胞的结合，从而导致不育。
另外，本发明的肽还可用于研制一种对ZP3进行被动免疫的避孕疫苗。一种用于对ZP3进行被动免疫的疫苗含有有效剂量的一种或几种抗本发明的肽的抗体，以及一种可以药用的载体。
能够与氨基酸序列SEQ ID NO1和/或2发生免疫反应的能抗本发明的肽的抗体非常适用于对ZP3进行被动免疫的避孕疫苗。
理想的是，所述抗本发明的肽的抗体是单克隆抗体。
一种优选的抗体是由ECACC保藏的、保藏号为9432402的杂交瘤细胞系所产生的单克隆抗体。更理想的单克隆抗体是人或人源化的单克隆抗体，它被用于研制对ZP3进行被动免疫的避孕疫苗。
抗本发明的肽的抗体以及能产生这种抗体的细胞系也落在本发明的范围内。
给雌性哺乳动物，特别是女人服用这种避孕疫苗，能使所述雌性产生能与SEQ ID NO1和/或2所示氨基酸序列发生免疫反应的均一的抗体群体，这种抗体还能与由ZP3的氨基酸序列的氨基酸23-30，特别是氨基酸24-29所代表的相应的抗原决定簇发生免疫反应，但这种抗体不会与ZP3上的其它抗原决定簇反应。所述抗体与卵母细胞的ZP3上的相应抗原决定簇结合，可抑制精细胞与所述卵母细胞的结合，从而导致不育。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的肽适用于检测针对ZP3的氨基酸序列的氨基酸24-29、尤其是23-30的自身免疫抗体的检验试剂盒中。为了检测这种自身免疫抗体，从受试对象体内获得血清样品，并与本发明的一种或几种肽接触，并且有选择地同一种含有本发明的抗体，特别是本发明的单克隆抗体的诊断试剂接触。如果存在自身免疫抗体，它就会与所述肽发生反应。有可能发生的反应包括凝集反应、竞争反应或抑制反应。可通过用合适的检测试剂标记本发明的肽或抗体的方式实现对所述反应的检测，究竟是标记肽还是标记抗体，这要取决于所发生反应的类型。
例如，为了进行抑制反应以便检测一个试样中的上述自身免疫抗体，可采用的检验试剂盒含有包覆在一种固体支持体上的一种或几种本发明的肽，以及含有标记过的本发明的单克隆抗体或其片段的诊断试剂。该试剂与所述固体支持体上的肽的结合会受到试样中的自身免疫抗体的竞争。
举例来说，可以使用的支持体包括微试孔或样品池的内壁，试管或毛细管，膜，滤膜，试验条片或诸如乳胶粒子、红细胞、染料溶胶、金属溶胶或溶胶粒子状金属化合物之类的粒子表面，诸如牛血清白蛋白(BSA)或匙孔碱血蓝蛋白(KLH)之类的载体蛋白。
可用于标记本发明的肽或所述诊断试剂的试剂抗体的检测试剂包括放射性同位素、荧光化合物、酶、染料溶胶、金属溶胶或呈溶胶粒子状的金属化合物或其它溶胶。
可将包括一种或几种本发明的肽以及有选择地加以使用的含有本发明的抗体、特别是本发明的单克隆抗体的诊断试剂的检验试剂盒用于诊断由针对ZP3的自身免疫抗体所导致的不希望有的不育性。
另外，还可将所述检验试剂盒用于监测用本发明的疫苗处理过的雌性哺乳动物的抗体水平。
可用众多已知用于肽合成的有机化学方法中的一种或利用重组DNA技术来制备本发明的肽。
一般认为，用于肽合成的有机化学方法包括通过缩合反应连接所需要的氨基酸，缩合反应以均相方式进行，或是借助于所谓的固相。
所述缩合反应可按如下方式进行a)在有缩合剂的条件下，将一种具有游离的羧基及保护的其它反应基的化合物(氨基酸、肽)与具有游离的氨基及保护的其它反应基的另一种化合物(氨基酸、肽)缩合；b)将一种具有活化的羧基及游离的或保护的其它反应基的化合物(氨基酸、肽)与具有游离的氨基及游离或保护的其它反应基的另一种化合物(氨基酸、肽)缩合。
可通过如下方式活化所述羧基，特别包括将羧基转变成一种酰基卤、叠氮化物、酸酐、咪唑化物(imidazolide)或活性酯，如N-羟基-琥珀酰亚胺、N-羟基-苯并三唑或对亚硝基苯酯。
进行上述缩合反应的最常见的方法为碳化二亚胺法、叠氮化物法、混合酐法和使用活性酯的方法，这些方法披露在以下文献中ThePeptides、Analysis、Synthesis、Biology Vol.1-3(作者Gross，E.和Meienhofer，J.)1979、1980、1981(Academic Press，Inc.)。
