专利名称:一种产甲烷复合菌剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种产甲烷复合菌剂及其制备方法，产甲烷复合菌剂主要用于新建沼气池的启动剂和缺少产甲烷菌的沼气池，可加快新建沼气池产沼气的启动，提高产气量。
背景技术：
目前，据相关文献报导，沼气发酵启动的接种物主要是老沼气池的发酵液、阴沟污泥、池塘污泥、老粪坑污泥等，其中含有大量的产甲烷菌。在大力推广沼气的过程中，普遍存在的一个突出老大难问题是产沼气初始启动时间长，特别是新建沼气池的地方，尤其在北方，很难找到适合的阴沟污泥、塘泥等作为产沼气的接种物，靠自然培养需2-3个月的时间，导致产沼气启动时间长。接种物的数量和质量对厌氧消化产甲烷阶段的运行效果和稳定产气非常重要，如果接种物的量少微生物数量不够，尤其是产甲烷菌少，容易使发酵启动时间增长，产甲烷的速度慢，同时容易造成酸的积累，从而使沼气发酵失败。沼气的产生是一种厌氧发酵过程，甲烷菌作为沼气生产过程中的一类重要的菌群，其研究受到广泛的重视。产甲烷菌是一类能够将无机(H2/C02)或低碳有机物(如甲酸、乙酸等)厌氧发酵转化成甲烷和二氧化碳的古细菌，是厌氧消化产生沼气过程的最后一个成员。甲烷菌作为沼气发酵过程中的关键菌群，其生长代谢状况直接影响到甲烷产生的效率。为此，在《产甲烷细菌及研究方法》一书(赵一章主编，成都科技大学出版社，1997年9月出版，第182、184、 193-195页)中，分别对产甲烷菌的分类学、生态学、生理学、生物化学、显微形态学、分子遗传学、产甲烷菌的研究方法，以及极端环境下的厌氧细菌等都进行了详细阐述，并对现有产甲烷菌的代表种进行了介绍。这些代表种中有的生长及其产甲烷的温度范围和PH范围比较宽，各种菌产甲烷时利用的底物也不同。但由于产甲烷菌生长慢，繁殖时代长，而且属于严格的厌氧菌，我国产甲烷菌株的分离技术及其设备比较落后，高效优质菌株保藏较少，所以一般情况下采用普通的方法很难分离到单株且高效的产甲烷菌。
沼气中的主要成分是甲烷，其生成受到多种环境条件的影响，PH值便是影响此厌氧发酵过程的一个重要因素之一。沼气池中的发酵底物多样，这些底物可被沼气池中的厌氧菌群代谢为甲烷菌利用的甲酸、乙酸、甲胺、压/0)2等多种产物，但沼气池中的甲烷菌种类较为单一，致使产沼气启动较慢或产气量较低。此外，大多数甲烷菌适应的温度范围较窄， 温度的变化影响了产沼气量和启动时间。
利用有机物产沼气其原料来源比较多，主要是一些大分子的有机物，其分解的快慢也影响到沼气的产率。有机物在厌氧微生物的作用下转化为沼气过程主要有水解阶段、 酸化阶段、产氢产乙酸阶段和产甲烷阶段，这四个阶段分别由不同的微生物或其产生的酶来完成。为了加快有机物的分解率(水解和酸化)，提高沼气产率，加入分解有机物的微生物或酶于沼气池中。例如专利公开号为CN101372666A的“一种沼气池用复合微生物菌剂及其制备方法”中，公开了一种利用好氧和兼氧菌荧光假单胞杆菌、蜡质芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、环状芽胞杆菌的发酵液制备成的复合微生物菌剂，将其加入沼气池中，以达到加快有机物的分解率(水解和酸化)促进沼气池的产气量和加快产气速度。专利公告号为CN100513562C的“用于提高沼气发酵产气率的混合水解酶制剂的制备方法“中，利用好氧细菌和真菌进行固体培养法制备成酶制剂。该酶制剂加入沼气池中也是加快有机物的分解率(水解和酸化)提高沼气产率。上述复合微生物菌剂或酶制剂加入沼气池中的时机，只有在沼气池正常产沼气情况下才能加入；如果产沼气不正常情况下或PH偏低情况下加入， 有机物分解(水解和酸化)快，产甲烷阶段利用甲酸、乙酸等底物的产甲烷数量不足，水解和酸化阶段产生的酸会大量积累而造成酸化现象，导致产气少甚至不产气。如果在启动时加入，首先要有质量好而且量较多的接种物，否则有机物分解(水解和酸化)快，产甲烷数量不足也会造成酸化现象，会导致产沼气启动失败。
