专利名称:西氏鲍与皱纹盘鲍杂交种的dna分子鉴定方法
技术领域：
本发明涉及一种鲍的DNA分子标记检测，尤其是涉及一种利用分子标记技术一微 卫星(SSR)技术对西氏鲍与皱纹盘鲍种间杂交子一代的杂种真伪进行分子鉴定的方法。
背景技术：
鲍是海洋贝类的一种，被誉为海产八珍之首，素有“软黄金”之称，具有极高的经济 价值。在我国主要的养殖鲍种有皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)和杂色鲍(Haliotis diversicolor)两种，其中皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)属温带种，在我国主要分布 在辽东半岛和山东半岛一带，系我国北方沿海地区的主要养殖鲍种。由于其具有较高的经 济价值，近年来，在福建、广东沿海地区逐渐开展皱纹盘鲍工厂化人工养殖，并同时开展人 工育苗工作。但由于皱纹盘鲍的耐高温能力较差，不易适应南方夏季的高温气候，再加上鲍 病害的日益增加，在养殖过程中往往出现大量死亡现象，养殖收益大幅减少。因此科研人员 一直在寻求解决此问题的方法。厦门大学海洋系于2003年从日本引进了西氏鲍，该种具有 个体大、适温范围广和抗病力强等特点。引种成功后开展了西氏鲍与皱纹盘鲍杂交育种工 作，并开发出稳定获得高受精率和孵化率的西氏鲍与皱纹盘鲍种间杂交制种方法(参见公 开号为CN101167444A的中国专利申请)，批量获得了西氏鲍与皱纹盘鲍正反交杂交子代， 研究结果表明，杂交种在生长势、存活率和抗逆性上具有较高的杂种优势。然而，由于在进 行西氏鲍与皱纹盘鲍的种间杂交制种过程中，容易出现由于隔离不严而发生同种配子污染 现象，导致杂交后代混杂母本自繁系种苗，而且杂交种的外形特征与其父母本一皱纹盘鲍 和西氏鲍极为相似，无法通过外形特征进行有效的鉴别，杂交种与亲本自繁种的混杂，对育 种工作和人工养殖效果造成干扰。因此有必要对杂交种苗的真伪进行鉴别。
目前，国内外对鲍及其种间杂交种的鉴别方法主要有两种(1)外形特征鉴别法: 通过鲍的外形特征进行鉴定，如贝壳形状、颜色，呼吸孔高度，螺顶高低水平，腹足颜色等进 行判断。该方法的优点是比较直观，可大量操作。其缺点是要求个体规格较大，在种苗阶段 难于进行鉴定；同时，该方法易受环境气候条件限制，如将原本生活在日本北部的皱纹盘鲍 移至日本南部水域进行养殖，经过1 2年后，其外形与生长在同一海域的盘鲍(H. discus
discus)基本一致(猪野峻.邦産7 -7 Ε属O增殖G関t 3生物学的研究[J].東海水研 報，1952，5:62-64.)；此外，外形鉴别法受人为主观因素影响较大，鉴别准确率较差。(2)同 工酶法主要是通过聚丙烯酰胺凝胶或淀粉凝胶电泳技术，进一步分析作为基因产物的蛋 白质和同工酶来鉴定鲍种及不同鲍之间的杂交种。但该技术操作要求严格，程序复杂，识别 不直观，而且同工酶表达与组织及发育时期有关，因此多态性较低，可利用的酶种类较少， 重复性不够好，同时要求较高的实验室条件，不易对大量样本进行分析。相比较而言，以DNA 为基础的分子标记技术如微卫星(SSR)技术，由于其呈共显性遗传，具有检测位点数量多、 多态性高、稳定遗传和不受环境条件影响等优点，因此已广泛应用于动植物的DNA指纹与 种质鉴定方面。
发明内容
本发明的目的在于针对现有的检测鲍杂交种方法所存在的不足，提供一种具有多 态性高、遗传稳定、不受环境条件影响等优点，能够在西氏鲍与皱纹盘鲍大规模种间杂交制 种过程中鉴别出二者的种间杂交子一代杂种真伪的微卫星(SSR)分子标记的西氏鲍与皱 纹盘鲍杂交种的DNA分子鉴定方法。
本发明的技术方案是利用从20对皱纹盘鲍微卫星引物中筛选出的一对微卫星 (SSR)弓丨物对西氏鲍与皱纹盘鲍杂交子一代的DNA进行PCR扩增，通过扩增图谱可以辨别西 氏鲍、皱纹盘鲍以及西氏鲍与皱纹盘鲍的杂交子一代，具有准确快捷、结果稳定、公正客观、 经济实用的特点。
本发明的具体步骤如下
1)采用酚氯仿法提取西氏鲍与皱纹盘鲍杂交子一代的基因组DNA
2)以所提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增反应，得扩增产物；