举例来说，利用所述“固相”制备本发明肽的方法披露于J.Amer.Chem.Soc.852149(1963)和Int.J.Peptide Protein Res.35160-214(1990)中。有待制备的肽的氨基酸的连接，往往始于羧基末端一侧。这种方法需要固相，在该固相上有反应基或可引入反应基。例如，所述固相可以是苯与具有活性氯甲基的二乙烯基苯的共聚物，或是由羟甲基或胺官能团赋予其活性的聚合固相。
例如，一个特别适用的固相是由Wang(1974)所披露的(J.Am.Chem.Soc 951328)对烷氧基苄醇树脂(4-羟甲基-苯氧基-甲基-共聚苯乙烯-％二乙烯基苯树脂)。在合成之后，可在温和条件下把所合成的肽从所述固相上裂解下来。
在合成所需的氨基酸序列之后，将该肽从所述树脂上脱下来，随后通过，例如三氟甲磺酸或甲磺酸将其溶解在三氟乙酸中。还可通过酯基转移作用用低级醇，尤其是甲醇或乙醇将肽从所述载体上除去，在这种情况下，直接形成了该肽的烷基酯。类似地，用氨裂解可产生本发明肽的酰胺。
如上所述，不参与缩合反应的反应基由保护基进行有效地保护，通过酸、碱进行的水解作用或还原作用可非常容易地再次把保护基除去。因此，通过对连接在固体支持体上的甲醇、乙醇、叔丁醇、苄醇或对硝基苄醇和胺进行酯化作用，可实现对羧基的有效保护。
可有效保护氨基的基团有乙氧基羰基、苄氧基羰基、叔丁氧基羰基(t-boc)或对甲氧基-苄氧基羰基、或由磺酸衍生的酸基，如苯磺酰基或对甲苯磺酰基，不过，也可采用其它基团，如取代或非取代芳基或芳烷基，例如苄基和三苯基甲基，或诸如邻硝基苯基-硫苯基和2-苯甲酰基-1-甲基-乙烯基。一种特别适用的氨基保护基是，例如，碱敏性9-芴基-甲氧羰基(Fmoc)(Carpino和Han，J.Amer.Chem.Soc.925748，1970)。
更多可用的保护基可在以下文献中发现The Peptides、Analysis、Synthesis、Biology，Vol.1-9(作者Gross，Udenfriend和Meienhofer)1979-1987(Academic Press，Inc.)。
还必须保护赖氨酸的氨基，而且，对精氨酸的胍基进行保护也是需要的。用于此目的的常见保护基有用于赖氨酸的Boc-基和用于精氨酸的Pmc-或Pms-或Mbs-基或Mtr-基。
所述保护基可用各种常规方法裂解除去，所用方法取决于特定基团的性质，例如，用三氟乙酸或通过轻度还原作用，如用氢和催化剂，如钯进行还原或在冰醋酸里用HBr进行还原。
如上文所述，同样可通过标准的重组DNA技术制备本发明的肽。为此，要将编码本发明肽或所述肽的多聚体的核酸序列插入一种表达载体。合适的表达载体包括质粒、粘粒、病毒及YAC’s(酵母人工染色体)，以上载体包括复制和表达所必需的控制片段。所述表达载体可在宿主细胞中进行表达。合适的宿主细胞包括，例如细菌、酵母细胞和哺乳动物细胞。该技术在本领域中是众所周知的(Sambrooke等，Molecular Cloninga Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，1989)。
可用标准技术制备本发明的抗体。用肽免疫动物如小鼠的方法，以及选择能产生免疫原特异性单克隆抗体的杂交瘤的方法在本领域中广为人知(例如，参见Coligan等著的Current Protocols in Immunology.1992；Kohler和Milstein，Nature 256495-497，1975；Steenbakkers等，Mol.Biol.Rep.19125-134，1994)。简言之，用与免疫原载体蛋白，如匙孔血蓝蛋白(KLH)缀合的肽多次注射所选择的动物。可用涂有所关心的抗原的微滴定板在血清中很方便地试验被免疫动物的免疫响应，而杂交瘤是通过骨髓瘤细胞与小鼠B细胞的电融合而产生的，随后在含有适合于该目的的选择剂的培养基中进行选择。