发明内容
本发明的目的是提供一种产甲烷复合菌剂及其制备方法，它解决了现有沼气池缺少高效的产甲烷菌，导致产沼气初始启动时间长，产气稳定性差的老大难问题，该方法设计合理，采用优化组合的高效菌株、快速繁殖的技术，研制出的高效产甲烷复合菌剂可以显著加快新建沼气池和大换料时的产沼气的启动时间，提高沼气池的产气效率和产气稳定性。
本发明所采用的技术方案是该产甲烷复合菌剂的技术要点是采用保藏在德国菌种保藏中心的编号为DSM-No. 2834的嗜乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcina acetivorans)、编号为 DSM-No. 1535 的甲酸甲烷杆菌(Methanobacterium formicicum)、 编号为 DSM-No. 1125 的嗜树甲烧短杆菌(Methanobrevibacter arboriphilicus)、编号为 DSM-No. 2278 的廷达尔甲烷叶菌(Methanolobus tindarius)、编号为 DSM-No. 6752 的肯氏鬃发甲烷菌(Methanosaeta concilii))作为接种甲烷菌，在厌氧条件下接种于液体甲烷菌培养基，分别单独逐级扩大培养，培养后的所述甲烷菌的菌液按体积比混配在一起，即为液体产甲烷复合菌剂。
上述产甲烷复合菌剂的制备方法是首先将上述经保藏的嗜乙酸甲烷八叠球菌 DSM-No. 2834、甲酸甲烷杆菌DSM-No. 1535、嗜树甲烷短杆菌DSM-No. 1125、廷达尔甲烷叶菌 DSM-No. 2278、肯氏鬃发甲烷菌DSM-No. 6752作为接种甲烷菌，接种于所述液体甲烷菌培养基，然后分别单独逐级扩大培养，每一级在厌氧条件下经35°C培养5-8天，分别制备成所述甲烷菌的菌液，最后将所述甲烷菌的菌液按体积比混配成液体产甲烷复合菌剂；接种于所述液体甲烷菌培养基的单独逐级扩大培养的所述接种甲烷菌，每一级的接种量的体积比为甲烷菌液液体甲烷菌培养基=(0.5-2) (10-30)；所述甲烷菌的菌液混配的体积比为嗜乙酸甲烷八叠球菌的菌液甲酸甲烷杆菌的菌液嗜树甲烷短杆菌的菌液廷达尔甲烷叶菌的菌液肯氏鬃发甲烷菌的菌液=(0.5-4.0) (0.5-3.5) (0.6-2.5) (0.4-2 .0) (0.2-1. ；每升所述液体甲烷菌培养基中含甲酸钠3. 0-5. Og，乙酸钠5. 0-8. Og，甲醇 2. 0-4. Oml，乙醇(95 % ) 3. 0-5. Oml，MgCl2 0. 1-0. 5g, NHCl 0. 5-1. Og,酵母粉 0. 5-1. Og,余量为水。
上述液体产甲烷复合菌剂可以作为接种物加入到作为吸附剂的污泥或猪粪中制备成固体产甲烷复合菌剂，其操作步骤如下将所述液体产甲烷复合菌剂加入到含水率为 70-75%的上述污泥或猪粪中，同时加入上述液体甲烷菌培养基；加入的重量比为液体产甲烷复合菌剂污泥或猪粪液体甲烷菌培养基=(0. 5-3. 5) (6. 0-8. 0) (0. 5-2. 5)， 混合后于35°C培养7-10天，培养为固体产甲烷复合菌剂。
