专利名称:利用液体筛选系统进行根癌农杆菌介导香蕉基因转化的方法
技术领域：
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本发明属于生物技术领域：
，具体涉及一种利用液体筛选系统进行根癌农杆菌介导香蕉基因转化的方法。
背景技术:
香蕉属芭蕉科(Musaceae)、芭蕉属(Musa)，是一种重要的热带水果和粮食作物。大多数香蕉栽培品种是通过无性繁殖育种，而通过传统的育种方式对香蕉种质进行改良具有很大的局限性。遗传转化技术的发展为香蕉品种的改良提供了一种有效的手段，而农杆菌介导香蕉胚性细胞悬浮系(embryogenic cell suspensions, ECS)转化方法的应用是香蕉品种改良的一个重大突破。但是由于香蕉不完善的遗传转化体系，限制了香蕉转基因实用化进程，主要原因是香蕉属于单子叶植物，现有技术在利用上述农杆菌介导香蕉胚性细胞悬浮系(ECS)转化方法时，存在香蕉胚性细胞悬浮系(ECS)不易被农杆菌侵染，转化频率很低，ECS胚诱导和萌发率低，即使共培阶段获得了少量的转化悬浮细胞，采用已有的方法直接转到半固体筛选培养基进行抗性筛选，在抗性筛选过程中，由于转化细胞数量少，抗性胚的得率自然低，加 上抗性胚萌发率低，最终很难获得转基因植株，并且在培养过程中褐化现象使获得转基因植株的几率更低。公开号CN101096673的专利公开了一种利用液体共培养系统进行根癌农杆菌介导香蕉基因转化方法，该方法虽然利用液体共培养克服在共培阶段ECS褐化死亡的问题，但是利用该方法还是没有解决转基因植株的得率低的问题。
发明内容
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本发明的目的是针对现有技术中存在的不足，提供了一种能极大提高香蕉转化效率，显著提高转基因植株得率的方法，即利用液体筛选系统进行根癌农杆菌介导香蕉基因转化的方法。
本发明通过以下技术方案予以实现的:
本发明的利用液体筛选系统进行根癌农杆菌介导香蕉基因转化的方法，包括以下步骤:
a)将香蕉ECS与携有含有目的基因的质粒的根癌农杆菌共培养；
b)将共培养后的香蕉ECS，加入到液体筛选培养基中，加入量为每30 40ml液体筛选培养基加入0.1 0.5ml细胞密实体积(packed cell volume,PCV)的ECS，27±2°C，黑暗条件下，转速100 120rpm振荡培养，每7 10天继代一次，连续继代3代以上，获得的抗性香蕉ECS，即为转化的香蕉ECS，所述的继代的方法是，每30 40ml新的液体筛选培养基中加入上一代的悬浮培养物0.1 0.5ml,继续振荡培养；
c)将上一步骤筛选得到的转化的香蕉ECS经体胚诱导、体胚萌发，诱导出苗，再经生根培养，得到转基因香蕉植株。
所述的液体筛选培养基组成为每升培养基中含有Img 2、4_D、lmg生物素、IOOmg谷氨酰胺、IOOmg麦芽提取物、45g鹿糖、20 50mg头孢霉素和相应的筛选抗生素,其余成份为MS基本培养基,PH值为5.3。所述的相应筛选抗生素根据上述含有目的基因质粒上的筛选标记基因而定，其浓度根据香蕉ECS对其敏感性而确定，筛选标记基因可以为潮霉素抗性基因或卡那霉素抗性基因，其中潮霉素抗性基因相应的筛选抗生素为潮霉素，卡那霉素抗性基因相应的筛选抗生素为卡那霉素或G-418。如目的基因的质粒上含有潮霉素标记,那么在液体筛选培养基中添加潮霉素，其浓度为IOmg/1。