用于生产人源化单克隆抗体的方法可以包括遗传工程技术，该技术可用于所述抗体的再构或人源化。例如，把带有鼠单克隆抗体结合位点的互补性决定片段(CDR’S)插入人抗体构架区，会产生其中的CDR片段来源于鼠抗体的人抗体。这种“CDR-嫁接”方法已被成功地应用于很多治疗目的，例如，抗白介素2受体的抗体(Queen等，Proc，Natl，Acad.Sci.USA 8610029-10033；1989)，表皮生长因子受体(Kettleborough等，Prot.Engin.4773-783，1991；Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.894285-4289，1989)、癌胚抗原(Bosslet等，Br.J.Cancer 65234-238，1992)和各种病毒(Tempest等，Biotechnology 9266-271，1991；Co等，Proe.Natl.Acad.Sci.USA 882869-2873，1991；Maeda等，Humanantibodies and hybridomas 2124-134，1991)。
更佳的产生本发明单克隆抗体的方法是，对转基因动物进行免疫，该动物已被操作成能表达完整的人抗体。这种技术的一些例子已由Green等(Nature Genetics 713-21，1994)和Lonberg等(Nature368856-859，1994)披露。通过用本发明的肽免疫这种转基因动物，并采用上述标准的杂交瘤技术，可生产出人的单克隆抗体。这种人的抗体极为适用于女人的被动免疫。
本发明的避孕疫苗含有有效免疫原剂量的上述肽或抗体，以及可以药用的载体。这里所说的“有效免疫原剂量”是指能在雌性哺乳动物上诱发具有避孕效果的免疫应答的剂量。肽或抗体的剂量取决于服用途径、服用时间、所述雌性动物的种、以及年龄、一般健康状况和饮食。
一般，可使用每公斤体重0.01～1000μg肽的剂量，0.5～500μg肽/kg体重的剂量较好，0.1～100μg肽/kg体重的剂量更好。
对本领域技术人员来说，可以药用的载体众所周知，例如，包括消毒盐溶液、乳糖、蔗糖、磷酸钙、白明胶、糊精、琼脂、果胶、花生油、橄榄油、芝麻油和水。
本发明的疫苗可以选择性地含有一种或几种佐剂。在这些佐剂被用作非特异性刺激剂，以诱发或增强免疫应答。合适的佐剂包括氢氧化铝、磷酸铝、白榴石、生育酚(tocophenols)、单苯膦基类脂A、胞壁酰二肽和诸如QuillA之类的皂草苷。佐剂的添加量取决于佐剂自身的性质。
另外，为了增强本发明肽的免疫原性，可将所述的肽与一种免疫原载体蛋白连接，如破伤风类病毒(TT)和KLH。所述连接可以通过肽自身存在的反应基进行，或是通过在该肽的C-末端引入这样的反应基，如一个外半胱氨酸残基。
本文所说的“免疫原载体蛋白”是指具有很强免疫原性的蛋白质，它能够触发宿主的免疫系统，从而提高本发明肽的免疫原效果。该免疫原载体蛋白在功能上有别于上述可以药用的载体，因此，不要将二者混淆。
此外，本发明的疫苗还可以包括一种或几种稳定剂，例如碳水化合物，包括山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、糊精和葡萄糖；蛋白质，如白蛋白或酪蛋白；以及缓冲液，如碱性磷酸盐。
任何雌性哺乳动物都可以接受本发明避孕疫苗的处理。特别是女人可接受本发明疫苗的处理。可按照标准的接种方法对用药方案进行优化。适用的用药方法包括肌内注射、皮下注射、静脉注射或腹膜内注射、口服或鼻腔喷洒。
如下图1表示单克隆抗体ZP4A与不同的肽结合的ELISA实验，以在450nm波长下的光密度形式表示。所述肽的氨基酸序列如SEQ ID NO2、7和9-11所示(在图1中的相应编号为1-5)。
图2表示单克隆抗休ZP4A与涂有重组ZP3的微滴定板的结合受由圆点所代表的肽QPLWLLQG(SEQ ID NO2)的抑制，而不受由三角所代表的对照肽的抑制的ELISA实验，该实验重复进行两次，给出的是平均值。其结合以在450nm波长下的光密度形式表示。