4[0009]上述固体产甲烷复合菌剂也可以作为下一次培养固体产甲烷复合菌剂的接种物， 用上述污泥或猪粪作为吸附剂，同时加入上述液体甲烷菌培养基，加入的重量比为固体产甲烷复合菌剂污泥或猪粪液体甲烷菌培养基=(0. 5-4. 0) (6. 5-8. 5) (0. 5-2. 5)， 经混合后于35°C培养8-12天，培养为固体产甲烷复合菌剂。
本发明具有的优点及积极效果是由于本发明方法设计合理，采用优化组合的高效菌株、快速繁殖的技术，所以研制出了高效产甲烷复合菌剂。该产甲烷复合菌剂中的每一株产甲烷菌，具有如下的生物学、生理学特性
BfAftit · (Methanosarcina acetivorans)1. 5 ~ 2. 5um 白勺f 规则球形，形成小孢囊，革兰氏染色阳性，不运动，菌落淡黄，生长温度10 50°C，pH5. 5 9.0。利用乙酸盐、甲醇、甲胺、二甲胺产甲烷。
甲酸甲烷杆菌(Methanobacterium formicicum)长杆状，宽 0. 4 0. 8um，长度可变，菌落灰白色，生长温度37 45°C，最适pH6. 6 7. 8，利用H2/C02、甲酸产甲烷。
Bf 丰对甲烧短杆菌(Methanobrevibacter arboriphilicus)短而细杆菌， 0. 5-0. 7X1. 8-3. 5um，单生，成对或成链，革兰氏阳性，菌落小，淡黄色圆形，利用压/0)2、甲酸产甲烷。生长温度37 39°C，pH6. 9 7. 4。
廷达尔甲烧叶菌(Methanolobus tindarius)直径为0. 8 1. 25um,不规则球形， 单生有时形成松散聚集体，菌落绿白色，生长温度10 45°C，生长pH5. 8 8. 0，利用甲醇、 甲胺产甲烷。
肯氏鬃发甲烷菌(Methanosaeta concilii)杆状，液体培养成丝状，0. 8X 1. 8 2um，革兰氏阴性，振荡时断裂成杆状。pH6.8 8.2，生长温度30 45°〇.只利用乙酸产甲焼。
由此可见，本发明可以充分利用以上优质产甲烷菌株的组合配伍，对沼气发酵过程中产生的这些中间产物作为甲烷菌的底物进行产甲烷。因在沼气发酵过程中产沼气的 PH范围一般在6. 5-8. 5，如果低于此范围产沼气少且比较慢；特别是在新建池和已有沼气池大换料时的启动过程中，如果PH低于6. 5启动会很慢。另外，现在大部分的沼气池，特别是农村户用沼气池产沼气的温度均靠自然温度，温度的变化对产气量影响也大，对新建池产沼气启动时会影响启动时间。因此，本发明优选了甲烷菌生长PH范围和温度范围适应比较宽的产甲烷菌株，如嗜乙酸甲烷八叠球菌的生长PH范围在5. 5-9. 0，生长温度范围在 10-50°C，廷达尔甲烷叶菌的生长pH范围为5. 5-8. 0，嗜树甲烷短杆菌和廷达尔甲烷叶菌的生长温度范围在10-45°C，这既达到了多菌互补的效果、又起到了快速繁殖的作用。本发明解决了现有沼气池缺少高效的产甲烷菌，导致产沼气初始启动时间长，产气稳定性差的老大难问题。该产甲烷复合菌剂可作为新建沼气池和已有沼气池大换料时的产沼气启动的接种物，特别是难以找到产沼气接种物的地方，加快新建沼气池和已有沼气池大换料时的产沼气的启动时间；它还可添加到沼气发酵的PH偏低的沼气池中，增加产甲烷阶段的产甲烷菌的数量，提高沼气池的产气效率和产气稳定性。
具体实施方式
