专利名称:立枯丝核菌菌丝体在提高哈茨木霉菌产木霉素水平中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物技术领域：
，特别是涉及提高哈茨木霉菌产素水平的方法。
技术背景
微生物发酵中效价往往是决定生产成本以及实现工业化生产的瓶颈所在。对菌株 进行遗传改造、培养基及培养条件的优化等是提高产素水平的常用方法。近年来，真菌诱导 子在植物细胞培养和微生物发酵生产次生产物的研究中得到广泛应用。研究组从枸骨中 分离筛选到一株产木霉素(Trichodermin)的活性内生真菌——哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)。木霉素对多种农作物病原真菌具有很强的抑制作用，在防治作物病害中具有 广泛的应用前景。从自然界分离的野生型菌株往往产素水平较低，生产能力低下。
发明内容
在研究提高哈茨木霉菌产素水平的试验中，生物活性测定表明病原真菌立枯丝核 菌(Rhizoctonia solani)活菌丝的加入能够提高哈茨木霉菌发酵液的抑菌效果。进一步研 究发现，灭活的立枯丝核菌菌丝体的加入同样能够提高哈茨木霉菌发酵液的抑菌效果。采 用气相色谱分析发酵液中木霉素的含量，显示添加灭活的立枯丝核菌菌丝体后发酵液中木 霉素的浓度与对照相比提高了数倍。
本发明通过在哈茨木霉菌培养液中添加灭活的立枯丝核菌菌丝体，提高发酵液中 木霉素的浓度。该发明为哈茨木霉菌的产素水平提高提供了一种可靠的方法。
本发明的目的是针对野生型菌株哈茨木霉产素水平低的不足，提供一种提高其产 素水平的方法；本发明的另一目的是提供利用该菌株代谢产物木霉素制备微生物农药的方 法。
本发明目的通过以下技术方案来实现
—种提高哈茨木霉菌产素水平的方法按以下步骤进行
(1)立枯丝核菌的培养
立枯丝核菌可以通过常规的组织分离法从发病的植物中分离得到。
培养基为马铃薯葡萄糖液体培养基(PD)，300mL三角瓶装PD液体培养基60mL，用 接种钩挑取少许立枯丝核菌菌丝于灭菌的培养瓶中，置26°C 28°C摇床，200r/min，振荡 培养6天，发酵液经5000r/min离心lOmin，收集菌丝体，在_53°C、0. 5mbar条件下真空冷冻 干燥15h，灭活的菌丝体研磨成小颗粒，备用；
(2)哈茨木霉菌液体发酵
哈茨木霉菌为从枸骨中分离的内生真菌。发酵培养基配方其组分与含量(每升 培养基中所含的质量)为立枯丝核菌菌丝体小颗粒60mg，蛋白胨30g、牛肉浸膏10g、葡萄糖 24g、MnCl2 0. Olg, KH2PO4 0. lg、MgSO4 0. 05g ；对照中不添加立枯丝核菌菌丝体，其余组分 与含量同发酵培养基配方；300mL三角瓶装发酵培养基60mL，用无菌的吸管吸取ImL哈茨木霉菌孢子悬液(IXlO6个/mL)于灭菌的培养瓶中，置28°C摇床，180r/min，振荡培养108h， 发酵液经5000r/min离心lOmin，上清液用于木霉素含量的测定；
(3)木霉素的检测
方法采用气相色谱法测定，色谱柱HP-5弹性石英毛细管柱(以5%苯基甲基硅 氧烷为固定液，30πιΧ320μπιΧ0. 25μπι)；检测器氢火焰离子检测器(FID)；检测器温度 2700C ；进样口温度250°C ；柱温度程序升温，初始温度100°C，保持5min，以10°C -min"1升 温至260°C保持5min ；载气氮气；流速1. 5mL · min—1。
本发明的有益效果
一是本发明通过在哈茨木霉菌培养液中添加立枯丝核菌菌丝体，提高发酵液中木 霉素的浓度，这为哈茨木霉菌的产素水平提高提供了一种可靠的方法；
二是本发明提供了制备防治作物真菌病害的微生物源农药的活性成分木霉素，为 农用杀菌剂的开发增添了新的途径。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提高木霉素产素水平的方法作进一步描述。
实施例1
立枯丝核菌的培养培养基为马铃薯葡萄糖液体培养基(PD)，300mL三角瓶装PD 液体培养基60mL，用接种钩挑取少许立枯丝核菌菌丝于灭菌的培养瓶中，置26°C 28°C 摇床，200r/min,振荡培养6天，发酵液经5000r/min离心IOmin，收集菌丝体，在_53 °C、 0. 5mbar条件下真空冷冻干燥15h，灭活的菌丝体研磨成小颗粒，备用；
哈茨木霉菌液体发酵哈茨木霉菌为从枸骨中分离的内生真菌，该菌株已在中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期2006年8月14日，保藏登记号 CGMCC No. 1780参见专利申请200710066843. 1的公开文本，公开号为CN101037656。发酵培 养基配方其组分与含量(每升培养基中所含的质量)为立枯丝核菌菌丝体小颗粒60mg， 蛋白胨 30g、牛肉浸膏 10g、葡萄糖 24g、MnCl2 0. Olg、KH2PO4 0. lg、MgSO4 0. 05g ；对照中不 添加立枯丝核菌菌丝体，其余组分与含量同发酵培养基配方；300mL三角瓶装发酵培养基 60mL，用无菌的吸管吸取ImL哈茨木霉菌孢子悬液(IXlO6个/mL)于灭菌的培养瓶中，置 28°C摇床，180r/min，振荡培养108h，发酵液经5000r/min离心lOmin，上清液用于木霉素含 量的测定；
木霉素的检测采用气相色谱法测定，色谱柱HP-5弹性石英毛细管柱(以5% 苯基甲基硅氧烷为固定液，30πιΧ320μπιΧ0. 25μπι)；检测器氢火焰离子检测器(FID)； 检测器温度270°C ；进样口温度250°C ；柱温度程序升温，初始温度IOCTC，保持5min，以 IO0C · mirT1 升温至 260°C保持 5min ；载气氮气；流速 1. 5mL · mirT1 ；
结果表明添加立枯丝核菌菌丝体后，哈次木霉菌发酵液中木霉素的含量与对照 相比提高了 5. 3倍(从0. 0678g/L升高至0. 35934g/L)。
实施例2
立枯丝核菌的培养同实施例1 ；
哈茨木霉菌液体发酵哈茨木霉菌为从枸骨中分离的内生真菌，该菌株已在中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期2006年8月14日，保藏登记号CGMCC No. 1780参见专利申请200710066843. 1的公开文本，公开号为CN101037656。发酵培 养基配方其组分与含量(每升培养基中所含的质量)为立枯丝核菌菌丝体小颗粒90mg， 蛋白胨 30g、牛肉浸膏 10g、葡萄糖 24g、MnCl2 0. Olg、KH2PO4 0. lg、MgSO4 0. 05g ；对照中不 添加立枯丝核菌菌丝体，其余组分与含量同发酵培养基配方；300mL三角瓶装发酵培养基 60mL，用无菌的吸管吸取ImL哈茨木霉菌孢子悬液(IXlO6个/mL)于灭菌的培养瓶中，置 28°C摇床，180r/min，振荡培养108h，发酵液经5000r/min离心lOmin，上清液用于木霉素含 量的测定；
木霉素的检测同实施例1 ；
结果表明添加立枯丝核菌菌丝体后，哈次木霉菌发酵液中木霉素的含量与对照 相比提高了 8. 2倍(从0. 0678g/L升高至0. 55596g/L)。
实施例3
立枯丝核菌的培养同实施例1 ；
哈茨木霉菌液体发酵哈茨木霉菌为从枸骨中分离的内生真菌，该菌株已在中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期2006年8月14日，保藏登记号 CGMCC No. 1780。发酵培养基配方其组分与含量(每升培养基中所含的质量)为立枯丝核 菌菌丝体小颗粒90mg (在哈茨木霉菌液体发酵24小时后添加)，蛋白胨30g、牛肉浸膏10g、 葡萄糖24g、MnCl2 0. Olg、KH2PO4 0. lg、MgSO4 0. 05g ；对照中不添加立枯丝核菌菌丝体，其 余组分与含量同发酵培养基配方；300mL三角瓶装发酵培养基60mL，用无菌的吸管吸取ImL 哈茨木霉菌孢子悬液(IX IO6个/mL)于灭菌的培养瓶中，置28°C摇床，180r/min，振荡培养 108h，发酵液经5000r/min离心lOmin，上清液用于木霉素含量的测定；
木霉素的检测同实施例1 ；
结果表明添加立枯丝核菌菌丝体后，哈次木霉菌发酵液中木霉素的含量与对照 相比提高了 6. 5倍(从0. 0678g/L升高至0. 4407g/L)。
权利要求
立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)菌丝体在提高哈茨木霉菌(Trichodermaharzianum)产木霉素水平中的用途，其特征在于将灭活的立枯丝核菌菌丝体加入到哈茨木霉菌的培养基中，对哈茨木霉菌进行培养发酵，然后对发酵液进行离心；所述哈茨木霉菌为从枸骨中分离的内生真菌，该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期2006年8月14日，保藏登记号CGMCC No.1780。
2.权利要求
1所述的用途，其特征在于所述的培养基中含有蛋白胨、牛肉浸膏、葡萄 糖、MnCl2、KH2P04、MgS04。
3.权利要求
1所述的用途，其特征在于立枯丝核菌的培养过程为培养基为马铃薯葡 萄糖液体培养基，用接种钩挑取少许立枯丝核菌菌丝于灭菌的培养瓶中，摇床振荡培养；然 后将发酵液离心，收集菌丝体，真空冷冻干燥，灭活的菌丝体研磨成小颗粒。
专利摘要
本发明公开了立枯丝核菌菌丝体在提高哈茨木霉菌产木霉素水平中的用途，属于微生物技术领域：
。该发明通过在哈茨木霉菌培养液中添加灭活的立枯丝核菌菌丝体，提高发酵液中木霉素的浓度。
文档编号C12P7/62GKCN101275152 B发布类型授权 专利申请号CN 200810062336
公开日2011年1月12日 申请日期2008年5月19日
发明者俞晓平, 王为民, 申屠旭萍, 董胜张 申请人:中国计量学院导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (1), 非专利引用 (1),