图3用单克隆抗体对人的透明带进行免疫荧光染色。该免疫染色效果用由一个光电倍增管测出的曝光时间表示。所用抗体为1＝NP11-1A(对照IgG1)；2＝ZP4A。该实验重复做3次。给出了平均值±标准差。
图4用单克隆抗体抑制人精子与人透明带的结合。抗体试验1＝NP11-1A(对照IgG1)；2＝ZP4A。给出了同4个人卵母细胞结合的平均精子数±标准差。
图5表示用肽QPLWLLQG(SEQ ID NO2)接种绒猴的结果.上图表示经初次免疫(P)和首次加强免疫(B)后对免疫肽的抗体效价(用圆圈表示)和对人的重组ZP3的抗体效价(用圆点表示)。下图表示由血浆孕酮含量周期表示的一种示范动物的正常卵巢功能，其结果是通过在接种之前和开始接种之后所进行的放射免疫分析测定的。
例1通过Fields和Noble披露的方法(Int.J.Pept.Prot.Res.35160-214，1990)用固相合成方式生产合成肽，并利用戊二醛将合成的肽与牛血清白蛋白(BSA)连接。简言之，将100μl肽(1mg/ml)与25μlBSA溶液(12mg/ml)混合，然后加入25μl 60mM戊二醛。在室温下培养1小时之后，加入15μl 0.5M甘氨酸(pH8.0)，在室温下放置30分钟之后，通过层析法(PD-10柱，Pharmacia)纯化缀合蛋白级分。在0.05M碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液(涂覆缓冲液)，pH9.6中将缀合的肽进一步稀释至浓度为1μg/ml，以100μl/孔的用量涂覆聚苯乙烯微量滴定板，在室温下过夜。以此方法合成了具有SEQ ID NO2和7所示氨基酸序列的两种肽和具有SEQ ID NO9-11所示氨基酸序列的3种对照肽。在PBST(磷酸缓冲盐溶液+0.05％Tween 20，pH7.5)中用1小时时间对所述肽进行免疫检测，检测时采用的是由ECACC保藏的、保藏号为94032402的杂交瘤细胞系所产生的1μg/ml单克隆抗体(以下简称mAb ZP4A)进行的。在经过3步用PBST进行的洗涤之后，以100μl/孔的用量把以1∶5000的比例稀释于PBST中的羊-抗-小鼠IgG-辣根过氧化物酶缀合物滴在所述滴定板上，并培养1小时。在用PBST洗涤1次，用水洗涤2次以后，以100μl/孔的用量加入四甲基联苯胺(TMB)底物缓冲液，并在室温下培养15-30分钟。加入100μl 4N硫酸(H2SO4)中止染色反应。在450nm波长下测孔的光吸收。图1所示结果表明，mAb ZP4A能专一性地识别本发明的肽(肽的编号分别为1和2)，而未发现与对照肽的结合(对照肽的编号分别为3～5)。
例2用无血清的能产生重组人ZP3的中国仓鼠卵巢细胞(Van Duin等，Biol.Reprod.(待发表)，1994)上清液涂覆聚苯乙烯微量滴定板。为此，用涂覆缓冲液(见例1)将该培养基以1∶10的比例稀释，并在室温下培养该滴定板过夜(100μl/孔)。用PBST洗涤滴定板3次之后，与mAb ZP4A(1μg/ml)和不同浓度的肽QPLWLLQG(SEQ IDNO2)和对照肽进行共培养。
结合单克隆抗体ZP4A的免疫检测这样进行以100μl/孔的用量，用以1∶5000的比例稀释于PBST中的羊-抗-小鼠IgG-辣根过氧化物酶(HRP)缀合物滴定所述滴定板，并培养1小时。在用PBST洗涤一次，用水洗涤2次以后，以100μl/孔的用量加入TMB底物缓冲液，并在室温下培养15-30分钟。加入100μl 4N硫酸(H2SO4)以中止该染色反应。以450nm的波长重复测孔的光吸收2次。
结果如图2所示，结果表明，本发明的肽可竞争性地抑制mAb 4A与人重组ZP3的结合，而这种结合却不受对照肽的抑制。可以得出这样的结论在重组ZP3和本发明肽上都存在着可由mAb ZP4A识别的表位，表明以本发明肽为抗原产生的抗体，能够与ZP3上相应的抗原决定簇反应。