以下结合实施方式对本发明进行详细说明。该产甲烷复合菌剂是根据《产甲烷细菌及研究方法》一书介绍的现有产甲烷菌的代表种中，通过不同优质高产甲烷菌株及相关功能菌群的优化组合，选择出生长及其产甲烷的温度范围和PH范围比较宽的菌株， 通过引进德国此类优质的产甲烷菌株，利用快速繁殖技术在较短的时间内培育出足够的产甲烷接种物。具体作法是采用从德国购来的保藏在德国菌种保藏中心(DSMZ)的优选菌，即编号为DSM-No. 2834的嗜乙酸甲烧八叠球菌(Methanosarcina acetivorans)、编号为 DSM-No. 1535 的甲酸甲烷杆菌(Methanobacterium formicicum)、编号为 DSM-No. 1125 的嗜树甲烧短杆菌(Methanobrevibacter arboriphilicus)、编号为 DSM-No. 2278 的廷达尔甲烷叶菌(Methanolobus tindarius)、编号为DSM-No. 6752的肯氏鬃发甲烷菌 (Methanosaetaconcilii))作为接种甲烷菌，在厌氧条件下接种于预先制备的液体甲烷菌培养基，分别单独按厌氧管一厌氧瓶一厌氧罐的步骤逐级扩大培养，培养后的上述甲烷菌的各菌液按体积比混配在一起，即成为具有利用底物较宽、适应产沼气的PH范围和温度范围较大的液体的产甲烷复合菌剂。
根据实际需要，上述产甲烷复合菌剂的制备方法可制备液体产甲烷复合菌剂和固体产甲烷复合菌剂，其具体操作步骤如下
制备液体产甲烷复合菌剂
步骤一、制备液体甲烷菌培养基
液体甲烷菌培养基的组分及其含量如下，按比例秤取制备每升培养基所需要的原料为甲酸钠 3. 0-5. Og,乙酸钠 5. 0-8. Og,甲醇 2. 0-4. Oml,乙醇(95% )3. 0-5. Oml, MgCl2 0. 1-0. 5g,NHCl 0. 5-1. Og，酵母粉0.5-1. Og，余量为水。把上述原料配制好，将培养基煮沸 15分钟后，通入无氧高纯氮气防止空气进入，在无氧条件下分装于厌氧管、厌氧瓶或厌氧罐中，盖上密封盖，并于121°C灭菌30分钟后，冷却培养基至室温备用。
步骤二、制备甲烷菌的菌液
首先将上述经保藏的嗜乙酸甲烷八叠球菌DSM-No. 2834、甲酸甲烷杆菌 DSM-No. 1535、嗜树甲烷短杆菌DSM-No. 1125、廷达尔甲烷叶菌DSM-No. 2278、肯氏鬃发甲烷菌DSM-No. 6752作为接种甲烷菌，接种于备用的液体甲烷菌培养基。
然后分别单独逐级扩大培养，即按厌氧管(1级)一厌氧瓶0级)一厌氧罐进行逐级扩大，每一级的接种量的体积比为甲烷菌液液体甲烷菌培养基= (0.5-2) (10-30)。每一级在厌氧条件下经35°C培养5-8天，即分别制备成甲烷菌的菌液。
最后将上述各甲烷菌的菌液，按以下体积比进行混配嗜乙酸甲烷八叠球菌的菌液甲酸甲烷杆菌的菌液嗜树甲烷短杆菌的菌液廷达尔甲烷叶菌的菌液肯氏鬃发甲烷菌的菌液=(0. 5-4. 0) (0.5-3.5) (0.6-2.5) (0.4-2.0) (0. 2-1. 5)，即为液体产甲烷复合菌剂。
制备固体产甲烷复合菌剂
由于液体产甲烷复合菌剂不便于运输，且保藏时间较短，所以可以将上述液体产甲烷复合菌剂作为接种物加入到吸附剂，制备成固体产甲烷复合菌剂。吸附剂采用既廉价， 又能作为产甲烷复合菌剂的部分营养物，并对产甲烷复合菌剂中的甲烷菌有增殖作用的污水处理厂含水率为70-75%的污泥或猪粪。其具体操作步骤如下
将上述液体产甲烷复合菌剂加入到含水率为70-75%的污泥或猪粪中，同时加入液体甲烷菌培养基；加入的重量比为液体产甲烷复合菌剂污泥或猪粪液体甲烷菌培养基=(0.5-3.5) (6.0-8.0) (0.5-2. 5)，混合后于35°C培养7-10天，即培养为固体产甲烷复合菌剂。