3)将扩增产物凝胶电泳及染色，对比图谱；
4)根据电泳结果与提供的标准图谱进行对比。
所述PCR扩增反应的反应体系的总体积最好为25 μ 1，其各种成分及终浓度分别 为BufferlOmM，dNTPO. 2mM, Mg2+1. 5mM，引物对 0. 2mM, TaqlU，基因组 DNA50ng，用双蒸水补 齐到25 μ 1;引物序列为
引物 Awb002:
F-TATACTTTGTCTGAGTGGGGTATTC
R-AATTGTCCTCCGTTGGAGATGA
PCR扩增反应程序为95°C5min— (94°C 45sec — 54°C 45sec — 72°C 60sec) X35cyc Ies — 72°C 5min — 4°C ⑴。
所述将扩增产物凝胶电泳及染色是PCR反应结束后，取PCR扩增产物在按质 量体积百分比浓度为6%的双垂直板变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，65W恒功率电泳 1 1. 2h，电泳结束后凝胶用蒸馏水冲洗后，用10%冰醋酸溶液固定30min ；AgNO3水溶 液(AgNO3Ig, 37% 甲醛 1. 5mL, dH201 OOOmL)银染 30min ；银染后用 1. 5% NaOH,0. 4% 甲醛、 0. 002% NaS2O3^ dH20 IOOOmL显色，10%冰醋酸溶液终止显色，可见灯箱下观察拍照。
由于SSR引物Awb002产生的西氏鲍特异标记的条带大小在250 270bp之间，产 生的皱纹盘鲍特异标记条带大小在200 240bp之间，因此所述将电泳结果与提供的标准 图谱进行对比是，若在250 270bp区间内出现1 2条条带，则该DNA样品系西氏鲍，出 现1条条带说明该个体系纯合子，出现2条条带则说明该个体系杂合子；若在200 240bp 区间内出现1 2条条带，则该DNA样品系皱纹盘鲍，出现1条条带说明该个体系纯合子， 出现2条条带则说明该个体系杂合子；样品只有同时在250 270bp区间和200 240bp 区间内各出现1条条带，即同时具有亲本的1条特异条带的个体才为真正的西氏鲍与皱纹 盘鲍杂交子一代，缺少其中的任意一个条带均被视为假杂种。
本发明从20对皱纹盘鲍微卫星引物中筛选出一对能够在西氏鲍与皱纹盘鲍杂交 子一代杂种个体中同时产生具有父、母本特异标记条带，而且带型清晰、重复性好、可靠性 强的微卫星引物Awb002，并将其作为西氏鲍与皱纹盘鲍杂交子一代分子鉴定的特征引物。
鉴于西氏鲍与皱纹盘鲍杂交种与西氏鲍及皱纹盘鲍在种苗阶段不易通过外形特征进行鉴定，通过本发明的应用，可以快速、准确地检测出西氏鲍与皱纹盘鲍杂交子一代的 杂种真伪。同时本发明具有准确性高、结果稳定、不受环境条件及发育时期的影响、统计简 便等优点。
图1为电泳染色对比图谱。在图1中，M是DNA marker (Fermentas 50bp DNA Ladder) ； 1 10是西氏鲍与皱纹盘鲍正交子一代(皱纹盘鲍？x西氏鲍3 )，11 20是西 氏鲍，21 30是西氏鲍与皱纹盘鲍反交子一代(西氏鲍皱纹盘鲍3)，31 40是皱纹 盘鲍；从上至下，条带大小标记分别为300，250，200bp。
具体实施方式
实施例1
参见图1，利用西氏鲍早与皱纹盘鲍J进行杂交，获得杂交种苗，采用酚氯仿法提 取西氏鲍与皱纹盘鲍杂交种基因组DNA。以杂交种DNA为模板，进行PCR扩增反应PCR 扩增反应体系的总体积为25 μ 1，其各种成分及终浓度分别为BufferlOmM，dNTPO. 2mM, Mg2+L 5mM，引物对0. 2mM, TaqlU，基因组DNA50ng，用双蒸水补齐到25 μ 1 ；其中，引物序列 为
引物 Awb002:
F-TATACTTTGTCTGAGTGGGGTATTC
R-AATTGTCCTCCGTTGGAGATGA
PCR反应程序为95°C5min— (94°C 45sec — 54°C 45sec — 72°C 60sec) X35cycles —72°C 5min — 4°C ①。