例3用体外受精方法获得人卵母细胞。简言之，将受精失败的卵母细胞(由缺乏卵裂证实其未受精)保存在卵母细胞保存液(OSS，20mMHEPES，1.55M MgCl2·6H2O、0.1％葡聚糖、10％甘油、0.1％聚乙烯吡咯烷酮，pH7.2-7.4)中，并在4℃下保存待用，在被用于人卵-荧光分析(hEFA’s)之前，用微量移液管通过在3滴250μlPBS-EFA(PBS，0.5％牛血清白蛋白(BSA)、1％聚乙烯吡咯烷酮-40，100U/ml青霉素，100μl/ml链霉素)中转移的方式漂洗所述卵母细胞，即透明带。为了研究mAb ZP4A是否专一性地识别位于同时带有人透明带的ZP1和ZP2的基质上的ZP3分子，在含有100μg/ml抗体的体积为25-30μl的PBS-EFA液滴(样品2，图3)中培养卵母细胞，在37℃下，在加湿箱中培养1小时。为了测定非专一性结合的水平，同样在上述条件下与单克隆抗体NP11-A1(样品1，图3)一起培养卵母细胞，该抗体为类似的同种型的无关抗体。以5-10分钟的间隔用250μlPBS-EFA洗涤3次，每次洗涤都在进行以下培养之前进行在加有与FITC(异硫氰酸荧光素)缀合的兔抗-小鼠免疫球蛋白的25～30μl PBS-EFA中进行培养(1∶100稀释，在37℃下，在加湿箱中培养1小时)。以5-10分钟的间隔用250μl的液滴再洗涤3次，之后将卵母细胞引入250μl抗褪色溶液(Johnson，J.Immunol.Meth.43349-350，1981)中。为避免在最后分析时出现退色现象。将每个卵母细胞依次固定在一个载玻片上，周围涂一小圈凡士林，并用盖玻片密封。通过荧光显微术分析每个卵母细胞。在用荧光照射所述卵母细胞之后，马上用一台光电倍增管记录照出一张照片所需的曝光时间。在该方法中，由光电倍增管所测出的曝光时间可反映出与该卵母细胞结合的抗体量。长曝光时间表示没有或很少抗体结合，而与卵母细胞的特异结合会产生短的曝光时间。
图3所示结果表明，与5mAb ZP4A一起培养人卵母细胞，即透明带，会产生较高水平的荧光，但与同种型的对照单克隆抗体NP11-1A一起培养几乎不出现荧光染色。由以上结果可得出以下结论在天然人ZP3蛋白上有mAb ZP4A的表位。
例4按照例3所述方法漂洗人的盐保存的卵母细胞，然后在添加了0.3％人血清白蛋白的人体输卵管液培养基(HTF-培养基；见Quinn等Fertil.Sterll 44493-498，1985)的液滴中洗涤3次。每次分析使用4-5个人卵母细胞，在体积为25μl的一滴含有试验化合物，即被分析的抗体(样品1同种型对照单克隆抗体NP11-1A；样品2mAbZP4A，均为250μg/ml)的HTF-培养基中共培养1小时。该培养是在37℃温度下，在存在5％CO2条件下于加湿箱中进行。在250μl HTF-培养基液滴中洗涤所述卵母细胞3次，然后收集在25μl的体积中，并与25μl HTF培养基混合，该培养基中含有2×106个由Percool纯化的活动的人精子/ml，所述精子己在37℃下至少获能3小时。用石蜡油覆盖50μl的培养液滴，并在37℃下，在有5％CO2的培养箱中培养4小时。
通过一个葡聚糖梯度离心步骤分离结合精子与游离精子。将沉淀+100μl上清液与1ml的固定、染色液
混合，并在4℃下培养过夜。最后，用显微镜和微显移液管从该溶液中收集卵母细胞，在抗褪色溶液中培养，并按例3所述方法固定在载玻片上。通过荧光显微镜法测定结合精子数目，并计数每mm2固定卵母细胞上、下表面的两个聚焦面上的平均细胞数。
该实验的结果如图4所示。与对照单克隆抗体相反，mAb ZP4A能抑制人精子与人卵母细胞的结合。因此，由以本发明的肽为抗原产生的抗体能与人卵母细胞上的天然透明带反应，并抑制精子与透明带的结合，从而诱发不育。