因将上述各甲烷菌分别培养成菌液，再混合成液体产甲烷复合菌剂，操作比较麻烦，而且时间较长，故可以将上述固体产甲烷复合菌剂的一部分(约20% )作为下一次培养固体产甲烷复合菌剂的接种物，用污泥或猪粪作为吸附剂，同时加入液体甲烷菌培养基，加入的重量比为固体产甲烷复合菌剂污泥或猪粪液体甲烷菌培养基= (0.5-4.0) (6.5-8.5) (0. 5-2. 5)，经混合后于35°C培养8_12天，即培养为固体产甲烧复合菌剂。
上述固体产甲烷复合菌剂的培养过程中要收集产生的沼气。培养后的固体产甲烷复合菌剂按下一次要配制的固体产甲烷复合菌剂的总量，留出约20%作为接种物，其余的进行密封包装。
实施例一
制备液体产甲烷复合菌剂
制备方法一
液体甲烷菌培养基的组分及其含量(g或ml/升)甲酸钠3g，乙酸钠8g，甲醇anl， 乙醇(95% ) 5ml，MgCl 0. lg, NHCl lg，酵母粉 0. 5g，加水至 1 升。
把所需原料配制好并加入所需水量，将液体甲烷菌培养基煮沸15分钟后通入无氧高纯氮气防止空气进入，在无氧条件下分装于厌氧管和厌氧瓶中，盖上密封盖并于121°C 灭菌30分钟。灭过菌的液体甲烷菌培养基冷却后按上述经保藏的甲烷菌液液体甲烷菌培养基=0.5 10的体积比对每株菌单独接种于装有液体甲烷菌培养基厌氧试管中，于 35°C培养8天，该厌氧试管培养的菌液为1级种。然后按甲烷菌液液体甲烷菌培养基= 0.5 10的体积比将1级种分别接入装有液体甲烷菌培养基厌氧瓶中，于35°C培养5天，该厌氧瓶中培养的培养液为2级种。用厌氧罐培养的液体甲烷菌培养基组分及含量同前，每株菌也分别单独培养。不同的是先将所需水加热沸腾5分钟，加入液体甲烷菌培养基继续煮沸15分钟，然后按装厌氧试管和厌氧瓶的液体甲烷菌培养基方法装入厌氧罐中并密封， 121°C灭30分钟。液体甲烷菌培养基冷却后按甲烷菌液培养基=0.5 10的体积比对每株菌单独将厌氧瓶中培养的2级种接种于厌氧罐中，于35°C培养8天后，成为各接种甲烷菌的菌液。
将分别培养的甲烷菌的菌液按体积比混合，即嗜乙酸甲烷八叠球菌液 甲酸甲烷杆菌液嗜树甲烷短杆菌液廷达尔甲烷叶菌液肯氏鬃毛甲烷菌液= 0. 5 3. 5 2. 5 0.4 0. 2，混合成液体产甲烷复合菌剂。
制备方法二
液体甲烷菌培养基的原料及其含量(g或ml/升)甲酸钠5g，乙酸钠5g，甲醇細1， 乙醇(95% ) :3ml，MgCl 0. 3g, NHCl 0. 8g，酵母粉0. 8g，加水至1升。厌氧试管、厌氧瓶及厌氧罐培养的液体甲烷菌培养基制备方法及培养条件与方法一相同，不同之处是接种量和培养时间。接种到厌氧试管中的接种量为上述经保藏的甲烷菌液液体甲烷菌培养基= 1 20 (体积比)，于35°C培养6天；从厌氧试管接种到厌氧瓶的接种量为甲烷菌液液体甲烷菌培养基=1.5 30 (体积比)，于35°C培养7天；从厌氧瓶接种到厌氧罐的接种量为甲烷菌液液体甲烷菌培养基=1.5 30(体积比)，于35°C培养6天，成为各甲烷菌的菌液。
将分别培养的甲烷菌的菌液按体积比混合，即嗜乙酸甲烷八叠球菌液 甲酸甲烷杆菌液嗜树甲烷短杆菌液廷达尔甲烷叶菌液肯氏鬃毛甲烷菌液= 4.0 0.5 1.5 2.0 2.0，混合成液体产甲烷复合菌剂。
制备方法三