PCR反应结束后，取3 μ IPCR扩增产物在质量体积百分比浓度为6%的双垂直板变 性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，65W恒功率电泳1 1. 2h，电泳结束后凝胶用蒸馏水稍冲洗 后，用10%冰醋酸溶液固定30min ；AgNO3水溶液(AgNO3Ig, 37%甲醛1. 5mL，dH201000mL)银 染 30min ；银染后用 1. 5% NaOH,0. 4% 甲醛、0. 002% NaS2O3^dH2O IOOOmL 显色，10%冰醋酸 溶液终止显色，可见灯箱下观察拍照，同时对电泳结果进行分析，根据电泳结果与提供的标 准图谱对比，对比图谱时若仅在250 270bp区间内出现1 2条条带，则表明该DNA样品 系西氏鲍，若仅在200 240bp区间内出现1 2条条带，则该DNA样品系皱纹盘鲍；若样 品同时在250 270bp区间和200 240bp区间内各出现1条条带，即同时具有亲本的1 条特异条带的个体则为真正的西氏鲍与皱纹盘鲍杂交子一代，缺少其中的任意一个条带均 被视为假杂种。
实施例2
与实施例1相似，所不同之处在于利用皱纹盘鲍早与西氏鲍t进行杂交，获得杂 交种苗。将PCR扩增产物电泳结果与提供的标准图谱进行对比，对比图谱时若仅在250 270bp区间内出现1 2条条带，则表明该DNA样品系西氏鲍，若仅在200 240bp区间内 出现1 2条条带，则该DNA样品系皱纹盘鲍；若样品同时在250 270bp区间和200 240bp区间内各出现1条条带，即同时具有亲本的1条特异条带的个体则为真正的西氏鲍与 皱纹盘鲍杂交子一代，缺少其中的任意一个条带均被视为假杂种。
5
权利要求
西氏鲍与皱纹盘鲍杂交种的DNA分子鉴定方法，其特征在于其具体步骤如下1)采用酚氯仿法提取西氏鲍与皱纹盘鲍杂交子一代的基因组DNA；2)以所提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增反应，得扩增产物，所述PCR扩增反应的引物序列为引物Awb002F TATACTTTGTCTGAGTGGGGTATTCR AATTGTCCTCCGTTGGAGATGA3)将扩增产物凝胶电泳及染色，对比图谱；4)根据电泳结果与提供的标准图谱进行对比。
2.如权利要求
1所述的西氏鲍与皱纹盘鲍杂交种的DNA分子鉴定方法，其特征在于所 述将扩增产物凝胶电泳及染色是PCR反应结束后，取PCR扩增产物在按质量体积百分比浓 度为6%的双垂直板变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，65W恒功率电泳1 1. 2h，电泳结束 后凝胶用蒸馏水冲洗后，用10%冰醋酸溶液固定30min ；AgNO3水溶液银染30min ；银染后用 1. 5% NaOH,0. 4%甲醛、0. 002% NaS2O3^ dH20 IOOOmL显色，10%冰醋酸溶液终止显色，灯箱 下观察拍照。
3.如权利要求
2所述的西氏鲍与皱纹盘鲍杂交种的DNA分子鉴定方法，其特征在于 AgNO3 水溶液为 AgNO3Ig, 37% 甲醛 1. 5mL, dH20 lOOOmL。
专利摘要
西氏鲍与皱纹盘鲍杂交种的DNA分子鉴定方法，涉及一种鲍的DNA分子标记检测，尤其是涉及一种利用分子标记技术—微卫星技术对西氏鲍与皱纹盘鲍种间杂交子一代的杂种真伪进行分子鉴定的方法。提供一种具有多态性高、遗传稳定、不受环境条件影响等优点，能够在西氏鲍与皱纹盘鲍大规模种间杂交制种过程中鉴别出二者的种间杂交子一代杂种真伪的微卫星分子标记的西氏鲍与皱纹盘鲍杂交种的DNA分子鉴定方法。采用酚氯仿法提取西氏鲍与皱纹盘鲍杂交子一代的基因组DNA以所提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增反应，得扩增产物；将扩增产物凝胶电泳及染色，对比图谱；根据电泳结果与提供的标准图谱进行对比。
文档编号C12Q1/68GKCN101353702 B发布类型授权 专利申请号CN 200810071740
公开日2011年1月5日 申请日期2008年9月8日
发明者柯才焕, 骆轩 申请人:厦门大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (3),