例5用肽QPLWLLQG(SEQ ID NO2)对雌性绒猴(Callithrixjacchus)进行免疫。首先在该肽的C-末端位点上连接一个半胱氨酸残基，为该肽提供一个反应位点。用磺基-SMCC(N-琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸)将所述肽的这一反应位点与载体蛋白即破伤风类毒素(TT)连接。首先，将4mg肽溶于5ml0.1M磷酸缓冲液pH6.0，5mM EDTA中，向其中加入6mg 2-巯基乙醇胺，以便在该肽上形成可及-SH基。在37℃下培养1小时，然后通过Sephadex G-25层析纯化该肽，并在4℃下保存。
载体蛋白的活化这样进行将4mg该蛋白溶于5ml 50mM硼酸钠缓冲液中，pH7.0，然后加入2mg磺基-SMCC，并在30℃下培养1小时。为了纯化该蛋白，采用Sephadex G25层析。将含有活化载体蛋白的级分收集在一起，并用一台Amicon B-15微量浓缩器浓缩至5ml。为了进行缀合，将所述含有以下肽的级分加入活化的浓缩TT中，并在4℃下在振荡器中培养20小时。随后用一个Sephacryl S-400柱纯化以上缀合材料，该柱用0.1M Tris HCl，1mM MgCl2pH7.0平衡过，流速为20ml/h。
免疫在免疫之前3个月，监测绒猴的月经周期，并通过每两周测一次血清孕酮含量证实其正常的卵巢功能。初次免疫时，通过皮下注射将溶于PBS中的200μg缀合物分几处注射，总体积为0.2ml。所用PBS用含有250μg N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(MDP)的非溃疡性Freund’s佐剂乳化过。以类似方法制备加强注射液，所不同的是去掉了MDP。
为了监测免疫动物的免疫应答和卵巢功能，每周抽血2次，分别测定抗-肽QPLWLLQG抗体和抗重组ZP3抗体，以及血清孕酮含量。
用经马来酐(maleic anhydrade)活化的滴定板(Pierce)测定抗-肽应答。该滴定板用5mg肽/ml PBS pH8.0涂覆(100μl/孔)，并在室温(RT)下过夜。倒出所述肽溶液之后，用200μl封闭缓冲液(3％BSA，0.05％Tween 20，溶于PBS中)洗涤孔2次，与另外200μl封闭缓冲液一起在RT下培养1小时。经过上述第3个洗涤步骤之后，将待测样品的2倍稀释液加进去，稀释范围为1/10～1/20480(75μl，2小时，室温)。用洗涤缓冲液(0.1％BSA，0.05％Tween 20，溶于PBS中)洗涤3次，然后把100μl抗-猴HRP缀合物(稀释1/1000)加到每一个孔中，在RT下培养1小时。对滴定板的进一步处理如例1所述。
大致按例1所述方法进行识别人重组ZP3的ELISAs。
用非提取放射免疫分析法测定绒猴血浆孕酮含量。每次分析做3个重复，用由含有0.1％明胶的0.1M磷酸柠檬酸缓冲液(PCB)，pH6.0稀释到总体积为150μl的2.5μl血浆。加入羊抗-孕酮抗体在PCB中1/10000的稀释液100μl，和100μl碘化孕酮示踪剂，并在25℃下将该溶液培养3小时。然后加入第二种抗体，100μl驴抗-羊血清(ScottishAntibody Production Unit(SAPU)，Scotland)在PCB中的1/64倍稀释液，再加入100μl正常羊血清(SAPU)的1/3200稀释液，将所得溶液在4℃下培养过夜。最后，加入1ml 4％聚乙二醇、在0.9％盐溶液中配成的0.2％Triton X-100，并在4℃下1500×g离心30分钟。倒掉上清液之后在一台多γ(multigamma)计数器(LKB)上计数。
图5所示的结果表明，用本发明的肽免疫可以诱发免疫应答。所产生的抗体能识别完整的人ZP3蛋白和肽QPLWLLQG(上图)，而血浆孕酮含量周期表明其具有正常的卵巢功能。序列表(1)一般信息(i)申请人(A)姓名AKZO NOBEL N.V.