液体甲烷菌培养基的原料及其含量(g或ml/升)甲酸钠4g，乙酸钠6g，甲醇:3ml， 乙醇(95% )4ml,MgCl 0. 5g，NHCl 1. 0g，酵母粉1. 0g，加水至1升。厌氧试管、厌氧瓶及厌氧罐培养的液体甲烷菌培养基制备方法及培养条件与方法一相同，不同之处也是接种量和培养时间。接种到厌氧试管中的接种量为上述经保藏的甲烷菌液液体甲烷菌培养基= 2.0 30 (体积比)，于35°C培养6天；从厌氧试管接种到厌氧瓶的接种量为甲烷菌液液体甲烷菌培养基=2.0 20 (体积比)，于35°C培养5天；从厌氧瓶接种到厌氧罐的接种量为甲烷菌液液体甲烷菌培养基=2.0 20(体积比)，于35°C培养5天，成为各甲烷菌的菌液。
将分别培养的甲烷菌的菌液按体积比混合，即嗜乙酸甲烷八叠球菌液 甲酸甲烷杆菌液嗜树甲烷短杆菌液廷达尔甲烷叶菌液肯氏鬃毛甲烷菌液= 2.0 1.5 0.6 1.0 1.0，混合成液体产甲烷复合菌剂。
制备方法四
液体甲烷菌培养基的原料及其含量(g或ml/升)甲酸钠5g，乙酸钠5g，甲醇:3ml， 乙醇(95% )4ml, MgCl 0. 5g，NHCl 1. 0g，酵母粉1. 0g，加水至1升。厌氧试管、厌氧瓶及厌氧罐培养的液体甲烷菌培养基制备方法及培养条件与方法一相同，不同之处是接种量和培养时间。接种到厌氧试管中的接种量为上述经保藏的甲烷菌液液体甲烷菌培养基= 2.0 20 (体积比)，于35°C培养5天；从厌氧试管接种到厌氧瓶的接种量为甲烷菌液液体甲烷菌培养基=1.5 30 (体积比)，于35°C培养8天；从厌氧瓶接种到厌氧罐的接种量为甲烷菌液液体甲烷菌培养基=2.0 20(体积比)，于35°C培养7天，成为各甲烷菌的菌液。
将分别培养的甲烷菌的菌液按体积比混合，即嗜乙酸甲烷八叠球菌液 甲酸甲烷杆菌液嗜树甲烷短杆菌液廷达尔甲烷叶菌液肯氏鬃毛甲烷菌液= 2.0 2.0 1.5 1.0 1.0，混合成液体产甲烷复合菌剂。
实施例二制备固体产甲烷复合菌剂
制备方法一
将液体产甲烷复合菌剂加入到含水率为70-75%的污泥中并加入液体甲烷菌培养基，其比例(重量比)为液体产甲烷复合菌剂含水率为70-75%的污泥液体甲烷菌培养基=0.5 6.0 2. 5，混合后在厌氧条件下35°C培养，培养过程中收集产生的沼气，培养10天即为固体产甲烷复合菌剂。用80%的该固体产甲烷复合菌剂进行包装，剩余的约 20%作为下一次培养固体产甲烷复合菌剂的接种物；其比例(重量比)为固体产甲烷复合菌剂含水率为70-75%的污泥液体甲烷菌培养基=4 8. 5 0. 5，混合后在厌氧条件下35°C培养，培养过程中收集产生的沼气，培养8天即为固体产甲烷复合菌剂。
制备方法二
将液体产甲烷复合菌剂加入到含水率为70-75%的污泥中并加入液体甲烷菌培养基，其比例(重量比)为液体产甲烷复合菌剂含水率为70-75%的污泥液体甲烷菌培养基=3.5 8.0 0.5，混合后在厌氧条件下35°C培养，培养过程中收集产生的沼气，培养 8天即为固体产甲烷复合菌剂。用80%的该固体产甲烷复合菌剂进行包装，剩余的约20% 作为培养固体产甲烷复合菌剂的接种物；其比例(重量比)为固体产甲烷复合菌剂含水率为70-75%的污泥液体甲烷菌培养基=0.5 6.5 2. 5，混合后在厌氧条件下35°C培养，培养过程中收集产生的沼气，培养12天即为固体产甲烷复合菌剂。
制备方法三