本发明所述的将香蕉ECS与携有含有目的基因的质粒的根癌农杆菌共培养优先实施方式如下:将携有含有目的基因的质粒的根癌农杆菌于YEB固体培养基上划线，27土1°C条件下培养，然后挑取单个菌落接种于YEB液体培养基中，27±1°C，100 150rpm振荡培养到菌液OD26tl值为0.5 0.8时，菌液离心去上清后，收集菌体，然后用原菌液20倍体积的香蕉ECS液体培养基重悬菌体，得到工程菌液。取在香蕉ECS液体培养中继代培养7 10天的香蕉ECS，然后将该香蕉ECS静置去上清，以每20 40ml工程菌液中加入Iml细胞密实体积的上述静置去上清的香蕉ECS，27±2°C，黑暗静置I 2小时，然后将其转入共培养，培养条件为27±2°C，黑暗条件下，40 60rpm转速下振荡培养12 24小时，然后将培养物静置去上清，再加入新的与初始共培养时的工程菌液等体积的香蕉ECS液体培养基，提高转速至100 120rpm，继续共培养6 10天。采用这种液体共培养的方式，可以有效的防止共培阶段香蕉ECS褐化死亡的问题。
本发明所述的转化的香蕉ECS经体胚诱导是将筛选得到的转化的香蕉ECS，静置去上清，然后将其均匀铺于体胚诱导培养基上，黑暗条件下，培养2 3个月，每个月更换一次体胚诱导培养基，培养成成熟的抗性体胚。将此成熟的抗性体胚转移至体胚萌发培养基上，光暗交替条件下培养至体胚萌发得到小苗，然后将小苗转移至生根培养基上，光暗交替条件下进行培养，获得转基因香蕉植株。
所述的MS基本培养基为国际通用的培养基，其成分和配制方法参见谭文澄、戴策刚主编，《观赏植物组织培养技术》，北京:中国林业出版社，1991。
所述的YEB培养基(发根农杆菌培养基)的配方为Beef extract (牛肉浸膏)5g/L, Yeastextract (酵母膏)lg/L, Peptone (蛋白腺)5g/L, Sucrose (鹿糖)5g/L, MgSO4.7H2O4g/L，pH 7.4，其固体培养基是在上述培养基的基础上加入常量的琼脂。
所述的香蕉ECS液体培养基组成为每升培养基中含有Img 2、4-D、lmg生物素、IOOmg谷氨酰胺、IOOmg麦芽提取物、45g蔗糖，其余为MS基本培养基，PH值为5.3。
所述的体胚诱导培养基组成为:每升培养基中含有SH培养基中的大量兀素和微量元素及其铁盐、MS培养基的维生素、Img生物素、IOOmg谷氨酰胺、IOOmg麦芽提取物、
0.2mgNAA( a -奈乙酸)、0.1mg Kinetin (激动素)、45g鹿糖、7g琼脂粉、20 50mg头孢霉素，PH 5.8。所述的SH培养基为国际通用的培养基，其成分和配制方法参见利容千、王明全主编，《植物组织培养简明教程》，武汉:武汉大学出版社，2004。
所述的体胚萌发培养基组成为每升体胚萌发培养基含有0.1mg 6-BA(6_节氨基嘌呤)，0.2mg IAA (生长素)，IOOmg谷氨酰胺，IOOmg麦芽提取物，30g蔗糖，7g琼脂粉，其余为MS基本培养基，pH 5.8。
所述生根培养基组成为:每升生根培养基含有IOOmg谷氨酰胺，IOOmg麦芽提取物，30g蔗糖，7g琼脂粉，其余为MS基本培养基，pH 5.8。[0018]本发明通过对香蕉ECS与携有含有目的基因质粒的根癌农杆菌共培养后的香蕉ECS，采用液体筛选培养系统，与现有技术中采用的半固体筛选培养基进行抗性筛选相比，本发明能将共培阶段获得的极少量转化细胞利用液体筛选得到扩大增殖，非转化细胞通过筛选剔除，经过3代以上的筛选，最终获得的香蕉ECS均为转化的香蕉ECS，因此本发明可以通过液体筛选系统实现了转化的香蕉ECS的增殖，为后续的体胚诱导、体胚萌发，诱导出苗，再经生根培养，得到转基因香蕉植株，提供了丰富的转化的香蕉ECS，从而大大地提高了转基因香蕉植株的得率，极大地提高了转化效率。同时建立起的转基因香蕉ECS，可作为进一步的科研材料。
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图1是未经转化的香蕉ECS ；
图2是共培养8天后，培养物经GUS染色后的图，图中箭头所指的蓝色点为转化的香蕉ECS ；
图3是经过液体筛选，筛选到第三代，培养物经GUS染色后的图，图中蓝色点为转化的香蕉ECS ；