(B)街道Velperweg 76(C)城市Arnhem(E)国家荷兰(F)邮政编码6824 BM(G)电话04120-66376(H)传真04120-50592(I)电传37503 akpha nl(ii)发明名称新的避孕肽(iii)序列数11(iv)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(EPO)(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度6个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽
(xi)序列表述SEQ ID NO1Pro Leu Trp Leu Leu Gln1 5(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列表述SEQ ID NO2Gln Pro Leu Trp Leu Leu Gln Gly1 5(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度6个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列表述SEQ ID NO3Pro Leu Trp Phe Trp Gln1 5(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度6个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列表述SEQ ID NO4Pro Met Trp Thr Leu Gln1 5(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列表述SEQ ID NO5Pro Gln pro Leu Trp Leu Leu Gln1 5(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸
(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列表述SEQ ID NO6Pro Leu Trp Leu Leu Gln Gly Gly1 5(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度20个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列表述SEQ ID NO7Leu Cys Tyr Pro Gln ProLeu Trp Leu Leu Gln Gly Gly1 5 10Ala Ser His Pro Glu Thr Ser15 20(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链
(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列表述SEQ ID NO8Ala Asp Gly Ala Pro Met Trp Thr Leu Gln Gly Ala Ala1 5 10Gly Ala15(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)长度20个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列表述SEQ ID NO9Lys Val Thr Leu Ala Glu Gln Asp Pro Asn Glu Leu Asn1 5 10Lys Ala Cys Ser Phe Ser Lys15 20(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)长度21个氨基酸
(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列表述SEQ ID NO10Thr Asp Asp Ala Leu Val Tyr Ser Thr Phe Leu Leu His1 5 10Asp Pro Arg Pro Val Gly Asn Leu15 20(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)长度18个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列表述SEQ ID NO11Pro Ser Asp Thr Ser Val Val Leu Leu Gly Val Gly Leu1 5 10Ala Val Val Val Ser1权利要求
1.具有由8-50个氨基酸残基组成的氨基酸序列的肽，该肽至少包括氨基酸序列PLWLLQ(SEQ ID NO1)或其类似物，前提是所述类似物能够与由ECACC保藏的、保藏号为94032402的杂交瘤细胞系所产生的单克隆抗体发生免疫反应。
2.如权利要求1的肽，其特征在于所述肽至少包括氨基酸序列QPLWLLQG(SEQ ID NO2)或其类似物。
3.如权利要求1或2的肽，其特征在于所述肽的氨基酸序列为QPLWLLQG(SEQ ID NO2)。
4.如权利要求1或2的肽，其特征在于所述肽的氨基酸序列为PQPLWLLQ(SEQ ID NO5)、PLWLLQGG(SEQ ID NO6)或LCYPQPLWLLQGGASHPETS(SEQ ID NO7)。
5.如权利要求1或2的肽，其特征在于所述肽的氨基酸序列为ADGAPMWTLQGAAGA(SEQ ID NO8)。
6.将权利要求1～5中任一项的肽用于生产抗体的用途。
7.针对权利要求1～5中任一项所述的肽而产生的抗体。
8.如权利要求7的抗体，其特征在于所述抗体具有特异性结合包括氨基酸序列PLWLLQ或QPLWLLQG的表位的能力。
9.如权利要求7或8的抗体，其特征在于所述抗体是单克隆抗体。
10.如权利要求9的抗体，其特征在于所述抗体是由ECACC保藏的、保藏号为94032402的杂交瘤细胞系生产的。
11.生产如权利要求7～10的抗体的细胞系。
12.由ECACC保藏的、保藏号为94032402的杂交瘤细胞系。
13.将如权利要求1～5中任一项的肽和/或如权利要求7～10中任一项的抗体用作治疗性物质的用途。
14.药用组合物，含有一种或几种如权利要求1～5任一项的肽或者一种或几种如权利要求7～10的抗体，以及一种可以药用的载体。
15.避孕疫苗，含有一种或几种如权利要求1～7中任一项的肽或者一种或几种如权利要求7～10中任一项的抗体，以及一种可以药用的载体。
16.用于检测患者血清中自身免疫抗体的方法，包括以下步骤a)从患者体内获得血清样品；b)让所述样品同一种或几种如权利要求1～5中任一项的肽接触，并且有选择地同一种含有一种或几种本发明的抗体的诊断试剂接触，c)通过合适的检测反应确定所述自身免疫抗体的存在。
17.将如权利要求1～5中任一项的肽或者如权利要求7～10中任一项的抗体用作诊断物质的用途。
18.一种用于检测试样中的自身免疫抗体的检验试剂盒，所述试剂盒含有一种或几种如权利要求1～7中任一项的肽，还有选择地含有一种诊断试剂，该诊断试剂含有如权利要求7～10的单克隆抗体。
19.一种诊断试剂，它含有用一种检测剂标记过的如权利要求7～10中任一项的单克隆抗体。
全文摘要
本发明涉及一种能够诱发抗透明带蛋白ZP3的免疫应答的肽，该肽具有由8-50个氨基酸残基组成的氨基酸序列，而且至少包括氨基酸序列PLWLLQ或其类似物。更具体地说，本发明的肽至少包括氨基酸序列QPLWLLQG。本发明的其它实施方案涉及用本发明的肽作为抗原制备的抗体、含有所述肽或抗体的避孕疫苗、以及用于检测试样中抗ZP3的自身免疫抗体的检验试剂盒。
文档编号A61K38/00GK1158623SQ95195212
公开日1997年9月3日 申请日期1995年8月18日 优先权日1994年8月22日
发明者M·范杜因, A·J·格罗特修斯, E·J·布斯乔恩 申请人:阿克佐诺贝尔公司