将液体产甲烷复合菌剂加入到含水率为70-75%的污泥中并加入液体甲烷菌培养基，其比例(重量比)为液体产甲烷复合菌剂含水率为70-75%的污泥液体甲烷菌培养基=2.0 7.0 1.5，混合后在厌氧条件下35°C培养，培养过程中收集产生的沼气，培养 7天即为固体产甲烷复合菌剂。用80%的该固体产甲烷复合菌剂进行包装，剩余的约20% 作为培养固体产甲烷复合菌剂的接种物；其比例(重量比)为固体产甲烷复合菌剂含水率为70-75%的污泥液体甲烷菌培养基=2. 5 7.5 1. 5，混合后在厌氧条件下35°C培养，培养过程中收集产生的沼气，培养10天即为固体产甲烷复合菌剂。
制备方法四
将液体产甲烷复合菌剂加入到含水率为75%的猪粪中并加入液体甲烷菌培养基， 其比例(重量比)为液体产甲烷复合菌剂含水率为70-75%的猪粪液体甲烷菌培养基 =1.5 7.5 1.0，混合后在厌氧条件下35°C培养，培养过程中收集产生的沼气，培养9 天即为固体产甲烷复合菌剂。用80%的该固体产甲烷复合菌剂进行包装，剩余的约20%作为培养固体产甲烷复合菌剂的接种物；其比例(重量比)为固体产甲烷复合菌剂含水率为75%的猪粪液体甲烷菌培养基=3.0 7.0 1.0，混合后在厌氧条件下35°C培养，培养过程中收集产生的沼气，培养9天即为固体产甲烷复合菌剂。
实施例三固体产甲烷复合菌剂的效果试验
(1)用接种厌氧污泥作为对照
按固体产甲烷复合菌剂Ts含量为5%的猪粪=1 9的接种量(体积比)将固体产甲烷复合菌剂接入I1S含量为5%的猪粪中，另用厌氧污泥Ts含量为5%的猪粪= 1 9的接种量(体积比)作为对照，分别于20°C、50°C和常温条件下培养。在20°C条件下，第15天后接产甲烷复合菌剂的产气量是对照的2. 5倍；在50°C条件下，第2天接产甲烷复合菌剂的产气量是对照的2倍，第7天后接产甲烷复合菌剂的产气量上升很快，第10天产气量达到最大值。而对照第16天产气量才开始上升，第19天才达到最大值，在20天内接产甲烷复合菌剂的总产气量是对照的2. 7倍；在常温条件下，三周内接产甲烷复合菌剂的总产气量是对照的1. 6倍
(2)用无接种物作为对照
按固体产甲烷复合菌剂Ts为5%的猪粪=1 49、1 19、1 9的接种量(体积比)分别将固体产甲烷复合菌剂接入Ts为5%的猪粪中，并用用无接种物作为对照，分于 20°C、50°C条件下培养。在20°C条件下，接种量为1 49、1 19、1 9时分别于第8天、5 天、2天开始产气，第14天甲烷浓度分别达到46%、51(%、58.9(%，而对照第14天开始产气， 甲烷浓度才4.3%。在50°C条下，接种量为1 49、1 19、1 9时均在第2天开始产气， 第7天甲烷浓度分别达到32^^39^^51. 2%;而对照第4天开始产气，甲烷浓度才13. 7%。
权利要求
1.一种产甲烷复合菌剂，其特征是采用保藏在德国菌种保藏中心的编号为DSM-No. 2834的嗜乙酸甲烧八叠球菌(Methanosarcina acetivorans)、编号为 DSM-No. 1535 的甲酸甲烷杆菌(Methanobacterium formicicum)、编号为 DSM-No. 1125 的嗜树甲烧短杆菌(Methanobrevibacter arboriphilicus)、编号为 DSM-No. 2278 的廷达尔甲烷叶菌(Methanolobus tindarius)和编号为DSM-No. 6752的肯氏鬃发甲烷菌 (Methanosaetaconcilii))作为接种甲烷菌，在厌氧条件下接种于液体甲烷菌培养基，分别单独逐级扩大培养，培养后的所述甲烷菌的菌液按体积比混配在一起，即为液体的产甲烷复合菌剂。
2.根据权利要求