图4是利用液体筛选系统获得的转⑶S基因过山香，其中A为获得的转⑶S基因过山香ECS经⑶S染色后的图，B为未经转化的过山香ECS对照；
图5是利用液体筛选系统获得的转⑶S基因巴西蕉，其中C为获得的转⑶S基因巴西蕉ECS经⑶S染色后的图，D为未经转化的巴西蕉ECS对照；
具体实施方式
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实施例1
(I)将携有含有⑶S基因的质粒pCAMBIA1301 (质粒上具有的抗性标记为潮霉素抗性基因)的根癌农杆菌EHA105于YEB固体培养基上划线，28°C条件下培养，然后挑取单个菌落接种于YEB液体培养基中，280C，120rpm振荡培养到菌液OD26tl值为0.5，菌液离心去上清后，用原菌液20倍体积的香蕉ECS液体培养基重悬菌体，得到工程菌液；
(2)取在香蕉ECS液体培养中继代培养7天的贡蕉(Pisang Mas，基因型AA)ECS，静置去上清后，在40ml经步骤(I)获得的工程菌液中加入Iml细胞密实体积(packedcellvolume, PCV)的贡蕉 ECS，27±2°C，黑暗静置 1.5 小时；
(3)然后将其转入共培养，共培养条件为:27±2°C，黑暗条件下，50rpm转速下振荡培养12小时，然后将培养物静置去上清，再加入40ml的新的香蕉ECS液体培养基，然后提高转速至IlOrpm,继续共培养8天。8天后,取Iml培养物⑶S染色,结果可以看到极少量被染成蓝色的转化细胞(如图2所示，箭头所指的部分)，而未经转化的ECS没有染上色(如图1所示)；
(4)共培养完成后，将培养物静置去上清，取0.2ml细胞密实体积的共培养后的贡蕉ECS,加入到40ml液体筛选培养基(筛选培养基添加的抗生素为潮霉素，浓度为10mg/l)中，27±2°C，黑暗条件下，转速IOOrpm振荡培养，每10天继代一次，连续继代3次，获得的贡蕉抗性ECS即为转化的贡蕉ECS。所述的继代方法是取上一代的悬浮培养物0.1ml加入到40ml的新鲜的液体筛选培养基，继续振荡培养。取Iml继代三代后的培养物GUS染色检测，结果可以看到贡蕉ECS全部被染成蓝色，证明获得的ECS即为贡蕉转GUS基因的ECS(如图3所示)；
(5)取筛选培养3代的培养物静置去上清，将其均匀铺于体胚诱导培养基上，黑暗条件下，常规培养3个月，每个月更换一次体胚诱导培养基，获得成熟的抗性体胚；
(6)将成熟的抗性体胚转移至体胚萌发培养基上，光暗交替条件下，常规培养至体胚萌发得到小苗，然后将小苗转移至生根培养基上，光暗交替条件下进行培养即获得完整的贡蕉转GUS基因植株。
从本实施例中及其图1、2、3中可以看出，通过液体筛选系统，可以将经过液体共培后获得的少量转化的贡蕉ECS(如图2中经GUS染色后的蓝色点，即图2中颜色比较深的点，箭头所指的部分)进行增殖，从而获得大量的转化的贡蕉ECS(如图3所示)用于培育转基因的贡蕉。
实施例2
(I)将携有含有⑶S基因的质粒pCAMBIA1301 (质粒上具有的抗性标记为潮霉素抗性基因)的根癌农杆菌EHA105于YEB固体培养基上划线，26°C条件下培养，然后挑取单个菌落接种于YEB液体培养基中，270C，140rpm振荡培养到菌液OD26tl值为0.8，菌液离心去上清后，用原菌液20倍体积的香蕉ECS液体培养基重悬菌体，得到工程菌液；
(2)取在香蕉ECS液体培养中继代培养9天的香蕉主栽品种过山香(Musa SilkCV.Guoshanxiang,基因型AAB) ECS，静置去上清后，在20ml经步骤⑴获得的工程菌液中加入Iml细胞密实体积(packed cell volume,PCV)的过山香ECS，27±2°C，黑暗静置1.8小时；
(3)然后将其转入共培养，共培养条件为:27±2°C，黑暗条件下，45rpm转速下振荡培养24小时，然后将培养物静置去上清，再加入20ml的香蕉ECS液体培养基，提高转速至120rpm，继续共培养10天。10天后，取Iml培养物⑶S染色，结果可以看到极少量被染成蓝色的转化细胞；
(4)共培养完成后，将培养物静置去上清，取0.5ml细胞密实体积的共培养后的ECS，加入到30ml液体筛选培养基(筛选培养基添加抗生素为潮霉素，浓度为10mg/L)中，27±2°C，黑暗条件下，转速120rpm振荡培养，每8天继代一次，连续继代5代，获得的抗性ECS即为转化的过山香ECS。所述的继代的方法是，取上一代的悬浮培养物0.3ml加入到30ml新鲜的液体筛选培养基中，继续振荡培养。取Iml继代5代后的培养物GUS染色检测，结果可以看到ECS全部被染上蓝色(如图4-A所示)，而未经转化的ECS没有染上色(如图4-B所示)，证明获得的转化ECS即为过山香转GUS基因的ECS，由此可见，通过液体筛选系统，本实施例将共培养后获得的少量的转化过山香ECS增殖成大量的转化过山香ECS ;
(5)取筛选培养5代的培养物静置去上清，然后将其均匀铺于体胚诱导培养基上，黑暗条件下，常规培养2个月，每个月更换一次体胚诱导培养基，2个月后，获得成熟的抗性体胚；
(6)将成熟的抗性体胚转移至体胚萌发培养基上，光暗交替条件下，常规培养至体胚萌发得到小苗，然后 将小苗转移至生根培养基上，光暗交替条件下进行培养，获得完整的过山香转⑶S基因植株。
实施例3[0040](I)将携有含有⑶S基因的质粒pCAMBIA1301 (质粒上具有的抗性标记为潮霉素抗性基因)的根癌农杆菌EHA105于YEB固体培养基上划线，27°C条件下培养，然后挑取单个菌落接种于YEB液体培养基中，260C，150rpm振荡培养到菌液OD26tl值为0.6，菌液离心去上清后，用原菌液20倍体积的香蕉ECS液体培养基重悬菌体，得到工程菌液；
(2)取在香蕉ECS液体培养中继代培养8天的香蕉主栽品种巴西蕉(MusaCavendish cv.Baxi，基因型AAA)的ECS，静置去上清后，在30ml经步骤(I)获得的工程菌液中加入Iml细胞密实体积(packed cell volume, PCV)的巴西蕉ECS，27±2°C，黑暗静置I小时。
(3)然后将其转入共培养，共培养条件为:27±2°C，黑暗条件下，60rpm转速下振荡培养18小时，然后将培养物静置去上清，再加入30ml新的香蕉ECS液体培养基，提高转速至120rpm，继续共培养6天。6天后，取Iml培养物GUS染色，结果可以看到极少量被染成蓝色的转化细胞；
(4)共培养完成后，将培养物静置去上清，取0.3ml细胞密实体积的共培养ECS，加入到30ml液体筛选培养基(筛选培养基添加抗生素为卡那霉素，浓度为10mg/L)中，27±2°C，黑暗条件下，转速IlOrpm振荡培养，每7天继代一次，连续继代9代，获得的抗性ECS即为转化的香蕉ECS。所述的继代的方法是，取上一代的悬浮培养物0.5ml加入到40ml新鲜的液体筛选培养基中，继续振荡培养。取Iml继代9代后的培养物GUS染色检测，结果可以看到，ECS全部被染上蓝色(如图5-C所示)，而未经转化的ECS没有染上色(如图5-D所示)。证明本实施例通过液体筛选，将共培养后获得的少量的抗性ECS增殖获得大量的抗性ECS即为巴西蕉转⑶S基因的ECS ；
(5)取筛选培养9代的培养物静置去上清，然后将其均匀铺于体胚诱导培养基上，黑暗培养3个月，每个月更换一次体胚诱导培养基，获得成熟的抗性体胚；
(6)将成熟的抗性体胚转移至体胚萌发培养基上，光暗交替条件下，常规培养至体胚萌发得到小苗，然后将小苗转移至生根培养基上，光暗交替条件下进行培养，获得完整的巴西蕉转⑶S基因植株。
权利要求
1.一种利用液体筛选系统进行根癌农杆菌介导香蕉基因转化的方法，其特征在于包括以下步骤: a)将香蕉ECS与携有含有目的基因的质粒的根癌农杆菌共培养； b)将共培养后的香蕉ECS，加入到液体筛选培养基中，加入量为每30 40ml液体筛选培养基加入0.1 0.5ml细胞密实体积的ECS，27±2°C，黑暗条件下，转速100 120rpm振荡培养，每7 10天继代一次，连续继代3代以上，获得的抗性香蕉ECS，即为转化的香蕉ECS，所述的继代的方法是，每30 40ml新的液体筛选培养基中加入上一代的悬浮培养物0.1 0.5ml，继续振荡培养； c)将转化的香蕉ECS经体胚诱导、体胚萌发，诱导出苗，再经生根培养，得到转基因香蕉植株； 所述的液体筛选培养基组成为每升培养基中含有Img2、4-D、lmg生物素、IOOmg谷氨酰胺、IOOmg麦芽提取物、45g蔗糖、2(T50mg头孢霉素和相应的筛选抗生素，其余成份为MS基本培养基，PH值为5.3，所述的相应的筛选抗生素根据含有上述含有目的基因的质粒上的筛选标记基因而定。
2.根据权利要求
1所述的利用液体筛选系统进行根癌农杆菌介导香蕉基因转化的方法，其特征在于所述的共培养步骤如下: a)将携有含有目的基因的质粒的根癌农杆菌于YEB固体培养基上划线，27土 1°C条件下培养，然后挑取单个菌落接种于YEB液体培养基中，27 ± I °C，100 150rpm振荡培养到菌液OD26tl值为0.5 0.8时，菌液离心去上清后，收集菌体，然后用原菌液20倍体积的香蕉ECS液体培养基重悬菌体，得到工 程菌液； b)取在香蕉ECS液体培养中继代培养7 10天的香蕉ECS,然后将该香蕉ECS静置去上清； c)以每20 40ml步骤a)得到的工程菌液中加入Iml细胞密实体积的步骤b)静置去上清的香蕉ECS，27±2°C，黑暗静置I 2小时，然后将其转入共培养，培养条件为27±2°C，黑暗条件下，40 60rpm转速下振荡培养12 24小时，然后将培养物静置去上清，再加入新的与初始共培养时的工程菌液等体积的香蕉ECS液体培养基，提高转速至100 120rpm，继续共培养6 10天； 所述的香蕉ECS液体培养基组成为每升培养基中含有Img2、4-D、lmg生物素、IOOmg谷氨酰胺、IOOmg麦芽提取物、45g蔗糖，其余为MS基本培养基，pH值为5.3。
3.根据权利要求
1所述的利用液体筛选系统进行根癌农杆菌介导香蕉基因转化的方法，其特征在于所述的筛选标记基因为潮霉素抗性基因，在液体筛选培养基中加入的相应的筛选抗生素为潮霉素。
4.根据权利要求
1所述的利用液体筛选系统进行根癌农杆菌介导香蕉基因转化的方法，其特征在于所述的筛选标记基因为卡那霉素抗性基因，在液体筛选培养基中加入的相应的筛选抗生素为卡那霉素。
5.根据权利要求
1或2所述的利用液体筛选系统进行根癌农杆菌介导香蕉基因转化的方法，其特征在于所述的香蕉为贡蕉(Pisang Mas)、过山香(Musa Silk cv.Guoshanxiang)或巴西蕉(Musa Cavendish cv.Baxi)。
6.根据权利要求
1或2所述的利用液体筛选系统进行根癌农杆菌介导香蕉基因转化的方法，其特征在于所述的质粒为质粒PCAMBIA1301。
专利摘要
本发明公开了一种利用液体筛选系统进行根癌农杆菌介导香蕉基因转化的方法，旨在提供一种能极大提高香蕉转化效率，显著提高转基因植株得率的方法。它包括将香蕉ECS与携有含有目的基因的质粒的根癌农杆菌共培养；将共培养后的香蕉ECS，利用液体筛选系统对其进行筛选、增殖，获得的抗性香蕉ECS，即为转化的香蕉ECS，将筛选得到的转化的香蕉ECS经体胚诱导、体胚萌发，诱导出苗，再经生根培养，得到转基因香蕉植株。本发明可用于香蕉品种的改良。
文档编号A01H4/00GKCN101654684 B发布类型授权 专利申请号CN 200910192122
公开日2013年5月8日 申请日期2009年9月7日
发明者胡春华, 易干军, 魏岳荣, 黄永红 申请人:广东省农业科学院果树研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (2), 非专利引用 (2),