1所述的产甲烷复合菌剂的制备方法，其特征是首先将所述经保藏的嗜乙酸甲烷八叠球菌DSM-No. 2834、甲酸甲烷杆菌DSM-No. 1535、嗜树甲烷短杆菌 DSM-No. 1125、廷达尔甲烷叶菌DSM-No. 2278、肯氏鬃发甲烷菌DSM-No. 6752作为接种甲烷菌，接种于液体甲烷菌培养基，然后分别单独逐级扩大培养，每一级在厌氧条件下经35°C培养5-8天，分别制备成所述甲烷菌的菌液，最后将所述甲烷菌的菌液按体积比混配成液体产甲烷复合菌剂；接种于所述液体甲烷菌培养基的单独逐级扩大培养的所述甲烷菌，每一级的接种量的体积比为甲烷菌液液体甲烷菌培养基=(0.5-2) (10-30)；所述甲烷菌的菌液混配的体积比为嗜乙酸甲烷八叠球菌的菌液甲酸甲烷杆菌的菌液嗜树甲烷短杆菌的菌液廷达尔甲烷叶菌的菌液肯氏鬃发甲烷菌的菌液=(0. 5-4. 0) (0. 5-3. 5)(0.6-2.5) (0.4-2.0) (0.2-1.5)；每升所述液体甲烷菌培养基中含甲酸钠3. 0-5. Og， 乙酸钠 5. 0-8. Og,甲醇 2. 0-4. 0ml，95% 的乙醇 3. 0-5. Oml,MgCl2O. 1-0. 5g，NHCl 0. 5-1. Og, 酵母粉0. 5-1. Og，余量为水。
3.根据权利要求
2所述的产甲烷复合菌剂的制备方法，其特征是将所述液体产甲烷复合菌剂作为接种物加入到作为吸附剂的污泥或猪粪中制备成固体产甲烷复合菌剂，其操作步骤如下将所述液体产甲烷复合菌剂加入到含水率为70-75%的所述污泥或猪粪中， 同时加入所述液体甲烷菌培养基；加入的重量比为液体产甲烷复合菌剂污泥或猪粪 液体甲烷菌培养基=(0.5-3.5) (6.0-8.0) (0.5-2. 5)，混合后于35°C培养7-10天， 培养为固体产甲烷复合菌剂。
4.根据权利要求
3所述的产甲烷复合菌剂的制备方法，其特征是将所述固体产甲烷复合菌剂作为下一次培养固体产甲烷复合菌剂的接种物，用所述污泥或猪粪作为吸附剂， 同时加入所述液体甲烷菌培养基，加入的重量比为固体产甲烷复合菌剂污泥或猪粪 液体甲烷菌培养基=(0.5-4.0) (6.5-8.5) (0. 5-2. 5)，经混合后于35°C培养8_12天， 培养为固体产甲烷复合菌剂。
专利摘要
一种产甲烷复合菌剂及其制备方法，解决了现有沼气池缺少高效的产甲烷菌，导致产沼气初始启动时间长，产气稳定性差的老大难问题，它采用保藏在德国菌种保藏中心的嗜乙酸甲烷八叠球菌DSM-No.2834、甲酸甲烷杆菌DSM-No.1535、嗜树甲烷短杆菌DSM-No.1125、廷达尔甲烷叶菌DSM-No.2278、肯氏鬃发甲烷菌DSM-No.6752在厌氧条件下接种于液体甲烷菌培养基，分别单独逐级扩大培养，培养后的甲烷菌的菌液按体积比混配在一起，即为液体产甲烷复合菌剂；还可将液体产甲烷复合菌剂制备成固体产甲烷复合菌剂。该方法设计合理，采用优化组合的高效菌株、快速繁殖的技术，研制出的高效产甲烷复合菌剂可以显著加快新建沼气池和大换料时的产沼气的启动时间，提高沼气池的产气效率和产气稳定性。
文档编号C12N1/20GKCN101705199 B发布类型授权 专利申请号CN 200910187435
公开日2012年7月11日 申请日期2009年9月18日
发明者刘克鑫, 刘晓风, 廖银章, 张海涛, 胡亚东, 袁月祥, 闫志英, 颜开 申请人:中国科学院成都生物研究所, 北京合百意可再生能源技术有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan